NORMAS ISO PARA

DETERMINACIONES MICROBIOLÓGICAS DE AGUAS

Directiva Europea 98/83/CE

Relativa a la calidad de las aguas

destinadas al consumo humano

 ANEXO III: 1. PARÁMETROS PARA
LOS QUE SE ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS

Los siguientes principios se dan ya sea como

referencia, en los casos en que se da un método
CEN/ISO, o como guía, en espera de la posible
adopción futura de nuevos métodos internacionales
CEN/ISO.
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESPECIFICADOS

• Bacterias coliformes y Escherichia coli

UNE-EN ISO 9308-1: 2001

• Enterococos UNE-EN ISO 7899-2: 2001

• Pseudomonas aeruginosa prEN ISO 12780

• Enumeración de microorganismos cultivables

a 22ºC y 37ºC UNE-EN ISO 6222: 1999

• Clostridium perfringens (incluidas las esporas) método

descrito en la Directiva.
 ISO 7899-2: ENTEROCOCOS INTESTINALES
FILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN:
• Aguas de bebida
• Piscinas
• Aguas desinfectadas

Grandes volúmenes de agua con bajo contenido de enterococos

EXCEPCIONES: Alto contenido en materia en suspensión

y microorganismos interferentes

DEFINICIÓN: Bacterias capaces de reducir el TTC a 36± 2ºC

e hidrolizar esculina a 44± 0,5ºC
INTRODUCCIÓN

MEDIOS DE CULTIVO: Slanetz y Bartley

Bilis Esculina agar: confirmación 100%
prEN - ISO 12780: PSEUDOMONAS AERUGINOSA
FILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN:
• Aguas embotelladas
• Piscinas
• Aguas de red

DEFINICIÓN: Microorganismos capaces de crecer con

cetrimida a 36± 2ºC y:
- Producen piocianina o
- Oxidasa +, Fluorescentes a 360nm y amonio de acetamida
Confirmación: subcultivo

MEDIOS DE CULTIVO: Cetrimida-Nalidixico

King’s B
Caldo acetamida
ISO 6222: RECUENTO DE MICROORGANISMOS
CULTIVABLES

DIRECTIVA: 22ºC Y 37ºC, NORMA 22± 2ºC Y 36± 2ºC

CAMPO DE APLICACIÓN: Indicado para medir la eficacia

operativa del proceso de tratamiento del agua de red.

DEFINICIÓN: Todas las bacterias aerobias, levaduras y

hongos capaces de formar colonias en el medio especificado
bajo las condiciones descritas

MEDIO DE CULTIVO y MÉTODO: ¿ADECUADOS?

Agar extracto de levadura
Siembra en profundidad: 36± 2ºC; 44± 4 horas
22± 2ºC; 68± 2 horas
 VALIDACIÓN DE MÉTODOS: DEFINICIÓN

Confirmación mediante examen y, la aportación de

evidencias objetivas que demuestren
el cumplimiento de ciertos requisitos para
el uso específico previsto
(ISO 17025)
ISO 9308-1: COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI
FILTRACIÓN DE MEMBRANA

CAMPO DE APLICACIÓN: Método poco selectivo específico

para bacterias lesionadas.
• Aguas de bebida desinfectadas
• Aguas de bebida con bajo contenido bacteriano
DOS MÉTODOS: Estándar para coliformes y E.coli
Rápido para E.coli

DEFINICIONES:
- Bacterias Lactosa +: Capaces de crecer en medio lactosado
selectivo diferencial a 36± 2ºC y producir ácido
- Coliformes: Lactosa + que son oxidasa -
- E.coli:
1.- Coliformes que producen indol del triptófano a 44± 0,5ºC
2.- Bacterias resistentes a la bilis que producen indol
del triptófano a 44 ± 0,5ºC
 FILTRACIÓN: 100 ml ó 250 ml

Lactosa TTC-Tergitol TSA: Triptona-soja-agar

36± 2ºC, 21± 3 h ó 44± 4h 36± 2ºC 4-5 h
Alternativa: otra membrana
44± 0,5ºC, 21± 3 h Alternativa: Doble capa

TBA: Triptona-Bilis-Agar
Lactosa +: colonias amarillas 44±0,5ºC 19-20 h
≥ 10 colonias

Agar no selectivo: 36± 2ºC, 21± 2 h

Confirmación del 100%
Indol
Oxidasa Indol de triptófano
44±0,5ºC , 21± 3 h
 ISO WD 6461-2: CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
FILTRACIÓN DE MEMBRANA

ANTECEDENTES

¿QUÉ MÉTODO DESARROLLAR PARA LA NUEVA NORMA?

ESTUDIO COMPARATIVO
Alemania 60 laboratorios

• El TSC (Triptona-Sulfito-cicloserina) recupera 15% más que m-CP

• El m-CP resulta afectado por el tipo y lote de membranas
• El revelado del m-CP resulta tóxico para bacterias y personas
• El TSC resulta afectado por la frescura del medio(≤ 1 día)
• Las pruebas de confirmación con mayores índices de S y E:
•Nitratos: +
•Movilidad : -
•Lactosa: +
•Gelatinasa: +
ISO WD 6461-2: CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
FILTRACIÓN DE MEMBRANA

DIRECTIVA: incluidas esporas, NORMA: pasteurización

CAMPO DE APLICACIÓN:
• Todo tipo de aguas que no contengan materias
particuladas o coloidales

DEFINICIÓN:
Presuntivos: colonias negras a marrón-amarillas en
TSC a 44±1ºC
Confirmadas: Presuntivas inmóviles, reducen nitratos
fermentan lactosa y licúan gelatina

MÉTODO: Pasteurización a 60 ±2ºC, 15 min

 ANEXO III: 1. PARÁMETROS PARA
LOS QUE SE ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS

Los Estados miembros podrán emplear métodos

alternativos: Art.7. 5: Siempre que se demuestre que
los resultados son al menos tan fiables como los de
referencia. Se facilitará a la Comisión toda
la información del método y su equivalencia
 ISO 17994: “Criterios para el establecimiento
de la equivalencia entre métodos microbiológicos”

Dos métodos son equivalentes, cuando la diferencia

relativa media de sus recuentos confirmados no
difiere significativamente de cero y tanto el límite
inferior como el superior del intervalo de confianza
al 95% de la media no superan un nivel máximo de
desviación aceptable D (10)
 RD % = 100[ Ln( A) − Ln( B ) ]

∑ (x − x)
n 2
1 n S
IC(95%)= X ± 2
i
X = ∑ xi
ni= S= i=1
n
1 n −1
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN

NO DIFERENTES

—D 0 +D
≤ LI ≤ ≤ LS ≤
y

DIFERENTES

—D 0 +D
LS < ó < LI
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN

INDIFERENTES: Estadísticamente
diferentes, pero la diferencia es tan pequeña que
no tiene significación microbiológica

—D 0
< LI y LS <
ó
0 +D
< LI y LS <
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN

NO CONCLUYENTE

—D 0
LI < < LS
y

0 +D
LI < y < LS
 Método propio Método de referencia

Muestra 1 89 112
Muestra 2 82 58
Muestra 3 123 137
Muestra 4 87 82
Muestra 5 109 103
Muestra 6 84 117
Muestra 7 65 66
Muestra 8 111 70
Muestra 9 92 93
Muestra 10 115 111
Media = 2,63
Desviación estándar = 23,76
Límite inferior del IC95% = -12,39
Límite superior del IC 95% = 17,66

Conclusión: Resultados son no concluyentes,

LI<0 y LS>+D,
Se requiere un número mayor de muestras

n=C.S2= 0,1600x23,762= 90 muestras

 VALIDACIÓN - REVALIDACIÓN
CONTROL DE CALIDAD MÉTODOS CUANTITATIVOS

• INTERNO:

- Positivo: Mat. Referencia en matriz neg. (Recuperación)

- Negativo: Mat. Referencia en matriz neg. (Selectividad)
- Control de replicados: tres (Precisión y límites de recuento)
- Ident. de colonias diana y no-diana: (Tasa de confirmación)

• EXTERNO:

Muestras con diferentes niveles (Recuperación)