DESFIBRINACIÓN DE PLASMA SANGUÍNEO PARA USO EN PRUEBAS

SEROLÓGICAS PARA LA SÍFILIS

Sifilítica plasma puede rescatado de las donaciones de sangre desechados y convertida

en suero por defibrination. Sesenta y nueve unidades de plasma fueron tratadas con una
solución madre de 100 U de trombina / ml en cloruro de calcio de 1 M y, a
continuación, con una solución al 10% (wt/vol) de caolín. Concentraciones de
fibrinógeno detectadas en muestras de plasma inicial oscilaban entre 94 y 4,970 mg/litro
(media, 2,532 mg/litro) para obtener muestras que fueron reactivas por la reagina
plasmática rápida de la prueba de la tarjeta círculo (RPR) y de 314 a 2.742 mg/litro
(significan 1.528 mg/litro) para las muestras que no se reactiva por el RPR. Las
muestras tratadas no mostraban medible fibrinógeno restantes después del proceso de
defibrination. En la nontreponemal RPR para sífilis, 86% de las muestras de plasma
tratados conservan el mismo título de extremo como de la muestra inicial de plasma.
Cuando se utilizó la prueba de aglutinación de partículas de pasivo de Treponema
pallidum, 98% conservan la misma reactividad. En el inmunoensayo de enzima Captia
sífilis-G, el 89% de las muestras tratadas no demostrado ningún cambio en el índice de
reactividad y en la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes, 96%
no mostró ninguna reducción en la fluorescencia. Sueros humanos que contiene
anticuerpos contra la sífilis se utilizan en los centros para el control y prevención para la
preparación de los controles de referencia o como muestras para ensayos de aptitud.
Búsqueda de sueros reactivos se está convirtiendo en más difícil debido a la
disminución general de los casos de sífilis en los Estados Unidos. La disminución de la
disponibilidad de estos sueros puede aliviarse salvando plasma y convirtiéndolo en
suero.

En la publicación de la Asociación Americana de salud pública A Manual de pruebas de

sífilis (3), los centros para el control y la prevención recomienda el uso de suero en el
laboratorio de investigación de enfermedades venéreas (VDRL) prueba. Suero debe ser
calentado a 56 ° C durante 30 minutos anterior a la prueba para inactivar el
complemento (2), ya que la presencia de complemento en el suero recién dibujado hace
menos reactivo. El calentamiento de plasma a la misma temperatura y en el mismo
periodo de tiempo mejora la formación de fibrina (7), procesamiento de plasma no aptos
para esta prueba. En los centros para el control y la prevención, sueros humanos que son
seropositivos para la sífilis se utilizan en la preparación de los controles de referencia de
serología o como muestras para ensayos de aptitud. Sin embargo, es cada vez más
difícil encontrar sueros reactivos debido a la disminución general en el número de casos
de sífilis en este país (4). Unos 12,6 millones de unidades de sangre entera son donados
en los Estados Unidos cada año. Después de que la sangre se extrae, está probado para
el grupo ABO y Rh tipo. También se realizan pruebas de detección para pruebas de
donantes de infección con el virus de la hepatitis B y C, los tipos de virus de
inmunodeficiencia humana 1 y 2, los virus linfotrópico T humano tipos I y II y sífilis
(6). Toda la sangre para transfusiones se recoge dentro de una bolsa que contiene una
solución de anticoagulante-conservante destinada a prevenir la coagulación y para
mantener la viabilidad celular durante el almacenamiento. Anticoagulantes comúnmente
utilizados son citrato-fosfato-dextrosa, citrato-fosfato-dextrosa-dextrosa y citrato-
fosfato-dextrosa-adenina. Citrato impide la activación de la cascada de coagulación por
quelante de calcio, por lo tanto inhibiendo los varios pasos de dependiente de calcio en
la coagulación. Sangre almacenada a 1 a 6 ° C durante 21 días retiene 15 a 30% de los
factores de coagulación calor lábiles V y la VIII y la mayoría de los factores estables II,
VII, IX y X (6). Plasma derivado de las donaciones de sangre se encuentra ser reactiva
para las enfermedades infecciosas descargada según para la alimentación y buenas
prácticas la administración de las manufactureras reglamentos. Sin embargo, las
unidades de plasma que son reactivas para sífilis pero reactivo de otras enfermedades
potencialmente pueden utilizarse para la fabricación de sífilis referencia reactivos o
muestras de la prueba de aptitud. Plasma se puede convertir a suero por el método de
defibrination. Factores de coagulación presentes en el plasma pueden activarse a fibrina
de forma, con la adición de cloruro de calcio y protrombina (1). Trombina rompe
fibrinógeno al formulario fibrina monómeros, que polimerizar, creando un coágulo
estable. Fibrinógeno es un dímero simétrico con tres pares de cadenas polipeptídicas (a,
b y g) vinculados por enlaces disulfuro. Fibrinógeno soluble se convierte en fibrina
cuando trombina rompe arginina-glicina bonos en los extremos de amino terminal de la
una y las cadenas de b, eliminando negativamente cargado fibropeptides A y B. Los
monómeros de fibrina restantes están vinculados por enlaces de hidrógeno para formar
polímeros insolubles (5). El propósito de este estudio era demostrar que plasma sifilítica
derivado de donaciones de sangre entera puede rescatado y, a continuación, se
convierten en suero para el fin de realizar controles de referencia y muestras de la
prueba de aptitud.

THROMBIN STOCK SOLUTION.

Una acción de solución de trabajo de la trombina (Sigma, St. Louis, Missouri) a 100 U /
ml en cloruro de calcio 1 M (Fisher Scientific, Suwanee, Georgia) Se preparó,
dispensados en alícuotas de 5 ml, y se almacenan a -20 ° C hasta su uso

PLASMA SAMPLE TREATMENT.

Sesenta y nueve unidades de plasma de donantes diferentes se obtuvieron del centro de

sangre de Nueva York (Nueva York, N.Y.), del Milenio Biotech, Inc. (FT. Lauderdale,
FLA.) y productos biológicos de Nueva York (Southampton, Nueva York). Estas
unidades fueron tomaría y se constató que el reactivo o reactivo en las pruebas
serológicas para la sífilis. Diez mililitros de cada muestra de plasma fue colocada en un
tubo de centrífuga de final de la ronda de 15 ml (Internacional de Nunc Nalgene,
Rochester, Nueva York), y tubos fueron incubados en un baño de agua a 37 ° C durante
30 minutos. Cien μl de solución madre de trombina fue agregado a cada muestra;
muestras fueron incubadas durante 10 minutos adicionales y permitidas para coagular a
temperatura ambiente durante 1 h (1). Después de la coagulación, las muestras se
congelaron a −20 ° C durante 2 a 4 horas. Las muestras fueron descongeladas, a
continuación, a temperatura ambiente y 1 g de caolín, que había sido lavado con agua
destilada y, a continuación, secado, se añadió a cada muestra; después, la suspensión fue
mezclada continuamente durante 4 horas con la ayuda de barras magnéticas. Las
muestras fueron incubadas, a continuación, a 2 a 8 ° C durante la noche, con la
constante agitación suave a aproximadamente 27 rpm en una plataforma de sobremesa
de rocker. El propósito del caolín es servir como un medio de aclaración. Las muestras
fueron centrifuga a 1,935 g × durante 45 minutos, y el supernate fue decantado en otro
conjunto de tubos de centrífuga. El plasma Tratado, a continuación, se ha filtrado a
través de las membranas de filtro de 0,45 y 0,22 μm-poro-tamaño (Ciencias de Gelman,
Ann Arbor, Mich.).

SAMPLE TESTING.
Cada uno de los 69 tratados muestras de plasma y su correspondiente muestra sin tratar
fueron probadas para contenido de fibrinógeno en la prueba de inmunodifusión radial
(The Binding Site, Birmingham, Reino Unido), la rápida reagina círculo tarjeta de
prueba de plasma (RPR), la prueba de tinción de doble de absorción de anticuerpos
treponémicos fluorescentes (FTA-ABS DS), el ensayo de aglutinación de partículas de
pasivo de Treponema pallidum (TP-PA) (Fujirebio de América, Fairfield, N.J.) (3) y el
inmunoensayo de sífilis de Captia-G (EIA) (Trinity Biotech, Bray, Irlanda). Muestras de
plasma tratados fueron probadas por el examen VDRL. La eficacia de la conversión de
plasma fue medida mediante la comparación de las reducciones en las concentraciones
de fibrinógeno en las muestras de plasma tratadas a aquellos en las muestras no tratadas.
En las muestras no tratadas, las concentraciones de fibrinógeno variaban de 94 a 4,970
mg/litro (media, 2,532 mg/litro) para las muestras de reactivos para el RPR y de 314 a
2.742 mg/litro (media, 1.528 mg/litro) para las muestras de RPR-reactivo. Las muestras
tratadas no mostró ninguna cantidad mensurable de fibrinógeno restantes después del
proceso de defibrination. No hubo ninguna pérdida significativa de reactividad cuando
muestras de plasma Tratado muestras fueron comparadas con el control de línea de base
de plasma por la nontreponemal RPR o las pruebas treponémicos. De las 48 muestras de
plasma que se reactiva por el RPR, 41 (85%) mantuvo el mismo título de extremo
cuantitativos después del tratamiento mientras que 7 (15%) mostraron una reducción de
una dilución de duplicación (cuadro 1). En el análisis de TP-PA, 55 de 56 muestras
tratadas (98%) conservan la misma reactividad después de tratamiento y de la muestra
sólo 1 (1,7%) mostraron una reducción en la reactividad de 1 + a negativo. De 56
muestras de plasma que se constató que reactiva por el EIA, 50 (89%) ha demostrado
ningún cambio en la reactividad mientras 6 (11%) mostraron una reducción en el índice
de anticuerpos que refleja un cambio de reactividad a destacablemente. Entre los
ejemplos de 54 que fueron reactivos por el DS de FTA-ABS, 52 (96%) no mostraron
ninguna reducción en fluorescencia, mientras que 2 (4%) mostraron una reducción en la
fluorescencia de 1 + negativas (cuadro 2). Tratados muestras de plasma fueron también
calor inactivado en 56 ° C durante 30 minutos y sometidos a la prueba VDRL. De las
muestras de 69 46 eran reactiva y 23 eran reactivo. No hubo pruebas de muestras de
falsos positivos resultantes del tratamiento térmico

CONCLUDING REMARKS.

En este estudio, hemos demostrado que plasma puede con éxito convertirse en suero por
la adición de 1 ml de trombina (100 U/ml) en cloruro de calcio de 1 M hasta 100 ml de
plasma, seguido de un tratamiento de caolín de 10% (wt/vol). El plasma convertido así
obtenido es libre de formación de fibrina incluso después de almacenamiento
prolongado en −20 o 2 a 8 ° C. Convertir plasma especímenes podrían utilizarse en la
preparación de muestras de pruebas de aptitud y como controles de referencia de
serología para sífilis. Sangre entera recogida con anticoagulante tiene una relación de
dilución aproximado de 2,7 ml de plasma a 1 ml de anticoagulante; esta relación de
dilución, además en el procedimiento de defibrination, es responsable de cierta pérdida
en la reactividad del plasma convertido. La pérdida de reactividad sólo tiene sentida si
el contenido de anticuerpos de la muestra se reduce a un punto que afecta el título de
anticuerpos deseado. Con las muestras de plasma tratados 69, en 85% de las muestras
en el nontreponemal RPR no se observó ninguna reducción en el título de anticuerpos y
ningún cambio en la reactividad fue observada por el 98% de las muestras en el TP-PA,
el 89% de aquellos en el EIA y 96% de los de la DS de FTA-ABS. Ninguna de las
muestras de plasma tratados reactivo se convirtió en reactiva como resultado del
tratamiento de defibrination. No se recomienda el uso del plasma en la diapositiva
VDRL de prueba para la sífilis porque la inactivación de calor a 56 ° C durante 30
minutos mejora la formación de fibrina y filamentos de fibrina atrapar los liposomas
presentes en la emulsión de antígeno VDRL. Dado que la prueba VDRL de diapositiva
requiere que la muestra con la emulsión añadida girarse a 180 rpm para 4 min, incluso
cantidades diminutas de agregado de fibrina, produciendo resultados falsos positivos
para las muestras de reactivo. En estos estudios, la trombina, el cloruro de calcio y el
tratamiento de caolín retirEun fibrina del sistema a tal grado que no se obtuvieron
reacciones de falsos positivos. El esfuerzo de eliminación de la sífilis se ha traducido en
un descenso general en el número de casos de sífilis en los Estados Unidos, desde
134,255 en 1990 a 31,575 en el año 2000. Por lo tanto, se ha vuelto más difícil obtener
sueros de moderado a alto-título de las personas con sífilis con el propósito de
referencia de fabricación controla y muestras de prueba de aptitud se utilizan para la
garantía de calidad en las pruebas de sífilis. La disminución de la disponibilidad de
estos sueros puede aliviarse salvando plasma de las donaciones de sangre que
normalmente sería ser descartado debido a seroreactivity de sífilis y, a continuación,
convertir el plasma en suero para ser utilizados en las pruebas de treponémicos y
nontreponemal para la sífilis.