ELECTROFORESIS DE PROTEINAS.

La acrilamida es un producto químico empleado en la síntesis de poliacrilamidas. Se

presenta como un polvo blanco cristalino. Es soluble en agua, etanol, metanol, dimetil éter y
acetona; no es soluble en heptano ni benceno. Se polimeriza rápidamente al alcanzar el
punto de fusión o al ser expuesto a la luz UV. La acrilamida sólida es estable a temperatura
ambiente, pero puede polimerizarse violentamente cuando se mezcla o expone a agentes
oxidantes. Se emplea fundamentalmente como floculante en el tratamiento del agua de
suministro a las poblaciones y en el procesado de la pulpa de papel. Se emplea también para
retirar sólidos en suspensión de las aguas residuales de la industria antes de su vertido,
reutilización o eliminación. Sin embargo existe un gran número de otras posibles
aplicaciones, como aditivo en cosméticos, acondicionadores de suelos, procesado de
minerales y en la formulación de agentes selladores para diques, túneles y alcantarillados. El
hábito de fumar es una fuente conocida de exposición a la acrilamida. La acrilamida es
considerada un agente tóxico para la reproducción, con propiedades tanto mutagénicas
como carcinogénicas; está clasificada como un pro-cancerígeno en humanos (clase 2A).
Adicionalmente, la exposición a bajos niveles de acrilamida causa daños al sistema nervioso.
En abril del año 2002 un grupo de investigadores suecos demostró la presencia de
considerables niveles de acrilamida en ciertos alimentos ricos en almidón que eran
procesados a altas temperaturas (más de 120 ºC).

El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente que desnaturaliza a las proteínas.

Haciendo ésto se consigue que éstas, sometidas a una corriente eléctrica, migren de
acuerdo a su tamaño, ya que el SDS se une creando una densidad de carga que es igual por
unidad de superficie independientemente de la proteína en cuestión.
El peroxidisultato amónico o persulfato amónico (NH4)2S2O8 es uno de los oxidantes más
fuertes, su acción lenta puede ser catalizada con ion plata. Se utiliza para la oxidación de
manganeso (II) a permanganato y para la oxidación del carbono en muestras de aceros.
El CBB (de Coomassie Brilliant Blue, azul brillante de Coomassie) es el colorante para
proteínas más popular. Es de tipo aniónico, y se une a proteínas de modo inespecífico. Su
estructura es predominantemente no polar, por lo que habitualmente se usa (al 0,025%) en
disolución con metanol (40%) y acético (7%). Las proteínas del gel se fijan gracias al ácido
acético y al mismo tiempo se tiñen. El colorante en exceso que se incorpora en el gel se
puede eliminar destiñendo con una disolución de composición idéntica excepto por el
colorante. Las proteínas se detectan como bandas azules contra un fondo claro. Puesto que
el SDS también es aniónico, puede interferir con el proceso de tinción. Por tanto, se
recomienda un gran volumen de disolución de tinción, aproximadamente diez veces el
volumen del gel.
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz gelatinosa.
Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un
agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con
estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que
variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su
neurotoxocidad.

Electroforesis en geles de gradientes.

El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de
archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del
poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En
un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro
impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migración
apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles
es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, además de
incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentración fija.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas
embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa
usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.
OBJETIVOS:
·Apreciar a la electroforesis como un método para el estudio del tamaño y de la conformación
de macromoléculas.
· Analizar las muestras del aislamiento de caseína mediante el método de electroforesis.
·Aprender sobre la migración de una particula sobre un campo eléctrico.
·Obtener el peso molecular de la caseína aislada de la leche.

Procedimiento
Precaución: la acrilamida es un compuesto químico cancerígeno, mientras que la
poliacrilamida no lo es. Para la preparación de los geles es necesario el uso de guantes de
látex.
A. Preparación de geles
1. Mezclar en dos tubos los reactivos para la preparación del gel separador y
espaciador en las cantidades antes descritas con excepción del persulfato de
amonio, que se agrega en el momento antes de chorrear los geles.
2. Eliminar el aire de la mezcla mediante creación de vacío (el aire inhibe la reacción de
polimerización) por 15 minutos y a temperatura ambiente.
3. Ensamblar el molde para el gel utilizando vidrios de 0.75 mm de espesor,
4. Agregar a la mezcla correspondiente para el gel separador, 50 μl de persulfato
de amonio. Con una pipeta para 10 ml, colocada en una de las esquinas
superiores de los vidrios del molde para el gel, añadir un total de 3.5 ml de esta
mezcla al molde. Inmediatamente agregar 200 μl de isopropanol sobre el gel para evitar el
contacto con el aire. Esta mezcla gelifica aproximadamente en 30 a 45 minutos. Forma de
chorrear el gel separador en una cámara Mini Protean Bio-Rad .
5. Una vez que gelificó la mezcla correspondiente al gel separador, se descarta
el isopropanol inclinando el molde ensamblado. Luego de esto se le agrega albuffer
espaciador 50 μl de persulfato de amonio. Se chorrea de la misma manera que el buffer
separador. La cantidad necesaria es aquella que se añade hasta que se rebalse del espacio
entre los vidrios. Se coloca inmediatamente el peine
para 0.75 mm. Esta mezcla gelifica aproximadamente en 30 40 minutos. Una vez gelificado
se procede a quitar el peine deslizándolo suavemente y se lava delicadamente con agua
destilada para eliminar algunos residuos no gelificados.
B. Preparación de muestras
1. Colocar en un tubo 5 μl de la muestra y 5 μl de azul de mercaptoeptanol.Tapar bien el tubo
y colocarlo en baño de agua en ebullición durante 10 minutos. Al cabo de este tiempo se
detiene la reacción colocando el tubo en hielo.
2. Cargar las muestras en los pozos del gel (10 μl), con una micropipeta y puntas largas
descartables para geles. Se utiliza la misma punta para cargar todas las muestras haciendo
varios lavados de la misma con agua bidestilada entre cada muestra. Es fundamental realizar
este paso sin que haya contaminaciones cruzadas entre los distintos pozos. Esto se evita
depositando las muestras despacio pero de forma continua en los pozos. También se debe
incluir el marcador de PM en uno de los carriles laterales, como referencia.
3. Llenar la cámara con el amortiguador de corrida: 180 ml en el tanque inferior y 120 ml en
el superior. Colocar el gel en la cámara y correr las muestras a 200 V (voltaje constante)
hasta que el azul de bromofenol llegue casi al borde inferior del gel (aproximadamente 60
min).
4. Separar los vidrios que contienen el gel con cuidado. Sacar el gel y eliminar la
parte del gel espaciador cortándolo con una hoja de bisturí. Teñir el gel con colorante
Coomassie, sumergiéndolo durante 1 hora con agitación constante. Luego se elimina el
exceso del colorante con varios cambios de decolorante.
Resultados:

El contenido de caseína de la leche representa el 80% de proteínas de la leche. . Las

fracciones principales son la caseína alfa (s1) y alfa (s2)-caseína, beta-caseína, y
kappa caseína. La característica distintiva de todas las caseínas es su baja
solubilidad a un pH de 4.6. El factor común es que la composición de las caseínas son
proteínas conjugadas, la mayoría con el grupo fosfato (s) esterificados a los residuos
de serina. Estos grupos fosfato son importantes para la estructura de las micelas de
caseína. el vinculante de las caseínas individuales de calcio es proporcional al
contenido de fosfato.
La conformación de las caseínas es muy similar a la de desnaturalizar las proteínas
globulares. El elevado número de residuos de prolina en caseínas causas particulares de
flexión de la cadena proteica e inhibe la formación de cerca de pic nic, ordenó a las
estructuras secundarias. Además, la falta de cuentas de la estructura terciaria de la
estabilidad de las caseínas contra la desnaturalización de calor debido a que hay muy poca
estructura para desarrollarse. Sin una estructura superior hay una exposición importante de
los residuos hidrofóbicos. Esto da lugar a reacciones fuerte asociación de las caseínas y los
hace insolubles en agua.
alfa (s1)-caseína: (peso molecular 23 000 199; residuos, 17 de residuos de prolina)

alfa (s2)-caseína: (peso molecular 25 000, 207 residuos, 10 prolinas)

ß-caseína: (peso molecular 24 000, 209 residuos, 35 prolinas)

kappa-caseína: (peso molecular 19 000, 169 residuos, 20 prolinas)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

FACULTAD DE CIENCIAS
 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

BERROCAL HERNÁNDEZ PORFIRIO

DAMAZO HERNÁNDEZ ANGEL ARMANDO
HERNÁNDEZ ZEPEDA MARÍA GPE
JORDÁN LOMAS CARLOS GUILLERMO
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR I
23/03/2011