Guia prático de Microbiologia

Meio Liquido

Culturas líquidas de E.coli, podem geralmente fazer-se crescer no meio LB (Luria-Bertani). Há diferentes
meios LB, com diferentes composições. Fórmulas diferentes contêm diferentes concentrações de NaCl e
dão origem a quantidades variadas de DNA plasmídico. Para obter grande quantidade de DNA plasmídico
a composição LB recomendada é a seguinte:

Composição do meio LB por litro

Triptona 10 g
Extracto de
5g
levedura
NaCl 10 g

Tabela 1: Composição do meio LB por litro

Preparação do meio LB

Para preparar um litro de meio LB, adicione 10g de NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extracto de levedura a
950 mL de água destilada e desionizada, e agite até se dissolver. Ajuste o volume da solução para um litro
com água destilada e desionizada. Decante para pequenos reservatórios e esterilize na autoclave.

Nota 1: é aconselhável autoclavar o meio líquido em vários frascos pequenos, do que apenas num frasco
grande, para evitar uma possível contaminação de todo o meio. Depois de autoclavar, não utilizar o meio
durante 24 h para garantir que está devidamente esterilizado e livre de contaminação por microorganismos.

Esterilização do meio

Esterilize o meio líquido ou sólido na autoclave, utilizando uma pressão e um período de tempo adequado
ao tipo de meio, tamanho do frasco, e tipo de autoclave.

Nota 2: Encha apenas ¾ da capacidade dos frascos com meio, e solte as rolhas antes de autoclavar para
evitar que o meio a ferver verta para fora. Aperte as rolhas quando o meio estiver frio (por volta dos 40ºC)
para o manter completamente estéril.

Nota 3: Os antibióticos e os nutrientes como os aminoácidos são inactivados pelas altas temperaturas de
uma autoclave. Eles devem ser adicionados ao meio frio e autoclavado a partir de soluções stock
adequadas.

Meio sólido
 Estirpes de E. coli podem geralmente ser riscadas e armazenadas em placas de petri com meio LB que
contenham 1,5% de agar e o antibiótico apropriado.

Preparação: prepare o meio LB de acordo com a composição dada na tabela acima. Mesmo antes de
autoclavar, adicione 15 gramas de agar por litro e misture. Depois de autoclavar, agite o meio suavemente
para distribuir o agar dissolvido por toda a solução. Tenha o cuidado para que o líquido quente não verta
para fora enquanto o agita.

Nota 4: Deixe arrefecer o meio de agar autoclavado até aos 50ºC, antes de adicionar antibióticos e nutrientes
sensíveis ao calor. Misture muito bem.

Nota 5: Faça o plaqueamento das placas com o meio numa câmara de fluxo laminar, ou numa superfície
limpa, próximo de uma chama. Use 30-35 mL de meio para placas de petri de 90mm de diâmetro (1 litro de
meio dá para cerca de 30 placas).

Nota 6: Após o plaqueamento, quaisquer bolhas de ar podem ser removidas passando rapidamente uma
chama perto da superfície da placa. Não se deve demorar com a chama pois esta pode destruir os
antibióticos.

Seque as placas directamente quer após a solidificação ou logo antes de usar removendo as tampas e
colocando as placas na câmara de fluxo laminar durante 1 hora. Em alternativa, se não houver câmara de
fluxo laminar, as placas podem ser secas com as tampas ligeiramente abertas numa estufa a 37ºC durante
30 minutos, ou deixe-as invertidas com as tampas à temperatura ambiente durante 2-3 dias.

Nota 7: Guarde as placas invertidas a 4ºC, protegidas da luz, para preservar os antibióticos sensíveis à luz.
Não guarde as placas por períodos superiores a 3 meses, já que os antibióticos podem degradar-se.

Antibióticos

Estirpes bacterianas que contêm plasmídios ou genes com marcadores selectivos de antibióticos devem
sempre ser postas num meio de cultura liquido ou sólido que contenha o agente selectivo. Os antibióticos
devem ser adicionados ao meio apenas quando este estiver a uma temperatura abaixo dos 50ºC.

Antibiótico Soluções stock Concentrações a utilizar (diluidas)

Concentração Armazenamento
Ampicilina
50 mg/mL em água -20ºC 100 ug/mL (1/500)
Clorofenical
34 mg/mL em etanol -20ºC 170 ug/mL (1/200)
Kanamycin
10 mg/mL em água -20ºC 50 ug/mL (1/200)
Streptomycin
10 mg /mL em água -20ºC 50 ug/mL (1/200)
Tetraciclina
5 mg/mL em etanol -20ºC 50 ug/mL (1/100)

Tabela 2: concentrações de antibióticos frequentemente utilizados

Culturas “Stab”
As estirpes de E.coli podem ser mantidas durante um ano em cultura “Stab”. As culturas “Stab” são
utilizadas para transportar bactérias de uns laboratórios para outros.

Preparação das culturas “Stab”:

1. Preparar e autoclavar o meio LB como descrito anteriormente,
tendo em conta que se pretende um meio LB que contenha 0,7% de agar.
2. Arrefecer o meio LB até cerca dos 50ºC, e adicionar o
antibiótico apropriado. Enquanto o agar ainda estiver líquido,
adicionar 1 mL de agar para um tubo de 2 mL, em condições estéreis,
e deixar solidificar.
3. Com uma ansa esterilizada, retirar uma única colónia
de bactérias de uma placa de petri e introduzir a ansa no fundo do frasco
com agar diversas vezes (figura 1).
4. Incubar o tubo a 37ºC durante 8 a 12 h deixando a tampa
do tubo ligeiramente aberta.
5. Após incubação, retirar o tubo, apertar muito bem a tampa, Figura 1- Inoculação de uma cultura “Stab”
e guardar no escuro a uma temperatura de 4ºC. Fonte da imagem: www.qiagen.com

Placas de agar

Placas com riscado de bactérias podem ser seladas com Parafilme, e guardadas invertidas a 4ºC durante
várias semanas.
O riscado de bactérias deve ser sempre feito em placas que contenham o antibiótico apropriado.

Para se obter colónias de bactérias bem isoladas, riscar uma placa de agar como se descreve de seguida:

1. Passar uma ansa de inoculação pela chama, e arrefece-la

numa placa esterilizada que contem agar, mas que não vá ser utilizada.
2. Utilizando a ansa, proceder ao riscado de bactéria
(a partir de uma cultura stock em glicerol, cultura “Stab” ou de uma
colónia isolada de outra placa) a partir de uma canto da placa de
agar fresco.
3. Passar a ansa pela chama mais uma vez e arrefece-la.
Passar a ansa sobre o primeiro riscado e riscar de novo a partir
de um canto fresco da placa.
4. Repetir o processo até formar o padrão visível na figura 2. Figura 2: Riscado de bactérias em
placas de agar
5. Incubar a placa invertida a 37ºC durante 12 a 24 h, até as colónias
Fonte da imagem: www.qiagen.com
se desenvolverem.