CSIC/UAB Proteomics Facility Tinción con plata

TINCIÓN CON PLATA

- Todas las disoluciones se preparan en H2O milli-Q y deben almacenarse a 4ºC.

- Todos lo recipientes que se utilizan hay que lavarlos previamente H2O milli-Q y etanol.
- La incubación con las diferentes soluciones se realizará con los recipientes cerrados.
- En cada paso es IMPRESCINDIBLE vaciar la trampa de la bomba de vacio. Recordar que la
bomba de vació va conectada a DOS trampas que se colocan en serie para evitar que los
disolventes entren en la bomba. NUNCA debe haber líquido en la segunda trampa.
- La eliminación de los líquidos se realizará con la bomba de vacio, dentro de la campana de
gases (encendida¡¡).
- En todos los pasos la potencia del agitador debe ponerse al MÍNIMO.
- Cada una de las soluciones se DEBE añadir utilizando la probeta que está marcada para
ese reactivo. NUNCA utilizar una probeta marcada para otro reactivo.

1. Fijación: 40% Etanol, 10% Acido acético

30 minutos-overnight

. Antes de sacar los geles de los vidrios donde se realiza la electroforesis, añadir a cada uno de los
recipientes donde se va a realizar la tinción 200 ml de solución de fijación.
. Sacar los geles uno a uno e introducirlos en el recipiente que contiene la solución de fijación de
forma que queden totalmente estirados.
. Agitar durante 30 minutos. Si se va a dejar overninght los recipientes se colocan en la cámara fría
sin agitación y a la mañana siguiente se agitan 10-20 minutos mientras se atemperan.
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.

2. Sensibilización: 30% Etanol

Na2S2O3 0.2% w/v
Acetato sódico 6.8% w/v
30 minutos

. Añadir la solución de sensibilización en el recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel.
. Agitar durante 30 minutos.
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.

3. Lavado: Agua milli-Q

3 veces x 5 minutos

. Añadir el agua en el recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel.

. Agitar durante 5 minutos .
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.
. Repetir este paso dos veces más.

4. Tinción: AgNO3 2.5 g/l

20 minutos

. Añadir la solución de plata el recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel. Recordar
que la solución de tinción se debe preparar el mismo día que se va a realizar la tinción y en un
recipiente opaco o tapado con papel de plata.
. Agitar durante 20 minutos.
. Eliminar el líquido, dentro de la campana de gases (encendida), con la bomba de vacío. Desechar
este residuo en el contenedor de plástico dedicado a guardar los deshechos de nitrato de plata.

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5. Lavado: Agua milli-Q

2 veces x 1 minuto

. Añadir el agua en el recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel.

. Agitar durante 1 minutos .
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.
. Repetir este paso una vezs más.

6. Velado: Na2CO3 2.5% w/v

HCOH
2-5 minutos

. Añadir la solución de velado (recordar que el formaldehido se debe añadir unos minutos antes de
añadirlo al recipiente¡¡) recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel.
. Agitar durante los minutos necesarios para revelar el gel.
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.

7. Stop: EDTA-Na2·2H2O 1.46% w/v

10 minutos

. Añadir la solución de parada en el recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel.
. Agitar durante 10 minutos .
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.

9. Lavado: Agua milli-Q

3 veces x 5 minutos

. Añadir el agua en el recipiente de tinción sin verterlo directamente sobre el gel.

. Agitar durante 5 minutos .
. Eliminar el líquido dentro de la campana de gases (encendida) con la bomba de vacío.
. Repetir este paso dos veces más.

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PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DE PLATA

- Cada reactivo se debe preparar utilizando el material marcado para ese reactivo y guardar
en los recipientes también marcados.
- Nunca introducir la espátula o la punta de la pipeta en el pote o botella de reactivo: verter
siempre en un recipiente intermedio para evitar contaminaciones.

1.- Solución de fijación: 40% Etanol, 10% Acido acético

Para 2 L:
. 800 ml Etanol
. 1000 ml H2O milli-Q
. 200 ml Acido acético glacial

2.- Solución de sensibilización: 30% Etanol, Na2S2O3 0.2% w/v , Acetato sódico 6.8% w/v (68 g/l)
Para 2 L:
· 600 ml Etanol
· 4 g Na2S2O3
· 136 g Acetato sódico
. Disolver y enrasar en H2O a 2000 ml

3.- Solución de tinción: AgNO3 2.5 g/l

Para 500 ml: Preparar el mismo día que se va a utilizar y en una botella opaca o envuelta en
papel de plata.
. 1.25 g AgNO3
. Disolver en H2O y enrasar a 500ml.

4. Solución de velado SIN formaldehido (recordar que el formaldehido se DEBE añadir unos
minutos antes de añadir la solución al recipiente de tinción): Na2CO3 2.5% w/v (25g/l)
Para 2 L:
. 50 g Na2CO3
. Disolver en H2O agitando vigorosamente y enrasar a 2000 ml.

5. Solución de velado CON formaldehido: Na2CO3 2.5% w/v (25g/l), 37% w/v HCOH
Para 500 ml:
. 500 ml solucion preparada en el apartado 5.
. 200 µl HCOH (formaldehido) 37% w/v

6. Solución de parada: EDTA-Na2·2H2O 1.46% w/v (14.6 g/l)

Para 2 L:
. 29.2 g EDTA-Na2·2H2O
. Disolver en H2O y enrasar a 2000 ml.

Reactivos:
- Etanol
- Acido acético glacial 100%. Merck ref. 1.00066.0250
- Na2S2O3.5H2O: Sodium thiosulphate pentahydrate. Merck ref. 1.06516.0500
- Na2H3C2O2·3H2O: Acetato sódico. SIGMA ref. S-8625
- AgNO3: Silver Nitrate. Merck ref. 1.01512.0025
- Na2CO3: Sodium carbonate. SIGMA ref. S-7795.
- HCOH: Formaldehido en solución mínimo 37%. SIGMA ref. F8775
- EDTA-Na2·2H2O: Ethylendiamine-tetracetic acid. SIGMA ref. E5513.