Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
1.1 BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE – DEFINIŢIE.
OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI
Biotehnologia este o ştiinţă complexă, ce se
caracterizează prin utilizarea integrată a biochimiei,
microbiologiei, biologiei celulare şi a ingineriei
genetice. (fig. 1.1).
Figura 1.1. Biotehnologia o ştiinţă complexă
Denumirea de biotehnologie provine de la cuvintele
greceşti:
-„Bios” care înseamnă viaţă,
-„Tehnikos” care înseamnă tehnici şi
-„Logos” care însemnă „studiu al”.
Biotehnologia este aplicată in diverse domenii, cum ar
fi: agricultură, industria alimentară, producţie
industrială, mediu şi medicină.
Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea
industrială a diferitelor materii prime cu ajutorul
microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor
agenţi biologici (microorganime, enzime) adăugaţi în
scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor
procese tehnologice.
Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria
alimentară. În fapt, industria alimentară este o
biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare
sunt produse biologice şi prin urmare conservarea lor
până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor şi
legumelor) sau până la industrializare (cazul tuturor
produselor agroalimentare) implică controlul activităţii
enzimatice proprii ţesuturilor vegetale şi animale sau a
celor elaborate de microflora de contaminare.
Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt
esenţiale în transformările pe care le oferă produsele
agroalimentare: maturarea fructelor şi legumelor,
cerealelor şi făinurilor sau diferitelor produse alimentare
pe bază de cereale germinate, maturarea brânzeturilor,
maturarea cărnii.
Enzimele pot avea însă şi rol deteriorativ cu implicaţii în
modificarea caracteristicilor senzoriale şi a valorii
nutritive a materiilor prime agroalimentare până la
prelucrarea termică a acestora.
De asemenea, rolul microorganismelor este hotărâtor,
unele dintre ele având acţiune dăunătoare, altele având
rol esenţial în obţinerea unor produse alimentare datorită
acţiunii lor fermentative: produse lactate acide,
brânzeturi, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude,
alimente fermentate din cereale şi leguminoase.
Microorganismele intervin şi în fermentarea unor
produse vegetale: varza, murături, măsline, castraveţi,
cacao, etc.
Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat
impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria
laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de
fructe, zahărului, panificaţiei, etc.) şi a culturilor starter
(industria berii, laptelui, cărnii, panificaţiei, etc.) La
toate acestea trebuie să avem în vedere obţinerea de
metaboliţi secundari (alcool etilic, acetonă, acizi
organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de
microorganisme precum şi de biomasă alimentară şi
furajeră, etc.
Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot
accelera procesele biochimice, se pot perfecţiona
procesele de producţie, se poate îmbunătăţi calitatea
produselor alimentare şi se poate mări gradul de
diversificare a producţiei alimentare.
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 2
Culturi starter de microorganisme.
__________________________________________________ 3.Hidrolaze ce catalizează scindarea hidrolitică (implică
__________________________________________________ apa) a legăturilor chimice covalente;
________________________________________________ 4.Liaze, care catalizează scindarea legărutilor chimice
altfel decât prin hidroliză sau oxidare;
5.Izomeraze ce catalizează rearanjarea structurală a
1.2. PREPARATE ENZIMATICE
moleculelor;
1.2.1. Aspecte generale
6.Ligaze sau sintetaze care catalizează formarea de noi
Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine legături te tip C-N, C-O, C-C, C-S, cu consumare de
constituite din aminoacizi, iar din punct de vedere ATP.
funcţional acţionează ca nişte biocatalizatori biologici
care au rolul de a permite realizarea unor reacţii cu o
viteză mărită. Utilizări ale enzimelor în industrie:
Enzimele sunt utilizate drept catalizatori în condiţiile în Principalele domenii în care enzimele şi-au găsit
care există şi catalizatori chimici, deoarece prezintă utilizări sunt:
următoarele avantaje:
- Fabricarea unor produse prin transformarea
1. Au capacitatea de a cataliza reacţiile chimice în enzimatică a amidonului;
condiţii blânde de temperatură, pH, presiune. Aceasta
- La fabricarea altor produse alimentare : produse
permite un consum mai redus de energie şi nu necesită
lactate, bere, sucuri, vin, panificaţie;
echipamente scumpe rezistente la coroziune.
- În compoziţia detergenţilor;
2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori
stereoselective, care nu conduc la obţinerea de produşi - Industria textilă, hârtiei şi a furajelor pentru
de reacţie secundari nedoriţi. În aceste condiţii nu sunt animale;
necesare cheltuieli mari privind rafinarea şi purificarea - Sinteza catalitică a unor substanţe chimice;
produsului ce urmează a fi fabricat.
- Analiza alimentelor, diagnoză chimică şi
3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din terapie;
punctul de vedere al mediului compuşi biodegradabili
care nu necesită costuri semnificative de epurare. - Inginerie genetică;

4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la acţiunea în

mediul apos, putând acţiona şi la interfaţa dintre două Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu
faze, apă: solvent organic sau apă:ulei etc. de bază al biotehnologiei, având drept scop studierea
Totuşi există şi o serie de dezavantaje: tehnicilor de obţinere a preparatelor enzimatice folosind
materii prime de origine animală, vegetală şi
- au stabilitate limitată; microbiană, sub formă liberă sau imobilizată pentru a fi
- de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o folosite ca agenţi biologici în industria alimentară,
singură dată. industria furajelor, industria textilă, detergenţilor,
farmaceutică, cosmetică, chimică, etc. Prin utilizarea
Clasificarea enzimelor. Enzimele se clasifică conform
preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiţionale se
sistemului stabilit de Comisia de Enzime a Uniunii
transformă în biotehnologii, devenind mai eficiente şi
Internaţionale de Biochimie (1979). Conform acestei
mai puţin poluante. În figura 1.2. este prezentată
clasificări există 6 clase principale grupate conform cu
ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice în
reacţiile pe care le catalizează astfel:
diferite ramuri.
1. Oxidoreductaze care catalizează reacţii de
oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen
sau electroni;
2. Transferaze care catalizează transferul unei
grupări de pe o moleculă pe alta;
 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 3
Culturi starter de microorganisme.
Preparate enzimatice lichide
Alte domenii; 6 1. Preparate enzimatice brute, formă sub care se
Morarit,
panificatie; 5 livrează enzimele extracelulare (eliberate de către
Sucuri, vinuri; 10 Amidon; 30
microorganisme în mediul de cultură în timpul
Bere; 4
fermentaţiei).
Distilate; 5
Produse lactate;
2. Preparate parţial purificate, în care se adaugă
5 Detergenti; 35 conservanţi pentru a le mări stabilitatea în timp.
In tabelul de mai jos sunt prezentate principalele tipuri
de preparate enzimatice, sursele din care se obţin şi
aplicaţile în industria alimentară.
Figura 1.2. Poderea utilizării preparatelor enzimatice 1.2.3. Surse de enzime
Aşa cum se observă din datele de mai sus, cea mai mare Preparatele fabricate la scară industrială folosesc trei
pondere o are utilizarea în industria alimentară, urmată tipuri de surse: ţesuturi animale şi vegetale sau
de industria detergenţilor. microorganisme.
În figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din
preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai industria cărnii (ficat, pancreas, inimă, rinichi, creier,
mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de mucoasă stomacală şi intestinală). Utilizarea acestr surse
amilaze. este pe scară din ce în ce mai redusă, fiind înlocuite de
sursele microbiene, deoarece sursele animate prezintă o
serie de dezavantaje, cum ar fi: producţia limitată,
Glucozizomeraze;
apariţia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiformă la
Alte enzime; 4
Pectinaze; 10 14
bovine.
Amilaze fungice;
Proteaze fungice; 18
4
Principalele enzime de origine animală care se obţin sub
formă de preparate sunt chimozină (renina) care se
Amilaze bcteriene;
10
extrage din stomacul de miel sau viţei care se utilizează
Proteaze Proteaze de
bacteriene; 35 coagulare; 5 pentru coagularea laptelui la fabricarea brânzeturilor. O
altă enzimă este α -amilaza pancreatică care are utilizări
în industria farmaceutică.
Sursele vegetale sunt reprezentate de seminţe(germinate
Figura 1.3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.
sau negerminate), rădăcini, fructe, sevă, latexuri,
1.2.2. Tipuri de preparate enzimatice. Preparatele frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obţinerea
enzimatice se comercializează sub diverse forme şi preparatelor enzimatice ridică o serie de probleme, cum
grade de purificare: ar fi: prezenţa unor substanţe potenţial dăunătoare
Preparate enzimatice solide: sănătăţii omului (ex. Compuşii fenolici) sau a unor
compuşi toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face
1. Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, ca sursele de origine vegetală să fie destul de puţin
obţinute prin uscarea şi măcinarea mediului fermentat; utilizate. Principalele enzime obţinute din surse vegetale
2. Preparate sub formă cristalizată, enzime pure sunt.
utilizate preponderent în chimia analitică şi ingineria - papaina, protează obţinută din latexul fructelor de
genetică; Caryca Papaia. Enzima este utilizată pentru
3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în tenderiyarea cărnii sau în industria berii;
amestec cu substanţe crioprotectoare, care sunt urcate în - ficina, protează obţinută din latexul fructului de
vacum la temperaturi de -20......-50°C. smochin (Ficus carica), utilizată pentru degradarea
proteinelor miofibrilare.
 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 4
Culturi starter de microorganisme.
- bromelina, protează obţinută din sucul de ananas ( condiţiilor optime fizice şi chimice pentru producerea de
Ananas comosus ), folosită pentru hidroliya proteinelor enzime;
colagenice.
- proprietăţile enzimelor şi specificitatea de acţiune
Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din diferă cu natura microorganismelor producătoare, astfel
soia şi complexul enzimatic din malţ ( amilaze, industrial se pot obţine preparate care corespund
proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor întocmai scopului dorit.
enzime nu sunt purificate, fiind sub formă de făină de
- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi
soia sau de malţ.
diferite cu predominanţa unei activităţi.
Microorganismele reprezintă principala sursă pentru
1.2.4. Tehnologii de obţinere a preparatelor
obţinerea de preparate enzimatice. Avantajele utilizării
enzimatice
microorganimelor constau în:
Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor
- microorganismele se pot obţine în cantităţi mari
enzimatice este prezentată în figura Tehnologia de
(biomasă) prin cultivare în instalaţii speciale pe medii de
obţinere a preparatelor enzimatice implică operaţiile
cultură ieftine (tărâţă de grâu, extract de porumb,
indicate în schema prezentată în fig. 1.4. din care rezultă
melasă, şroturi de soia sau floarea soarelui, zer),
ca preparatele enzimatice pot fi obţinute sub formă de:
- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte
- preparate enzimatice brute-uscate;
scurt faţă de cel al plantelor sau animalelor;
- preparate enzimatice brute – lichide concentrate;
- producţia de enzime de către microorganisme poate fi
mărită prin selectarea şi utilizarea de tulpini mutante, - preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv
înalt performante (productive) şi prin stabilirea şi uscate.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 5
Culturi starter de microorganisme.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 6
Culturi starter de microorganisme.

Figura 1.4. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice

 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Procesele biotehnologice de obţinere a preparatelor
microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune
parcurgerea a trei etape:
1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea
mecanică şi fizico chimică a materiilor prime ce intră în
compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această
etapă presupune operaţii de dozare, mărunţire,
solubilizare, sterilizare etc.
2 Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor
starter intermediare şi a culturii de producţie, urmată de fie prezenţi în mediul de cultură sunt: macronutrienţii
etapa fermentativă prorpiu-zisă.
3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a
enzimelor.
A. Pregătirea mediului de cultură
Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de
cultură.
Materiile prime trebuie să asigure principalii nutrienţi
microorganismelor în vederea dezvoltării lor în timpul
fermentaţiei.
Surse de carbon. Principala sursă de carbon (sursă de
energie) pentru microorganisme o constituie glucidele,
sub formă de glucoză, fructoză, galactoză care sunt uşor
asimilabile, în timp ce maltoză, zaharoza şi lactoza sunt
asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime
capabile să le transforme în monoglucide. Poliglucidele
pot fi utilizate doar de către microorganismele apte să
sitetizeze enzimele care să le hidrolizeze extracelular în
monoglucide capabili să difuzeze prin membrana
celulară.
Ca surse de carbon în reţetele mediilor industriale se
folosesc urmatoarele:
- Melasele care provin de la rafinarea zahărului.
- Extractul de porumb, este reprezentat de extractul
obţinut din industria amidonului după ce suferă o
concentrare până la 50% S.U.
- Leşiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a
transformării masei lemnoase în pulpă celulozică sub
acţiunea bisulfitului de calciu.
Surse de azot. Azotul din mediul de cultură are rol
anabolic, participând la biosinteza proteinelor
structurale, a enzimelor şi acizilor nucleici.
Principalele surse de azot sunt:
7
- azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul
de amoniu, forfatul acid de diamoniu,
- azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia,
carne etc.
Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea
microorganimelor în timpul procesului de fermentaţie
este necesară prezenţa ionilor anorganici, aceştia
reprezintă circa 8% din substanţa urcată a a celulelor
microbiene. Principalii ioni anorganici care trebuie să
(azot, fosfor, sulf, potasiu, şi magneziu) şi
micronutrienţii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc,
molibden, cupru, mangan, nichel şi seleniu).
Surse de factori de creştere. Factorii de creştere sunt
compuşi organici a căror prezenţă în mediul de cultură
este necesară în cantităţi mici, având un rol catalitic sau
structural pentru microorganisme. Factorii de creştere
includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide şi
nucleozide, aminoacizi, acizi graşi, steroli şi poliamide.
Principalele vitamine necesare ca factori de creştere
sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina.
Tratementul termic al mediilor de cultură. Pentru buna
desfăşurare a procesului de fermentaţie este necesară
cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultură steril
pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de
cultură se poate realiza direct în bioreatorul în care se
realizează fermentaţia sau într-un vas sub presiune
separat, ulterior fiind transferat în bioreactor.
B. Etapa biologică.
Obţinerea culturilor starter de producţie
Pentru producerea enzimelor, fermentaţiile industriale se
desfăşoară în volume de 150 – 250 de mc de mediu,
motiv pentru care trebuie pregătită o cantitate suficientă
de inocul. Cultura folosită drept inocul trebuie să fie în
faza exponenţială de creştere. La microorganismele care
au viteză de creştere redusă, se recomandă să se
folosească o cantitate mai mare de inocul, pentru a se
reduce durata iniţieirii fermentaţiei. Cultura starter de
producţie trebuie să conţină celule active, adaptate la
mediul industrial pentru ca fermentaţia să se declanşeze
rapid. În cazul fermentaţiilor desfăşurate pe mediul
solid, pentru care se utilizează inocule sporifere se
recomandă să se asigure prin inoculare concentraţii de
105-106 spori pe g mediu, iar în cazul celor submerse
cultura starter de producţie să fie de circa 10% din
mediul de cultură.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 8
Culturi starter de microorganisme.

Figura 1.5. Schema bloc pe operaţii de obţinere a preparatelor enzimatice microbiene brute
 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Tehnici de fermentaţie
Pentru producţia de preparate enzimatice de origine
microbiană se poate aplica două tehnici de bază :
Fermentaţia de suprafaţă în care se utilizează un
mediu solid pe care se cultivă microorganismul (de
regulă un mucegai filamentos). Această tehnică are
avantajul că mediul de cultură va deveni un mediu
bogat în activitate enzimatică ;
Fermentaţia de submersă, în care mediul este lichid
ce se află într-un reactor unde toţi parametrii
fermentaţiei sunt perfect controlaţi. Această ultimă
tehnică este superioară primei metode din punct de
vedere tehnologic şi biochimic.
Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc
menţionăm următoarele : Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces
cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii,
Kluyveromyces lactis, Bacillus amylolichefaciens,
Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus,
Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.
La sfârşitul fermentaţiei microorganismul trebuie
distrus cu condiţia păstrării intacte a activităţii
enzimatice.
Microorganismele cultivate pot produce enzime
extracelular sau intracelular. În funcţie de tipul acestora
variază şi procedeul de extracţie. În ceea ce priveşte
tipurile de culturi submerse, ne putem situa în unul
din următoarele cazuri:
Procedeul nealimentat, în care caz toate
ingredientele mediului de fermentare sunt pregătite
în fermentator la pH-ul şi temperatura dorită înainte
de a introduce inoculum. După introducerea
inoculum, fermentaţia principală începe şi finalizarea
ei se urmăreşte prin prelevarea de probe, în mod
steril, care arată :
- creşterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea
mediului) ;
9
- concentraţia în enzimă (activitatea enzimatică a
mediului) ;
- consumul de glucide ;
- nivelul de proteine.
La procedeul nealimentat se pot monta diferiţi
senzori care arată :
- pH-ul – care se poate regla prin adaus de baze sau
acid ;
- temperatura – care se poate regla prin debitul de
circulaţie al apei reci în mantaua fermentatorului
sau în serpentina din interiorul fermentatorului ;
- nivelul de spumă – care se poate combate cu un
antispumant aflat într-un rezervor ataşat
fermentatorului;
- presiunea – care se reglează prin supape care se
deschid la presiuni de 1 până la 3 bar ;
- coeficientul respirator QR – care se măsoară prin
cantitatea de CO2 produsă faţă de cantitatea de
oxigen consumată ;
- nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza
efluenţilor.
Procedeul alimentat, în care se începe cu un volum
de 10 – 30% de substrat în care se introduce
inoculum, după care fermentatorul se alimentează cu
restul de mediu, după care oprirea fermentaţiei se
face după un anumit timp fixat experimental. Acest
procedeu se aplică în cazul în care sinteza
enzimelor ar fi reprimată de concentraţiile ridicate
într-unul din nutrienţii mediului de cultură sau în
cazul când creşterea microorganismelor, în funcţie de
concentraţia în unul din componenţii mediului, ar
provoca creşterea vâscozităţii, care trebuie să fie
reglată în timp. Alimentarea fermentatorului poate fi
repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje
(evacuări) programate, dar întotdeauna trebuie lăsat în
fermentator un volum de ≤ 30%, care serveşte în
acest caz drept cultură de producţie.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 10
Culturi starter de microorganisme.

Fig. 1.8. Cultivarea submersă a microorganismelor.

 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Procedeul continuu necesită alimentarea continuă a
fermentatorului cu mediu şi folosirea unei culturi
concentrate de microorganisme. În acest caz,
bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor -mediul de cultură poate fi colmatant pentru
este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. În membrana de ultrafiltrare;
figura 1.9. se arată schiţa unei astfel de instalaţii
formată dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de
ultrafiltrare la care există şi posibilitatea de a
recicla biomasa.
Procedeul continuu
Avantajele unui astfel de procedeu sunt
următoarele :
-se poate detoxifica mediul de cultură prin
eliminarea produsului de inhibare ;
-celulele reciclate devin perfuzate ;
-cantitatea de mediu de cultură care se introduce în
bioreactor este controlată de cantitatea de permeat
care traversează membrana de ultrafiltrare ;
-celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la
concentraţii relativ mari (∼ 300 g substanţă uscată/l,
în cazul drojdiilor) ;
-aceste concentraţii mari de celule se constituie ca
o barieră eficace faţă de contaminarea exterioară ;
-retenatul poate fi evacuat şi el periodic, fiind
constituit din biomasă care conţine enzime
intracelulare, după care este trecut la prelucrare
ulterioară (extracţie) ;
-permeatul de la ultrafiltrare, care conţine enzime nu
mai are celule microbiene şi poate fi, deci, stocat
sau dirijat direct la o operaţie în aval de purificare
sau concentrare.
Neajunsurile acestui procedeu de obţinere a de 20 MHz pentru liza celulelor şi deci pentru
biomasei şi enzimelor sunt următoarele :
-membranele trebuie să fie rezistente la sterilizarea
cu vapori de apă şi la igienizare cu substanţe
11
chimice ;
-costurile energetice sunt destul de ridicate;
-chiar la densităţi mari de celule, la sfârşitul ciclului
de dezvoltare este posibilă o oarecare liză a
celulelor, ceea ce face necesară o purjare a
bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care
conduce la micşorarea vârstei medii a celulelor care
rămân în sistem.
O variantă a procedeului continuu de obţinere a
biomasei/ enzimelor constă în folosirea bioreactorului
cu membrană.
C. Etapa de separare a enzimelor
Extracţia. La procedeul discontinuu (nealimentat) şi
cel alimentat, după terminarea fermentaţiei se separă
partea solidă insolubilă (celule şi produse insolubile)
de partea lichidă care conţine enzimele, separare
care se poate face prin centrifugare, filtrare frontală
sau microfiltrare. Soluţia sterilă obţinută este apoi
ultrafiltrată pentru a concentra enzimele. În cazul în
care enzimele sunt destinate a intra în compoziţia
unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se
stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) şi/sau săruri
(NaCl, MgSO4), respectiv se adaugă bacteriostatici
alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).
În cazul în care enzima (enzimele) intră în
compoziţia unui preparat comercial pulbere,
ultrafiltratul se suplimentează cu un suport şi se
usucă prin atomizare (suplimentarea se face cu
amidon, dextrine). Înainte de atomizare mai poate fi
realizată o filtrare sterilă.
Pentru a obţine şi enzimele intracelulare, biomasa
din fermentator, separată de partea lichidă, este
supusă lizei. Liza poate fi realizată chiar de
enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc
biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum
ar fi lizozimul din albuşul de ou, preparate
enzimatice exogene complexe de natură bacteriană
care conţin chitinază, mananază, α -1,6–glucanază,
proteaze, câteodată în combinaţie cu adaosul de
metabisulfit.
În cazul în care enzima este periplasmică, un şoc
osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se
poate realiza şi o liză mecanică (folosire de presiuni
mari de 600 – 1000 bar, urmată de detenta brutală)
Se pot folosi şi ultrasunetele cu frecvenţe mai mari
eliberarea enzimelor intracelulare. Odată eliberate,
enzimele intracelulare sunt supuse operaţiilor
aplicate şi enzimelor extracelulare.
 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Preparatele enzimatice se comercializează de regulă
sub formă de pulbere, de microgranule, precum şi
sub formă lichidă.
Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt
formulate cu un suport cum ar fi amidonul,
maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate se • se poate modula micromediul în care acţionează
controlează granulometria, umiditatea (∼ 6%). Suportul
trebuie să nu fie higroscopic pentru a se evita
formarea de cocoloaşe. În preparatele comerciale
pulbere sau lichide, conţinutul de enzimă este redus
raportat la suport şi de aceea cantitatea de preparat
comercial este mult mai mare, în comparaţie cu
nivelul de enzimă conţinut.
În ceea ce priveşte preparatele comerciale
microgranulate, acestea se obţin dintr-un ultrafiltrat
care se amestecă cu un suport (sare, amidon solubil,
maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel
calculată încât să se obţină titrul enzimatic dorit în • are loc o creştere a vitezei de lucru, prin
microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat
împreună cu un agent liant care reprezintă 0,1%
până la 0,5% faţă de masa suportului. Picăturile
pulverizate sunt uscate într-un turn de uscare, cu aer
la 70 - 90°C.
Preparatele comerciale lichide sunt formulate în
general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se
utilizează în proporţie de 20 – 50% faţă de
preparatul lichid. La aceste formulări se adaogă o
substanţă bacteriostatică (de exemplu benzoat de
sodiu în proporţie de 0,1 – 0,2%).
1.2.5. Enzime imobilizate
Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem
multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea
acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească
următoarele condiţii :
-să fie insolubil în apă ;
-să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale
enzimelor, respectiv specificitatea de acţiune ;
-să asigure acţiunea enzimei la un pH şi
temperatură optime, apropiate de cele ale enzimelor
libere (neimobilizate).
Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele :
• creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca
activitate catalitică. Această stabilitate este în
legătură cu diminuarea gradului de libertate al
macromoleculei, ceea ce are consecinţă asupra
variaţiilor de conformaţie a enzimei (se
diminuează aceste variaţii). Imobilizarea conduce
şi la creştere a concentraţiei locale a protein-
enzimei care are un efect stabilizant;
• se poate lucra în flux continuu din punct de
vedere al catalizei enzimatice, dar şi din punct
12
de vedere al reglării automate a parametrilor de
lucru;
• enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează
în cursul catalizei enzimatice;
enzima imobilizată (concentraţie substrat,
încărcarea suportului cu enzimă, grupările
hidrofile);
• refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi
cantitate de enzimă se poate transforma o
cantitate mai mare de substrat;
• se poate lucra în sistem semicontinuu sau
continuu, putându-se automatiza procesul, ceea ce
asigură un control riguros al parametrilor de
lucru;
controlul riguros al vitezei fluxului de substrat
şi al concentraţiei acestuia;
• se poate stopa reacţia enzimatică la momentul
dorit şi se evită trecerea enzimei în produsul
transformat;
• costurile globale de producţie sunt mai mici în
comparaţie cu procedeele în care se folosesc
enzime libere;
• se pot folosi şi enzime care nu sunt trecute în
liste GRAS (Generally Reconized as Safe);
Există şi dezavantaje, cum ar fi:
• costuri privind imobilizarea;
• pierderi ale activităţii enzimatice,
• o investiţie iniţială în utilaje mai mare,
• un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi
o supraveghere mai atentă;
• utilizarea numai a unor substraturi solubile.
Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.
În cazul enzimelor imobilizate se observă un
comportament cinetic diferit faţă de cel al enzimelor
libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare
a imobilizării. Acest lucru se datorează schimbărilor
conformaţionale ale enzimei după imobilizare. O astfel
de modificare apare în primul rând în cazul legării
covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este
influenţa mediului, în cazul enzimelor imobilizate acesta
este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcţionale
acide
La imobilizare, în funcţie de enzimă şi catalizator se
poate vorbi de :
- randament de fixare care reprezintă cantitatea
efectivă de enzimă imobilizată în raport cu
 Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 13
Culturi starter de microorganisme.
cantitatea de enzimă introdusă în procesul de - eficienţa economică a imobilizării
imobilizare : determinate de : costul enzimei, costul
suportului, costul tehnicii de imobilizare ;
enzimă fixată pe suport
- activitatea enzimei imobilizate care este
η = · 100 influenţată de : tehnica de imobilizare;
enzimă utilizată caracteristicile materialului suport, viteza de
difuzie a substratului la enzimă şi a
- randament de activitate care reprezintă activitatea produsului (lor) de transformare ;
reziduală a enzimei imobilizate:
- caracteristicile substratului ce trebuie
Activitatea (E0) după fixare transformat ;
· 100
Activitatea (E’0) înainte de fixare - stabilitatea enzimei care trebuie menţinută
activă un timp cât mai îndelungat ;
Factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la - contaminarea microbiologică a sistemului
folosirea enzimelor imobilizate enzimă/suport în timpul utilizării reactorului
Aceşti factori se referă la : respectiv.

Figura 1.10. Metode de imobilizare a enzimelor

Metode de imobilizare a enzimelor cu TiCl4). Adsorbţia se realizează prin contactul dintre
o soluţie apoasă de enzimă cu suportul solid şi va fi
a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport
influenţată de : pH, tipul de solvent utilizat pentru
prin intermediul legăturilor slabe sau relativ puternice
solubilizarea enzimei, puterea ionică, calitatea enzimei,
(legături Van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni
temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul.
proteină – proteină, legături ionice).
Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre
Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi : soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu agitator
sau prin trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în
- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen,
care suportul este menţinut sub forma unui pat.
Sepharoză modificată, polistiren modificat, răşini
Adsorbţia enzimei de suport poate fi îmbunătăţită prin
schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE Sephadex,
ataşarea de suport a unor cofactori, cum ar fi
carboximetil-celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;
piridoxal-fosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.
- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă
Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa
(bentonită, montmonirolită etc.), ceramică, hidroxiapatită,
şi volumul suportului, mărimea particulelor, raportul
sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi metalice
dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Avantajele şi dezavantajele imobilizării prin adsorbţie
Avantaje
• Simplicitate în execuţie (incubarea enzimei cu
suportul, agitare câteva minute, enzima care
rămâne în soluţie fiind eliminată prin spălare).
• Absenţa reacţiilor chimice (numai dacă nu se
formează punţi metalice).
• Posibilitatea de regenerare a complexului
enzimă/suport.
Dezavantaje
• Stabilizare slabă.
• Riscul de desorbţie a enzimei de către : fluxul
de substrat, variaţie lejeră de pH, forţa ionică,
temperatură
-prin includere într-un suport, în care caz se pot
include şi microorganisme. Includerea poate fi făcută
în gel, microincapsulare, includere în fibre.
Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor
prin incluziune
Avantaje
• Reacţiile de polimerizare sau gelificare sunt bine
cunoscute
• Reacţiile chimice dintre suport şi enzimă sunt
limitate (enzima este inclusă în geluri naturale)
• Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi la
amestec de enzime)
• Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme,
fibre, bile.
• Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin
reticularea suportului după imobilizare
Dezavantaje
• Anumite polimerizări necesită agenţi denaturanţi
sau radicalici
• Se pun probleme de transfer de masă
(inaccesibilitatea unor substraturi la enzimă)
• Riscul de evadare al enzimei prin micropori
• Proprietăţile mecanice ale gelurilor sunt
nesatisfăcătoare
b) Metode chimice de imobilizare, în care caz
imobilizarea se face prin intermediul legăturilor
covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări
reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii
chimice. Se poate realiza imobilizarea şi prin
copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv şi
legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi
intermoleculară a enzimelor de un suport prin
intermediul unui reactiv multifuncţional.
La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi
făcută : prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie
să se ţină seama de gruparea funcţională care poate
reacţiona cu protein-enzima şi de caracteristicile fizico-
chimice ale suportului. Adesea este necesar să se
creeze, pe cale chimică, funcţii reactive pe suport; prin
14
coreticulare utilizând agenţi bi- sau polifuncţionali. Cel
mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.
Avantajele şi dezavantajele legării enzimelor de suport
prin legături covalente
Avantaje
• Stabilitate mărită datorită faptului că legăturile
covalente sunt cele mai puternice dintre toate
legăturile menţionate anterior
• Varietatea mare a suporturilor : sticlă, silice,
ceramică, celuloză, polimeri sintetici etc.
• Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezenţa
unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecţia
situsului activ).
Dezavantaje
• Trebuie realizate reacţii chimice, adesea complexe
• Etapa de activare a suportului este lungă
• Randamentul de fixare este < 100%
• Există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere
de activitate)
• Este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil
• Investiţia (costul) este importantă
Suporturi de imobilizare comerciale
Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru
imobilizarea enzimelor sunt :
- polizaharide : agaroză, celuloză şi derivaţi, alginaţi,
carageenani, dextrani ;
- poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;
- polistiren (bile şi tuburi) ;
- silicea şi sticla poroasă.
1.2.6. Condiţiile de inocuitate pe care trebuie să le
îndeplinească preparatele enzimatice
Număr total de germeni (NTG), maximum 5.104/g ;
Coliformi, maximum 30/g ;
Escherichia coli – absent/ 25 g ;
Salmonella – absent/ 25 g ;
Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;
Aflatoxina B1, ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T
– 2 (zearalenona) în cazul preparatelor de origine
microbiană – absente ;
Metale grele :
-arseniu < 3 mg/Kg ;
-plumb < 10 mg/Kg ;
-alte metale grele < 40 mg/Kg (exprimată la Pb).
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
1.3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME
Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară
pentru:
- Obţinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care
la rândul lor sunt folosite pentru fermentarea
produselor lactate acide sau brânzeturi, la fabricarea
produselor de carne (salamuri crude uscate), produse
tradiţionale vegetale, produse lactate acide, pâine etc.
În acest produsele se consumă fie împreună cu
celulele respective fie după îndepărtarea celulelor cum
este cazul băuturilor de tipul berii, vinului.
- Obţinerea de biomasă care poate fi utilizată ca
ingredient de fermentare (drojdia de panificaţie ) sau
de îmbogăţire a unor produse alimentare cu proteine,
respectiv ca furaje proteice pentru păsări, peşte,
porcine.
În ceea ce priveşte metodele de cultivare ale
microorganismelor se folosesc metode periodice
(discontinui) şi metode continui, în ambele cazuri fiind
necesară optimizarea procesului.
Metoda periodică de cultivare a microorganismelor
prevede alimentarea continuă a aparatului de cultivare cu
substanţe nutritive şi înlăturarea culturii de
microorganisme. În acest fel, se creează condiţii optime de
acumulare a cantităţii necesare de biomasă sau a
metaboliţilor. La cultivarea periodică concentraţia
substanţelor nutritive scade, iar cea a celulelor şi
metaboliţilor creşte, fapt care conduce la modificarea
cineticii creşterii microorganismelor.
La metoda periodică trebuie să avem în vedere două situaţii
şi anume:
- când substratul este inhibitor pentru producţia de
biomasă şi metaboliţi;
- când produsul este inhibitor.
15
Prima situaţie se întâlneşte la obţinerea biomasei de drojdie
de panificaţie, represiunea catabolică de către glucide
antrenează şi o producţie de alcool etilic, producţie ce
trebuie evitată prin două soluţii şi anume: evitarea
excesului de substrat şi lucru cu cultura “în pat” şi
respectiv plasarea unui detector de alcool în efluentul de
gaz (CO2) care permite să se cunoască ce aport de substrat
trebuie furnizat.
A doua situaţie se întâlneşte la producţia de culturi lactice a
căror dezvoltare este însoţită de acumularea de acid lactic
(bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic şi acetic
(bacterii lactice heterofermentative).
Soluţia care se impune în acest caz este o dializă a culturii
sau centrifugarea substratului cu celule, celulele fiind apoi
reciclate.
Dacă dezvoltarea culturii are loc fără acumularea de
metaboliţi, alimentarea cu substrat se poate face la un debit
constant, dar la o concentraţie crescătoare a acestuia,
respectiv la o concentraţie constantă a substratului dar la un
debit programat exponenţial.
Metoda continuă, în care caz are loc alimentarea
constantă a aparatului de cultivare a microorganismelor cu
substanţe nutritive şi eliminarea neîntreruptă a biomasei
sau metaboliţilor. Această metodă poate fi realizată prin
cultivarea de suprafaţă sau de adâncime a
microorganismelor.
La fermentarea continuă se are în vedere natura
catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen sau nu;
celule incluse, adsorbite, grefate prin covalenţă); gradul de
reciclare al celulelor microbiene; gradul de amestecare a
fluidelor în reactorul cu funcţionare continuă.
Creşterea concentraţiei de celule se poate realiza prin:
folosirea tehnicilor de membrană sau centrifugarea;
folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.
1.3.1. Microorganisme utilizate în industria alimentară
BACTERIILE utilizate în industria alimentară aparţin
următoarelor genuri:
Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii
sub formă de coci sferici sau ovali cu φ < 2µ , grupate în
diplo sau formă de lanţuri. Sunt Gram pozitive, facultativ
anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind
capsulate.
Importanţi pentru industria alimentară sunt:
Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus
lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis
subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis
subsp. diacetilactis);
Streptococii termofili: Str. thermophilus.
Aceşti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc
acid lactic L(+) şi prezintă următoarele activităţi:
- activitate fermentativă: fermentează lactoza şi glucoza;
- activitate proteolitică;
- produc diacetil şi acetoină din acid citric ( în principal
Str. diacetilactis).
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face
prin transformarea iniţială a acesteia în glucoză şi galactoză
– 6P prin intermediul fosfo-β -galactozidazei. În
continuare, glucoza este apoi fermentată pe calea hexozo –
difosfatului în acid lactic, iar galactoza – 6P este utilizată
pe calea tagatozei în vederea producerii unei cantităţi
suplimentare de acid lactic (fig. 1.11.).
Figura 1.11. Calea tagatozei de degradare a lactozei de
către streptococii lactici
Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi
făcută pe cale homofermentativă cu producerea în principal
de acid lactic şi pe cale heterofermentativă, în condiţile în
care glucoza este limitată, calea heterofermentativă fiind
calea ribulozei – 5P cu formare de acid acetic, etanol şi
acid lactic (fig. 1.12.).
Figura 1.12. Calea homo şi heterofermentativă de
degradare a glucozei de către bacteriile lactice
Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină
şi 2,3 butilenglicol este arătată în figura 1.13. Acelaşi
mecanism îl folosesc şi leuconostocii.
16
Figura 1.13. Transformarea citratului de către Str. lactis
subsp. diacetilactis şi Leuconostoc
Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu formă
sferică, lenticulară, grupate în perechi sau lanţuri, imobile,
asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.
Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine
(acid nicotinic, tiamină, biotină) şi zaharuri
fermentescibile. Nu sunt proteolitici şi nu reduc azotaţii.
Specii de Leuconostoc formează polimeri (dextran). Se
dezvoltă bine la 20-30°C.
Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc
cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis; Leuconostoc
dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.
Aceste specii sunt heterofermentative şi se dezvoltă greu în
laptele fără adaos de stimulatori. În produsele lactate,
leuconostocii au două funcţii de bază:
- produc compuşi de aromă (diacetil, acetoină);
- produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 în
unele tipuri de brânzeturi (Edam, Goude, Tilsit).
Ambele funcţii sunt realizate prin metabolismul citratului,
dar leuconostocii produc CO2 şi din lactoză. Leuconostocii
intervin deci în metabolismul glucidelor şi al citratului.
Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de către
leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un
mol de hexoză regenerându-se câte un mol de ATP. Genele
care codifică etapele iniţiale ale fermentării lactozei (ca de
altfel şi ale metabolizării citratului, producerii de proteaze)
sunt localizate în plasmide.
Metabolismul citratului Metabolismul citratului de către
leuconostoci este acelaşi ca şi la streptococi cu menţiunea
că leuconostocii produc diacetil şi acetoină la pH scăzut.
Acetoina se poate forma pe două căi:
- prin decarboxilarea acetolactatului;
- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
reacţie care necesită NADH sau NADPH. Această ultimă
cale este redusă sau chiar lipseşte în cazul lui Str.
diacetilactis, din cauza capacităţii limitate a acestuia de a
produce acetil- CoA, unul din precursorii diacetilului.
Culturi starter Temperatura de Durata, pH-ul
incubare, °C ore
P. pentosaceus 26,7 20 5,00
P. acidilacti 26,7 38 5,65
P. pentosaceus 29,4 13 5,00
P. pentosaceus 29,4 28 5,40
Leuconostocii (ca de altfel şi lactobacilii) pot produce la
unele brânzeturi unele defecte şi anume:
- crăparea pastei la brânza Cheddar ( defect numit “Blit
opennes”);
- apariţia timpurie de gaze la brânza Goude (Str.
diacetilactis poate produce şi el defectul de “plutire” a
coagulului, la brânza Cottage).
Aceste defecte se datorează formării de CO2. Pentru a se
preveni defectul de “plutire” a coagulului, brânza Cottage
se fabrică cu o cultură care nu conţine Str. diacetilactis,
adăugându-se apoi în brânza obţinută o cultură de
Leuconostoc citrovorum cultivată pe lapte cu adaos de
citrat sau o cultură concentrată de Leuconostoc citrovorum.
În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează şi
pentru:
- fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveţi,
măsline) intervenind în cadrul microflorei spontane
sau sub formă de culturi concentrate;
- fermentarea malolactică a vinurilor;
- producţia de dextran.
În industria laptelui se folosesc culturi lactice care conţin
streptococi acidifianţi (Str. lactis şi Str. cremoris), precum
şi bacterii producătoare de aromă şi unele specii de
Leuconostoc şi Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant
şi acidifiant.
Genul Pediococcus. Acest gen aparţine familiei
Streptococaceae şi cuprinde bacterii sub formă de coci
perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este
predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid
lactic racemic (DL) din glucoză, fructoză, manoză.
Sorbitolul şi amidonul nu sunt fermentaţi. Multe specii sunt
catalază-negative, dar se întâlnesc şi specii care au
activitate catalazică independentă de hem.
Principalele criterii de diferenţiere între diferitele specii de
pediococi sunt menţionate în tabelul 3.8
P. acidilacti, în culturi starter, este utilizat pentru obţinerea
de produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate,
deoarece are o dezvoltare bună la 42-52°C, producând rapid
acidul lactic şi deci scade efectiv pH-ul, produsul obţinut
având gust acrişor. Atunci când se utilizează la fermentarea
17
unor produse de carne la temperatura de 16-27°C, producţia
de acid lactic este mai lentă şi implicit se pot dezvolta şi
microorganismele care contaminează carnea, durata de
fermentaţie fiind mai mare.
P. pentosaceus produce o fermentaţie rapidă când
substratul conţine un glucid fermentescibil, temperatura de
fermentare fiind cuprinsă între 15-27°C.
Din tabelul de mai sus rezultă că P. pentosaceus este mai
eficace în ceea ce priveşte producţia de acid lactic atât la
26,7°C cât şi 29,4°C în comparaţie cu P. acidilactici.
Având în vedere că pediococii produc acid lactic şi
bacteriocine, ei exercită o acţiune inhibitoare faţă de
microorganismele patogene şi cele de alterare (stafilocici,
salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram
negative, drojdii).
În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-
ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele să fie aduse
aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizează sinereza
şi deci uscarea produsului.
Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor
din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme
a produsului finit.
Genul Lactobacillus. Acest gen aparţine familiei
Lactobacillaceae. Această familie cuprinde bacterii sub
formă de bastonaşe de lungimi şi grosimi variabile, precum
şi cocobacili scurţi, aşezaţi obişnuit în lanţuri în faza de
înmulţire logaritmică.
Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau
facultativ anaerobe. În general sunt catalază –negative
citocrom-oxidază –negative, nu reduc azotaţii, nu lichefiază
gelatina. Au activitate proteolitică şi lipolitică redusă.
Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza,
zaharoza (mai ales în faza de dezvoltare), apoi hexozele
(glucoza, fructoza, galactoza).
Pentru dezvoltare necesită substanţe minerale şi toate
vitaminele din grupul B. Se dezvoltă bine în mediu cu pH
5,5-5,8, dar şi la pH ≤ 5 . Se pot dezvolta în limite largi de
temperatură (5-53°C), dar temperatura optimă este cuprinsă
între 30 şi 45°C.
În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii
pot fi:
termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L.
acidophilus, temperatura optimă fiind 37-45°C;
mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura
optimă de dezvoltare fiind 26-30°C.
Orla Jensen a împărţit genul Lactobacillus în următoarele
grupe:
1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili
homofermentativi termofili: L. lactis, L. helveticus, L.
bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;
2. grupa Streptobacterium – care cuprinde lactobacilii
homofermentativi mezofili: L. casei, L, plantarum;
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 18
Culturi starter de microorganisme.
3. grupa: Betabacterium – care cuprinde lactobacili fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă
heterofermentativi, ce contaminează frecvent brânzeturile: transformări pe calea Embden – Meyerhof (fig. 1.15.).
L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.
Streptobacteriile la rândul lor, au fost clasificate de către
unii autori în neacidorezistente şi acidorezistente.
Lactobacilii neacidorezistenţi produc compuşi aromatici
(diacetil, acetoină). Se prezintă sub formă de bastonaşe de
lungimi variabile şi rar formează lanţuri .
Se pot dezvolta la 2-15°C. Nu se dezvoltă la pH < 5,6. Se
utilizează în culturi starter la fermentarea salamurilor crude
cu pH = 5,6 – 6,1, produsele având o durată mare de
maturare, iar gustul final fiind slab acrişor dulceag.
Lactobacilii acidorezistenţi au formă de bastonaşe scurte Figura 1.15. Transformarea galactozei în glucoză-6P de
care formează lanţuri. Se dezvoltă bine la pH ≤ 5,0. către lactobacili
Activitatea metabolică a lactobacililor în produsele Activitatea proteolitică. Activitatea proteolitică a
alimentare fermentate se referă la metabolismul lactozei, lactobacililor contribuie atât la textura cât şi la aroma unor
galactozei şi glucozei. Zaharoza este fermentată numai produse alimentare (produse lactate, produse vegetale
după hidroliza acesteia în glucoză şi fructoză. fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar şi la
eliberarea unor aminoacizi care stimulează creşterea şi
Metabolismul lactozei Pentru a se dezvolta în lapte,
activitatea altor bacterii lactice folosite în culturile starter în
lactobacilii homofermentativi hidrolizează lactoza cu
amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea
ajutorul β -galactozidazei şi/sau β -D–fosfogalactozid– endoproteinazică a lactobacililor este asociată cu
galactohidrolazei, aşa cum arată în schema din figura 1.14. membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazică este
localizată intracelular. Enzimele din membrana celulelor
produc hidroliza parţială a macromoleculelor proteice, din
care se formează peptide suficient de mici pentru a fi
transportate în interiorul celulelor unde se continuă
degradarea lor până la aminoacizi, necesari creşterii (figura
1.16.).
Activitatea proteolitică a lactobacililor este optimă la pH
Figura 1.14. Transformarea lactozei în glucoză şi 5,2- 5,8 şi temperatura de 45-50°C. La temperaturi mai
galactoză respectiv glucoza şi galactoza 6P de către mari de 55°C activitatea proteolitică este mult redusă
lactobacilii homofermentativi datorită termodenaturării enzimei iar la 70°C/1min
enzimele sunt complet inactivate.
β -D-galactozid–galactohidrolaza este utilizată de Lb.
casei iar β -galactozidaza este utilizată de majoritatea În cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L.
lactobacililor (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus etc.), bulgaricus sunt active faţă de β -cazeină, apoi în ordine
deşi aceştia din urmă au şi activitate β -D–fosfogalactozid– descrescătoare şi faţă de Қ şi β cazeină.
galactohidrolazică, însă mai redusă.
L. bulgaricus are β -galactozidază activă la pH = 7,0 şi este
activată de Mg2+, Mn2+ şi Fe2+. În cele mai multe cazuri,
lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca sursă de energie
în comparaţie cu lactoza şi galactoza. Unii lactobacili
eliberează în mediu galactoză care se acumulează.
Metabolismul hexozelor După hidroliza lactozei în celulele
lactobacililor homofermentativi, hexozele rezultate sunt
metabolizate pe calea Embden – Meyerhof.
Lactobacilii heterofermentativi fermentează hexozele pe
calea hexozomonofosfatului, aceşti lactobacili neavând
aldolază şi triozofosfat izomerază care sunt enzime cheie în Figura 1.16. Acţiunea endoproteinazelor extracelulare şi a
calea Embden – Meyerhof. Aceasta este de fapt şi diferenţa exopetidazelor intracelulare în cazul lactobacililor
dintre cele două grupe de microorganisme, adică
lactobacilii homofermentativi posedă atât aldolază cât şi Producerea de compuşi de aromă şi H2O2 Principala
triozofosfatizomerază, în timp ce lactobacilii contribuţie a lactobacililor este producţia de acid lactic. În
heterofermentativi nu posedă aceste enzime. cazul produselor lactate acide, deşi speciile de lactobacili
implicate sunt homofermentative, acestea însă produc şi alţi
Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată metaboliţi, printre care produşi volatili ca: acetaldehida,
trebuie mai întâi să fie transformată într-un derivat diacetil şi alcool. In cantitate mai mare fiind produsă
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
acetaldehida. În plus, L. casei produce diacetil din citrat,
mai ales atunci când laptele se suplimentează cu citrat (L.
casei nu este însă un producător major de diacetil). Anumiţi
lactobacili produc H2O2 care se acumulează în mediul şi
jenează dezvoltarea altora. Acumularea H2O2 în mediul de
cultură este posibilă pentru ca lactobacilii sunt catalază –
negativi. Incapacitatea lactobacililor de a distruge
metabolic H2O2 explică de ce aceştia nu se dezvoltă bine în
condiţii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru
lactobacili care nu posedă superoxiddismutază, enzimă care
se constituie ca un sistem de protecţie faţă de toxicitatea
oxigenului, cum este cazul altor bacterii.
Acţiunea lactobacililor este îmbunătăţită prin interacţiuni
cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura mixtă formată
din L. bulgaricus şi Str. thermophilus este adecvată pentru
fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixtă produce mai
rapid acid lactic.
Interacţiunea dintre cele două bacterii lactice este benefică
din următoarele motive:
- L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, în particular
histidină, care stimulează producţia de acid lactic a lui Str.
thermophilus;
- Str. thermophilus, pe de altă parte, produce acid
formic, care stimulează activitatea lui L. bulgaricus;
- Str. thermophilus, deşi produce o cantitate suficientă
şi de CO2 care stimulează dezvoltarea lui L. bulgaricus,
totuşi dezvoltarea acestuia este mai redusă, deoarece Str.
thermophilus utilizează mai rapid anumite substanţe
nutritive esenţiale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. În
plus, lactobacilii, în general, sunt sensibili chiar la niveluri
foarte reduse de antibiotice, în comparaţie cu Str.
thermophilus ( de aici şi necesitatea ca laptele să nu conţină
urme de antibiotice).
Utilizarea culturilor de lactobacili:
• În industria laptelui se utilizează Lactobacillus
lactis şi Lactobacillus bulgaricus, singuri sau în amestec la
fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei
Ementhal, brânzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus
este şi el implicat în unele din aceste produse.
Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui
acidofil, laptelui acidofil nefermentat şi a altor produse
acidofile. Lactobacillus casei se utilizează pentru obţinerea
produsului yakult.
• În industria cărnii interesează Lactobacillus sake,
Lactobacillus curvatus şi în special Lactobacillus
plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce
CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat.
Riboza este fermentată la acid lactic şi acid acetic. Posedă
activitate aldolazică, glucozo – 6P – dehidrogenazică. Prin
fermentaţie lactică se produce acid lactic racemic (DL).
Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu
produce NH3 din arginină. Poate acidifica laptele şi are
temperatura optimă de dezvoltare la 30-35°C. Nu necesită
pantotenat, tiamină, niacină pentru dezvoltare.
Lactobacillus plantarum ca şi Lactobacillus sake pot
descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea
ce este dezavantajos în cazul salamurilor la care se
19
foloseşte glucono – delta – lactona ca acidifiant chimic.
Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dacă pH-ul
mediului este mai mare de 6,0 şi nu există zaharuri
fermentescibile în mediul de cultură. Lactobacillus sake şi
Lactobacillus curvatus produc H2O2 în prezenţa O2
atmosferic. Cei doi lactobacili se întâlnesc frecvent în
salamurile crude fără adaos de culturi starter (sunt
componenţi ai microflorei spontane a compoziţiei de
carne).
• Alte utilizări Lactobacilii interesează şi în
fermentarea măslinelor, verzii, castraveţilor, gogonelelor,
în producerea spirtului şi drojdiei presate în vederea
acidifierii plămezilor, la fermentarea unor produse
fermentate din cereale (bragă, cvas), la fabricarea acidului
lactic prin fermentare etc.
Genul Micrococcus şi Staphylococcus Microorganismele
din genurile Micrococcus şi Staphylococcus aparţin
familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub formă de
coci. Se pot dezvolta în medii care conţin 15% NaCl.
Pentru industria cărnii interesează anumite specii de
micrococi şi stafilococi care sunt folosite pentru:
- capacitatea lor de a reduce azotaţii la azotiţi (contribuie
la formarea culorii cărnii sărate în prezenţă de azotaţi);
- activitatea lor catalazică;
- activitatea de acidificare, proteolitică şi lipolitică.
Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus
aurantiacus şi Micrococcus varians.
Pentru industria laptelui, micrococii formează partea
principală a populaţiei nelactice din laptele crud şi
respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din brânza
Cheddar fabricată din lapte crud a fost izolat Micrococcus
freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub formă de
cultură pură în scopul accelerării formării aromei brânzei
fabricate din lapte pasteurizat datorită activităţii proteolitice
şi lipolitice. Tot în scopul maturării unor brânzeturi cu
pastă presată s-a utilizat un preparat enzimatic şi anume
Rulactina ce conţine o metal-protează cu activitate strict
endoproteinazică obţinută din Micrococcus caseolyticus.
Din genul Staphylococcus interesează speciile de
stafilococi coagulază-negativi, nepatogeni cum ar fi:
Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus,
Staphylococcus simulans.
Combinaţiile de micrococi şi stafilococi sunt eficace pentru
activitatea azotat-reductazică şi catalazică. În aceste
combinaţii, Staphylococcus carnosus acţionează mai bine
decât micrococii în formarea culorii, reducând azotaţii la
azotiţi şi respectiv azotiţii la oxid de azot, chiar în condiţii
de aciditate ridicată a substratului. Aroma produselor la
care este utilizată cultura starter de Staphylococcus
carnosus este superioară.
Genul Streptomyces. Specii din genul Streptomyces pot
altera alimentele, producând mirosuri şi gusturi
dezagreabile, altele (puţine la număr) sunt patogene.
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
Streptomyces griseus senso Hötter este însă inofensiv şi a
fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce azotatul la
azotit, putându-se dezvolta bine în substraturi care conţin ~
8% NaCl şi care au pH = 5,8-8,5. Temperatura optimă de
dezvoltare este la 30°C. Este catalază – pozitiv având
capacitate proteolitică dar nu şi lipolitică. Poate fi asociat
cu micrococii şi/sau lactobacilii. În salamurile crude se
inoculează la nivel de 5·103 /g compoziţie.
Genul Propionibacterium. Bacterile din genul
Propionibacterium fac parte din familia
Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermentează
carbohidraţii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice “tip
lapte” sunt: Propionibacterium freundreichii (cu
subspeciile freundreichii, globosum şi shermani),
Propionibacterium theonii, acidipropionici şi jensenii.
Principalii produşi de fermentaţie a bacteriilor propionice
sunt CO2, cantităţi mari de acid propionic şi acetic şi
cantităţi mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic.
Toate speciile produc acid lactic din glucoză. Se dezvoltă
foarte bine la 30-37°C şi la pH = 7,0.
Producerea de propionat, acetat şi CO2 Lactatul (respectiv
piruvatul) este transformat în propionat prin reacţia:
3CH3-CHOH-COOH
2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O
Propionatul, acetatul şi CO2 se formează în proporţie de
2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc
între ele prin raportul acid propionic /acid acetic format, o
influenţă în acest sens având şi aciditatea substratului,
cantitatea de lactat şi adaosul de carbonat şi succinat.
Producerea de prolină Prolina este considerată ca
principalul component care conferă aromă dulceagă
brânzeturilor de tip şvaiţer, prezenţa prolinei fiind asociată
cu dezvoltarea bacteriilor propionice la maturarea
brânzeturilor de tip şvaiţer. Se consideră că există trei căi
pentru producerea de prolină:
- proteoliza generală;
- hidroliza peptidelor care conţin prolină;
- biosinteza prolinei.
La prima cale se ia în considerare producerea de prolină
prin hidroliza cazeinei.
La a doua cale se ia în considerare formarea de prolină din
hidrolizatul cazeinic prin acţiunea peptidazelor
(Propionibacterium shermanii posedă imidopeptidază şi
proliniminopeptidază intracelulare cu optim de pH la 5,5-
6,0).
La a treia cale se are în vedere biosinteza prolinei din
arginină şi mai puţin din acid glutamic, dar calea de
biosinteză este nesemnificativă în raport cu cea de-a doua
cale menţionată.
În orice caz, concentraţia de prolină din interiorul celulelor
este mai mică decât cea a prolinei din mediul de cultură .
Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea
enzimelor celulare în mediu. Bacteriile propionice singure
hidrolizează încet cazeina, dar producerea de prolină în
20
brânzeturi este sporită prin dezvoltarea anterioară sau
concomitentă a bacteriilor lactice. Viteza formării prolinei
la valorile pH şi concentraţia de NaCl atinsă în brânza
şvaiţer este temporar încetinită, dar maturarea prelungită
anulează efectele de inhibare ale pH-ului şi concentraţia de
NaCl. Se consideră că ionii de cupru ar inhiba producerea
de prolină pe unele căi, această inhibare parţială fiind
benefică, deoarece permite evoluarea altor procese de
aromatizare.
Producerea de diacetil şi acetoină Bacteriile propionice
pot produce diacetil şi acetoină, cantităţile formate fiind
mai mari la 21°C decât la 32-37°C. Producţia de diacetil
este urmată de reducerea acestuia la acetoină şi 2,3
butilenglicol. Cantitatea de diacetil creşte prin adaos de
citrat, piruvat sau glucoză în mediu de cultură. În culturile
mixte de Str. lactis şi bacterii propionice, producţia de
diacetil se intensifică ca o consecinţă a scăderii pH-ului de
către streptococi. Bacteriile propionice produc şi alte
substanţe care contribuie la aroma brânzeturilor: aldehidă
acetică, aldehidă propionică, alcool etilic, alcool propilic,
dimetilsulfură, acid izovalerianic.
Alte activităţi metabolice Bacteriile propionice pot avea şi
activitate proteolitică şi lipolitică.
Bacteriile propionice pot contribui într-o măsură mai mică
la activitatea proteolitică din brânza Şvaiţer prin enzimele
proteinazice (~12 enzime) şi peptidazice (~ 7 enzime), dar
activitatea proteolitică a bacteriilor propionice este
inferioară bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus,
Str. thermophilus).
Bacteriile propionice pot contribui şi la lipoliza
trigliceridelor, eliberând acizi graşi cu lanţ lung, dar această
activitate lipolitică este nesemnificativă.
DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se înmulţesc prin
înmugurire, mai rar prin sciziparitate şi care formează
ascospori (sunt şi drojdii care nu formează spori, acestea
denumindu-se drojdii/false torule şi micoderme), sunt
agenţi tipici ai fermentaţiei alcoolice.
Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide
(Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces
elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus),
de forma unei lămâi (Saccharomyces apiculans), de forma
unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de
cilindru (Pichia).
Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparţinând
familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care
cuprinde drojdii alcooligene folosite în industria berii,
vinului, pâinii, spirtului, genul Kluyveromices care
fermentează lactoza, genul Debaryomices care se utilizează
în industria cărnii.
Mai interesează drojdiile familiei Cryptococcaceae
(genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca agenţi
de fermentare şi producători de biomasă.
Utilizări ale drojdiilor
1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolică Pentru
fermentaţia alcoolică se folosesc drojdiile adevărate care
aparţin genului Saccharomyces (Meyen) Ress şi care se
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
caracterizează prin aceea că nu formează micelii tipic,
produc 1-4 spori, iar puterea de fermentare depăşeşte
puterea de respiraţie. Sunt adaptate la condiţii de
anaerobioză şi prin urmare nu formează voaluri la
suprafaţă.
După modul de comportare în timpul fermentaţiei drojdiile
pot fi:
• de fermentaţie superioară care se ridică în cantităţi
mari la suprafaţa lichidului de fermentare sub forma unui
strat gros de spumă care se păstrează astfel până la sfârşitul
fermentării. După sedimentare aceste drojdii rar dau un
precipitat dens. Au optim de temperatură la 28…30°C şi
fermentează 1/3 din rafinoză. În categoria drojdiilor de
fermentare superioară se încadrează cele care produc
fermentarea alcoolică în cazul obţinerii alcoolului etilic,
pâinii şi unele suşe pentru bere (Saccharomyces
cerevisiae);
• de fermentaţie inferioară care se dezvoltă în
lichidul fermentat, nu se ridică la suprafaţă în spumă, dar
formează flocoane şi se sedimentează repede. Au optim la
temperatura de 8…12°C şi fermentează complet rafinoza.
Drojdiile de fermentare inferioară se folosesc la obţinerea
berii, vinului, cidrului (Saccharomyces carlsbergensis,
Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini,
Saccharomyces uvarum).
Fermentaţia alcoolică produsă de drojdii este
influenţată de:
- concentraţia zahărului fermentescibil din mediu;
- temperatură ;
- conţinutul în alcool din substrat;
- felul drojdiei.
Concentraţia favorabilă de zahăr fermentescibil este de 10-
15%. Fermentaţia alcoolică se desfăşoară lent la pH 4-4,5,
în mediu alcalin sensul fermentaţiei fiind schimbat.
Viteza maximă de fermentare este la 30°C, dar în practică
se realizează la 4…28°C. Alcoolul pe măsura acumulării în
mediu devine toxic pentru drojdii. Există drojdii care se
dezvoltă la 16-18% alcool (Saccharomyces chevalieri
Guilliermond, Saccharomyces oviformis), însă în cele mai
multe cazuri fermentaţia se opreşte la 12-14%
(Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis,
Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae).
Odată cu creşterea temperaturii de fermentare se măreşte
toxicitatea alcoolului. Fermentaţia alcoolică este un proces
anaerob. Prin trecerea la aerobioză, drojdiile se înmulţesc
rapid şi produc biomasă.
Fermentarea alcoolică nu este o fermentaţie pură. Se mai
formează glicerină ( 8% din totalul zaharurilor existente în
mediu), acid lactic, acid acetic, substanţe acetoinice (acetil
metil carbinol = acetoină şi diacetil), acid malic, acid
succinic, acid propionic, acid citramalic, acid
dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic,
amilic, care provin din aminoacizii rezultaţi la degradarea
substanţelor pectice din musturi şi plămezi.
21
Aceşti alcooli superiori se formează prin reacţii de
dezaminare şi decarboxilare ale aminoacizilor leucină,
izoleucină şi valină.
Fermentaţia alcoolică se aplică la:
• obţinerea alcoolului din produse amidonoase
(cartofi, porumb, secară), produse care conţin zaharoză
(sfeclă, melasă), produse care conţin lactoză (zer), produse
care conţin glucoză (hidrolizate celulozice, leşii sulfitice);
• obţinerea berii şi vinului, cidrului inclusiv cvas din
pâine, rom, whisky;
• obţinerea de băuturi fermentate pe bază de cereale
şi leguminoase;
• obţinerea unor tipuri de produse lactate (chefir);
• obţinerea de băuturi fermentate pe bază de zer.
2. Utilizarea pentru obţinerea de biomasă (s-a menţionat
anterior);
3. Utilizarea în industria cărnii, în care caz se foloseşte
drojdia Debaromyces hansenii care este tolerantă la NaCl,
nu reduce NaNO3 şi necesită oxigen atmosferic pentru
dezvoltare.
Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamurilor
neafumate sau puţin afumate. Această drojdie are
capacitatea de a consuma oxigenul din pastă şi de a
distruge peroxizii produşi de bacteriile lactice. De regulă,
Debaromyces hansenii se foloseşte în combinaţie cu
Staphylococcus carnosus şi Lactobacillus plantarum sau
Staphylococcus xilosus şi Lactobacillus sake. Se consideră
că prin folosirea drojdiei menţionate produsele capătă o
aromă cu totul deosebită.
4. Utilizarea în industria laptelui La fabricarea
brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă la suprafaţa
brânzeturilor dar şi în interiorul brânzeturilor cu pastă
moale sau cu mucegai în pastă în timpul presării, zvântării
şi maturării, având următoarele acţiuni pozitive:
• consumă lactatul şi în acest fel contribuie la
neutralizarea pastei, îmbunătăţind prin aceasta consistenţa
şi favorizând implantarea bacteriilor;
• produc factori de creştere pentru dezvoltarea
bacteriilor;
• produc o peliculă de “acoperire” la anumite tipuri
de brânzeturi;
• produc proteoliză şi lipoliză şi prin urmare
contribuie la consistenţa şi aroma brânzei respective;
• produc compuşi volatili de aromă.
Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivată în asociaţie
cu lactobacili şi Str. thermophilus, favorizând oxidarea
lactatului, scăderea potenţialului de oxidoreducere şi
producerea de factori de creştere, precum şi dezvoltarea
culturilor starter în care este asociată. Drojdia Candida
lipolitica este uneori folosită la fabricarea brânzeturilor cu
mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele
conţinute realizează o hidroliză a lipidelor din brânză, fapt
ce favorizează utilizarea acizilor graşi de către Penicillium
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
în reacţiile de β -oxidare. Drojdia Torulopsis candida
găsită pe brânzeturi se dezvoltă bine în medii acide şi
suportă concentraţii de NaCl până la 10%. Drojdia
Candida kefir şi alte drojdii din granula de chefir realizează
fermentaţia alcoolică în produsul lactat acid dietetic chefir.
Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează
la obţinerea de lactază care are multe utilizări.
Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează
la obţinerea de biomasă prin cultivare aerobă pe zer
(procedeul Bell – Franţa).
Kluyveromices fragilis şi Candida pseudotropicalis se
utilizează pentru obţinerea alcoolului etilic din zer
(procedeul Carbery –Irlanda).
MUCEGAIURILE Pentru industria alimentară interesează
clasa Phycomycetes cu următoarele genuri:
Genul Mucor şi Rhizopus aparţinând familiei
Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se întâlnesc pentru
diferite produse vegetale şi alimentare, sub formă de
colonii pufoase, au o acţiune fermentativă netă.
Specii de Mucor şi Rhizopus se folosesc pentru:
- obţinerea unor produse alimentare fermentate în Orientul
Îndepărtat, pe bază de cereale şi leguminoase;
- în producţia de spirt prin zaharificarea amidonului
(procedeul Amilo care foloseşte Amylomyces rouxi –
Mucor rouxianus);
- în producţia de enzime, în principal amilolitice şi
proteolitice.
Din clasa Ascomycetes interesează ordinul Plectascales cu
genurile Aspergillus şi Penicillium.
Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează în:
- producţia de şuncă în SUA şi Spania (mai puţin);
- obţinerea de produse fermentate tradiţionale în Orientul
Îndepărtat (ceva mai mult);
- obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime
pectolitice.
Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizează în:
- industria brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă şi în pastă
(Penicillium camemberti şi Penicillium roqueforti);
- industria cărnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium
nalgiovensis şi Penicillium exposus);
- obţinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice.
În industria cărnii, culturile de spori de mucegai se
utilizează pentru maturarea unor şunci, care se
însămânţează cu spori de Penicillium netoxicogen, în
special P. nalgiovensis, P. exposum, şi P. chrysogenum,
respectiv Country curred ham şi Jambon Serano, care se
însămânţează cu spori de Aspergillus glaucus şi a unor
tipuri de salamuri crude fabricate în România , Italia,
Ungaria, Elveţia, Spania, Franţa, Bulgaria; Austria, Belgia,
Germania (şi mai puţin în SUA, Israel, Iugoslavia,
Polonia).
22
În cazul salamurilor crude afumate/neafumate,
mucegaiurile de acoperire contribuie la:
- reglarea eliminării apei din produs şi a schimbului de
gaze;
- formarea aromei;
- îmbunătăţirea aspectului comercial al produsului.
Aroma este mai evidentă la salamurile cu diametru mai
mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire
intact sau după “ periere”. Culoarea miceliului rămas este
dependentă de varietatea mucegaiului folosit: alb-ivorie
(preferabilă în Italia); gri (preferabilă în Ungaria); alb-mat
(preferabilă în România).
Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprimă
apariţia la suprafaţa salamurilor a mucegaiurilor
toxicogene, în special a celor producătoare de aflatoxine
precum şi a mucegaiurilor de “pătare” care produc spoturi
de culoare verde sau neagră.
Penicillium nalgiovensis Se utilizează spori de Penicillium
nalgiovensis pentru salamurile crude cu miceliu alb la
suprafaţă. Sporii, în suspensie, se pulverizează la suprafaţa
produselor. După 3-4 zile de la însămânţare se formează
micelii, iar după 5-6 zile de la însămânţare apar corpii de
fructificaţie purtători de conidii. Temperatura optimă de
dezvoltare a mucegaiului este de 22-23°C.
Penicillium nalgiovensis foloseşte ca substrat nutritiv
glucidele dar are şi activitate proteolitică şi lipolitică. Nu
are activitate celulazică şi nu produce micotoxine.
Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22°C şi
umiditatea relativă a aerului este de ~ 82% pentru sporulare
şi ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bună este la ϕ =
92-95%. Sporii pulverizaţi la suprafaţa batoanelor
formează un miceliu pufos în circa 8 zile de la însămânţare,
maturizarea deplină având loc după 30 zile de la
însămânţare. Penicillum expansum nu produce micotoxine
dacă substratul conţine proteine cu sulf (cazul pastei
salamurilor crude).
În industria laptelui culturile de spori de mucegai se
utilizează, aşa cum deja s-a menţionat, la fabricarea
brânzeturilor cu mucegai în pastă cât şi cu mucegai la
suprafaţă (brânzeturi cu pastă moale).
Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (Brânza Roquefort,
Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se utilizează spori de
Penicillium roquefort. Pentru brânzeturile de tip
Camembert se utilizează sporii de la două specii de
Penicillium: P. camemberti şi P. caseicolum.
Mucegaiurile dezvoltate în/pe aceste brânzeturi au rol
fundamental în:
- formarea aromei şi gustului;
- formarea consistenţei;
- definitivarea aspectului, procesele care intervin în
formarea aromei şi consistenţei fiind proteoliza,
lipoliza şi β -oxidarea acizilor graşi.
Suspensiile de spori se pot adăuga/folosi:
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
- în laptele destinat brânzeturilor sau amestecarea cu
coagulul obţinut în cazul brânzei cu mucegai în pastă;
- în laptele destinat fabricării brânzei, sau pulverizare la
suprafaţa brânzei formate în cazul brânzeturilor cu
mucegai la suprafaţă. Mucegaiurile mai importante
pentru industria laptelui sunt:
Penicillium roqueforti Thom se dezvoltă bine la 20-25°C şi
pH 4,5-7,5. Tolerează concentraţii de 5-8% NaCl. Are
activitate proteolitică, lipolitică şi de β -oxidare a acizilor
graşi. Activitatea mucegaiului este stânjenită de prezenţa
acidului propionic în brânză, la concentraţii mari de 30%
CO2 în aerul depozitului. Pentru intensificarea formării
aromei se recomandă ca lipidele din lapte să fie în prealabil
lipolizate cu esterază pregastrică, astfel ca pe măsură ce
mucegaiul sporulează, acizii graşi liberi să fie β -oxidaţi
până la metilcetone. P. roqueforti se dezvoltă în canalele şi
golurile practicate în pasta brânzei, sporii formaţi având
culoare verde închis care conferă brânzei un aspect
marmorat.
Penicillium camemberti şi Penicillium caseicolum Sporii
acestor mucegaiuri se utilizează în producţia brânzeturilor
de tip Camembert incluzând Camembert, Brie, Neufchatel,
Coulommier, Garré de l’Est, Olivet.
Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se
utilizează la brânzeturile tip Camembert cu pastă mai
untoasă, mai parfumată, de culoare gri – alburie.
Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se
utilizează la brânzeturile de tip Camembert cu pasta mai
compactă, o aromă mai delicată, mai discretă şi de culoare
alb – imaculat.
La însămânţare prin pulverizare de spori la suprafaţă a
brânzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se formează miceliile
de mucegai care consumă din aciditatea pastei, consecinţa
fiind creşterea pH-ului începând cu a 12 –a zi, iar după 27
de zile pH-ul rămâne constant.
Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate
endoproteinazică faţă de α - şi β cazeină, dar au şi
activitate exopeptidazică importantă, fiind demonstrat
faptul că atât P. roqueforti cât şi P. camemberti sintetizează
2 endopeptidaze (o metal proteinază şi o aspartil
proteinază) precum şi două exopeptidaze cu acţiune
carboxi- şi aminopeptidazică, activitatea celor două grupe
de enzime fiind relativ echivalentă în stratul de suprafaţă al
brânzeturilor.
Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o
micotoxinâ (acidul ciclopiazonic, dar activitatea toxicogenă
a mucegaiului este aproape nulă la temperatura tehnologică
de maturare a brânzei (14-16°C).
La brânza Camembert se pot utiliza şi spori de Geotricum
candidum care se introduc în lapte. Geotricum reduce
pericolul formării peptidelor amare, inhibă dezvoltarea lui
Penicillium, consumă acidul lactic şi deci contribuie la
neutralizarea pastei, având şi acţiune protolitică şi
lipolitică. Brânza Camembert obţinută din lapte pasteurizat
cu adaos de Geotricum candidum are o aromă
asemănătoare cu cea a brânzei Camembert tradiţionale,
adică fabricată din lapte crud.
23
1.3.2. Culturi starter
Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin
plecând de la o cultură pură stoc şi care prin trecere prin
culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite
pentru producţia unor alimente fermentate. Culturile starter
pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din
mai multe microorganisme.
Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în
vederea:
• dirijării unor procese biochimice prin care se
asigură produsului un anumit grad de inocuitate (inclusiv
capacitatea de conservare);
• asigurării unor însuşiri senzoriale;
• asigurării, în unele cazuri, şi a unor însuşiri
nutritive.
La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie
să se aibă în vedere următoarele:
• să conţină un anumit număr de microorganisme
viabile (g/ml) şi un număr cât mai redus de germeni
nedoriţi;
• produşii metabolici, primari şi secundari, să nu
prezinte pericol pentru sănătatea oamenilor;
• să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se
utilizează în scop terapeutic la oameni;
• să aibă o anumită (anumite) activităţi specifice: de
producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc;
• microorganismele existente în cultură să fie
declarate cu numele ştiinţific întreg;
• speciile (suşele) noi care se introduc în producţie,
trebuie să fie înregistrate la MS şi să fie depozitate în
colecţii cu nomenclator; înainte de utilizare în producţie să
fie testate din punct de vedere al inocuităţii în conformitate
cu legislaţia în vigoare;
• suşele declarate a fi sigure trebuie controlate la
intervale regulate de către institute specializate, în ceea ce
priveşte puritatea lor;
• speciile, care pe baza noilor cunoştinţe ştiinţifice au
fost recunoscute ca având potenţial patogen sau toxicogen,
trebuie să fie supuse unui control riguros pentru fiecare
suşă, realizându-se studii de toxicitate pe termen lung, de
carcinogenitate şi mutagenitate.
Toate cele menţionate trebuie să se constituie ca o
obligativitate absolută deoarece:
• culturile starter se pot consuma în stare vie, odată
cu produsul alimentar, aşa cum este cazul produselor
lactate acide, brânzeturilor, salamurilor şi cârnaţilor cruzi, a
unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varză
murată, castraveţi muraţi, gogonele murate, măsline verzi;
• culturile starter se pot consuma după distrugerea
lor, rămânând în produsul alimentar atât ele cât şi produşii
lor de metabolism, aşa cum este cazul brânzei proaspete de
vaci şi a iaurtului care au fost pasteurizate, brânzeturilor
topite, produselor de panificaţie etc.;
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
• produşii de metabolism ai culturilor starter se
consumă odată cu produsele alimentare, însă
microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, aşa
cum este cazul berii, vinului, alcoolului, oţetului, acidului
citric, acidului lactic etc.
Culturi starter de bacterii lactice
Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite
domenii: industria laptelui, cărnii, produselor vegetale
murate, industria vinului, industria panificaţiei, industria
sucurilor de fructe şi legume fermentate etc.
Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură
produselor alimentare în care se introduc un anumit grad de
inocuitate. Această asigurare este realizată deoarece
bacteriile lactice produc:
• acizi organici, în principal acid lactic, dar şi acid
acetic, alcool, CO2;
• substanţe bacteriocine eliberate în mediul de
cultură;
• peroxizi organici (H2O2).
În plus, bacteriile lactice intră în competiţie cu
microorganismele patogene şi cele de alterare în ceea ce
priveşte consumul de substanţe nutritive, iar datorită şi
acidifierii mediului, consecinţă a acumulării acizilor
organici, bacteriile patogene şi de alterare sunt inhibate în
dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate
stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl.
botulinum etc.
Datorită acidităţii se inhibă şi dezvoltarea microflorei cu
activitate proteolitică şi decarboxilazică, deci se formează
cantităţi mai reduse de amine biogene, iar în cazul
cărnurilor sărate în prezenţă de azotiţi, datorită acidităţii se
favorizează descompunerea mai completă a azotiţilor, deci
scade producţia de nitrozamine, mai ales la produsele care
se supun coacerii şi prăjirii.
Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub
formă de produse lactate dietetice acide sunt benefice
pentru sănătatea oamenilor deoarece:
• aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei ce
produce hidroliza proteinelor, respectiv coagularea cazeinei
laptelui care este în continuare degradată de tripsina
pancreatică;
• aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea
microflorei cu activitate patogenă şi favorizează
implantarea bifidobacteriilor cu consecinţe pozitive pentru
organismul uman (vezi capitolul probiotice).
În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac
următoarele precizări:
- bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram
negative;
- bacteriocinele sunt proteine şi activitatea lor
dispare prin hidroliza lor de către proteaze;
- bacteriocinele au acţiune bactericidă, dar nizina
este şi bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt
bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare;
24
- bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai
mare parte; o mică parte rămân în celulele bacteriene;
- bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura
speciilor şi suşelor producătoare, modalităţile de producere
şi natura lor chimică;
- bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din
culturile starter sau de protecţie au un spectru de acţiune
relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe
suşe ale aceleiaşi specii.
- bacteriocinele sunt sensibile la acţiunea enzimelor
proteolitice metabolice, ceea ce înseamnă că ingerarea de
produse ce conţin bacteriocine nu modifică microbiota
tractului intestinal şi nu va conduce la riscuri în ceea ce
priveşte folosirea de antibiotice comune;
- bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă
în laptele pasteurizat la 63°C/30s minimum sau la 72°C/15
s; rezistenţa lor termică se datorează structurii moleculare
simple (excepţie face helveticina J care are o structură
proteică mai elaborată);
- bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid,
ceea ce înseamnă că sunt adaptate la condiţiile de mediu ale
bacteriilor producătoare;
- eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate
este limitată de condiţiile de conducere a fermentaţiei
(temperatură, pH, aw)
Culturi starter utilizate in industria laptelui
La obţinerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în
mod deosebit următoarele:
- mediul de cultură (laptele);
- tratamentul termic aplicat laptelui;
- condiţiile de incubare;
- interacţiunile dintre speciile/tulpinile din cultura
starter;
- eventualele infectări cu bacteriofagi;
- instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.
De la început, facem precizarea că prin cultură starter
înţelegem culturile obţinute din cultura pură stoc
(inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt
folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smântână,
unt, brânzeturi.
Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria
laptelui pot fi clasificate în mezofile şi termofile.
Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi
clasificate în:
a) Culturi starter singulare (single strain starter) care
conţin numai Str. lactis subsp. lactis şi respectiv Str. lactis
subsp. cremoris (Lactococcus lactis şi Lactococcus
cremoris) ambii homofermentaticvi care produc acid lactic
(L+) în proporţie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter
singulare a apărut ca o necesitate de a se evita formarea
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
“ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri”
formate în urma producerii de CO2 de către bacteriile
aromatizante.
Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele
avantaje:
- se poate utiliza continuu aceeaşi cultură cu
activitate relativ constantă şi previzibilă;
- nu este necesară alternarea culturilor, eliminându-
se riscul deprecierii acestora de către fagi,
- se folosesc cantităţi mai mici de inoculum pentru
obţinerea de cultură primară şi secundară;
- influenţele compoziţionale sezoniere ale laptelui
sunt mai reduse;
- se creează condiţii de realizare a unei producţii
standardizate de produse lactate de calitate superioară;
- cultura poate fi controlată şi supravegheată din
punct de vedere al caracteristicilor sale (sensibilitate la
fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei,
aglutinarea şi eventual lisogenia).
Culturile starter singulare mezofile prezintă însă
următoarele dezavantaje:
- pot fi depreciate de tulpinile producătoare de
bacteriocine;
- pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la
liză fagică;
- pot suferi pierderi de plasmide şi deci pot pierde una sau
mai multe din funcţiile lor.
b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care
se bazează pe folosirea a 5-6 tulpini selecţionate, neînrudite
pe plan fagic şi cultivate separat până la stadiul de cultură
primară sau chiar până la stadiul de cultură starter de
producţie când se amestecă între ele. În aceste condiţii,
tulpinile nu se dezvoltă împreună decât cel mult timp de
10 generaţii, ceea ce face ca nici o tulpină să nu devină
dominantă. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni
în şir fără a-şi pierde capacitatea de acidifiere.
c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt
formate, de regulă, din două tipuri de bacterii lactice:
- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str.
cremoris;
- bacterii lactice producătoare de aromă: Str.
diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sau
specii de leuconostoci.
După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte
mezofile pot fi clasificate în următoarele grupe:
• culturi starter mixte tip L care conţin numai specii
din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris
(citrovorum), Leuconostoc dextranicum şi/sau Leuconostoc
lactis care sunt toţi heterofermentativi şi produc acid lactic
D(-);
• culturi starter mixte de tip D care conţin Str. lactis
biov. diacetilactis ca singură specie producătoare de aromă;
25
• culturi starter mixte tip LD care conţin atât specii
de leuconostoci cât şi Str. lactis subsp. diacetilactis ca
producători de aromă.
La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în
vedere că:
- streptococii acidifianţi mezofili homofermentativi
produc acid lactic din lactoză;
- leuconostocii, cei heterofermentativi, şi Str. lactis
subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc diacetil şi
acetoină din citrat, dar produc şi acid lactic, acetic prin
fermentarea lactozei şi glucozei;
Culturi starter termofile
Culturile starter termofile pot fi:
• acidifiante: Lactobacillus acidophilus;
• acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi
constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili şi
dintr-o specie de streptococi. În această direcţie amintim:
- cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus
bulgaricus şi Str. therrmophilus;
- cultura starter termofilă pentru brânzeturi:
Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis +
Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această
cultură starter se foloseşte la fabricarea brânzeturilor cu
pastă tare şi semitare, deci la care se practică încălzirea a
doua a bobului de coagul.
Utilizarea culturilor starter termofile este benefică
deoarece:
• produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui şi
determină coagularea acestuia (cazul iaurtului); la
brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din
coagul;
• au activitate proteolitică şi prin urmare contribuie
la ameliorarea proprietăţilor reologice şi la aroma
produselor fermentate; ca urmare a activităţii proteolitice
rezultă şi aminoacizi din proteine care stimulează
dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;
• produc şi compuşi de aromă, dar în principal
aldehidă acetică, acetonă, precum şi urme de acetoină;
• produc şi substanţe cu caracter filant care
influenţează vâscozitatea produsului (Str. thermophilus în
cultura pentru iaurt);
• produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei
etc.);
• produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).
Având în vedere cantităţile mari de iaurt ce se fabrică pe
plan mondial, este necesar să cunoaştem factorii care
influenţează performanţa optimă a culturilor pentru iaurt.
Aceşti factori se referă la:
• temperatura de incubare care este de 41-42°C
(apropiată de temperatura optimă de dezvoltare a lui
Lactobacillus bulgaricus ). După 3 ore de incubare se
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus
şi Str. thermophilus fiind 1/1;
• tratamentul laptelui – pasteurizarea influenţează
pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin:
- modificarea structurii proteinelor;
- eliminarea parţială a oxigenului şi realizarea unei
microaerofilii propice;
- distrugerea inhibitorilor din lapte;
- formarea de acid formic care favorizează
dezvoltarea culturii;
• disponibilitatea substratului Laptele este un bun
substrat dar trebuie arătat că Lactobacillus bulgaricus are
preferinţă faţă de glucoză şi deci ar trebui ca lactoza să fie
prehidrolizată la β -galactozidaza;
• metaboliţi produşi în mediu. Lactobacillus
bulgaricus produce H2O2 în mediul de cultură şi deci
adausul de catalază va stimula producţia de acid lactic de
către Str. thermophilus care este mai sensibil la H2O2 decât
Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu
trebuie să fie agitat prea mult ca să nu includă aer (oxigen)
care ar strica condiţiile de microaerofilie pentru L.
bulgaricus şi ar deveni toxic pentru Str. thermophilus.
Lactobacillus bulgaricus se apără de acţiunea oxigenului
prin intermediul manganului intracelular care înlocuieşte
acţiunea superoxiddismutazei;
• interacţiunile dintre bacterii din cultura pură
(inoculum) sau cultura starter. Între cele două
microorganisme există un sinergism deosebit.
Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazeină
care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus care, la
rândul său, favorizează dezvoltarea lui L. bulgaricus prin
producerea de acid formic şi CO2;
• calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta
nu trebuie să conţină antibiotice, substanţe conservante,
dezinfectante şi să provină de la animale sănătoase cu
maximum 400000 leucocite/ml.
Controlul culturilor starter de bacterii lactice
Controlul culturilor starter implică următoarele
determinări:
• examenul microscopic care trebuie să arate raportul
dintre coci şi bacili, raport care trebuie să se situeze în
limitele 1/1-1,5/1;
• activitatea acidifiantă care se urmăreşte prin
determinarea acidităţii titrabile atunci când cultura se află
în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidenţă
culturile “rapide” şi “lente” (fast and slow);
• rezistenţa la aciditate, ţinându-se seama că
Lactobacillus bulgaricus rezistă până la ~ 1,7% aciditate
iar Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistenţa la aciditate
se urmăreşte prin determinarea supravieţuitorilor după ce
în mediul de cultură se atinge o aciditate critică;
26
• rezistenţa la răcire care este importantă pentru
produsele lactate ce se congelează (iaurt, îngheţata de
iaurt). Rezistenţa la răcire se urmăreşte la – 6 ÷ - 9°C şi
apoi la -18°C sau -25°C ;
• producerea de substanţe filante care constă în
măsurarea vâscozităţii pe o probă inoculată de lapte cu
12% s.u., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubată 4 ore/37°C
până ce se atinge un pH de 4,2-4,3. Se pot depista în acest
fel culturile filante;
• activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură
păstrată la 4°C la care se determină tirozina sau aminoacizii
liberi prin metoda formol titrimetrică;
• activitatea lipolitică se poate determina prin
măsurarea indicelui de aciditate din grăsimea culturii
(lapte);
• proprietăţile senzoriale se determină la culturile de
24-48 ore la 20°C (se pot determina şi substanţele de aromă
respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).
CULTURI STARTER CONCENTRATE DE
MICROORGANISME
Definiţie
Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi
dezvoltate în condiţii controlate, concentrate într-un volum
mic şi conservate prin congelare sau uscare în vederea
depozitării şi transportului.
Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de
mucegai. În ceea ce priveşte culturile starter concentrate de
bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii
lactice. Pe lângă acestea se folosesc şi alte culturi de
bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi,
streptomicii, bacterii propionice etc.
Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru:
• obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de
producţie);
• obţinerea produselor fermentate prin utilizare
directă în lapte, compoziţii carnate etc.
Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter
concentrate pot fi obţinute prin două procedee:
• procedeul de cultivare periodică;
• procedeul de cultivare continuă.
Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate
Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii de
bază:
• inocularea mediului de cultură cu microorganismul
din cultura stoc;
• incubare pentru multiplicare la nivel maxim;
• concentrarea mediului împreună cu celulele sau
separarea celulelor, de regulă prin centrifugare şi
resuspendare într-un lichid adecvat,
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
• conservare prin congelare şi uscare;
• depozitare în stare congelată şi uscată.
În tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate
trebuie ales un mediu de cultură care să asigure toate
substanţele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii,
realizându-se un control riguros al temperaturii şi
menţinerii pH-ului la valori optime.
Pentru eventuala neutralizare a acidităţii se utilizează
Avantaje Dezavantaje
• Activitatea culturilor • Necesită spaţii de
poate fi controlată şi depozitare la temperaturi
supravegheată înainte de scăzute atât la producător
expediere cât şi la cumpărător pentru
• Se elimină operaţiile păstrare până la folosire
de întreţinere şi de preparare • Concentrarea nu
a maielelor intermediare este posibilă la toate
(primară, secundară, terţiară) culturile starter
• Se face economie la • Depozitarea în
forţa de muncă stare congelată sau uscată,
• Se pot stabili uşor în funcţie de timp, poate
sistemele de rotaţie în conduce la micşorarea
vederea evitării infecţiei cu drastică a numărului de
bacteriofagi celule viabile
• Se obţin produse de • Culturile pot să fie
calitate mai constantă influenţate negativ în ceea
• Se scurtează ce priveşte unele plasmide
procesele tehnologice ale ce codifică anumite
fabricării produselor prin funcţiuni
accelerarea acidifierii,
deoarece se suprimă faza de
dezvoltare logaritmică în
laptele de fabricaţie
hidroxid de amoniu şi/sau hidroxid de calciu.
Conservarea prin congelare a concentratului de
microorganisme se face în două moduri:
- sub formă lichidă, în care caz, concentratul de
bacterii se suspendă într-un antigel solubil în apă (alcooli
polihidrici) care se utilizează în proporţie de 40-50% faţă
de concentrat. Congelarea se face la -40°C (de fapt se
realizează o subrăcire).
Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje:
• se împiedică acţiunea dăunătoare a gheţii asupra
celulelor de bacterii;
• manipularea concentratului este mai uşoară;
• concentratul se poate încălzi până la temperatura de
utilizare chiar în timpul manipulării fără ca celulele să-şi
piardă viabilitatea şi activitatea;
- congelarea în azot lichid (-196°C) în care caz
concentratul se amestecă cu un agent crioprotector: 10%
glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice.
Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus
ca la concentrat să se adauge agenţi de stabilizare cum ar fi:
glicerolul, lapte praf degresat, extract de malţ,
metalglicerofosfaţi alcalini, glutamat monosodic, acid
glutamic, cistină şi/sau dextran. Amestecul respectiv se
27
introduce în pungi de plastic care se congelează în azot
lichid.
Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:
a) la temperaturi de –20…-40°C;
b) la temperatura de -196°C (în azot lichid);
- conservarea prin reducerea conţinutului de apă
se face prin liofilizare, în care caz concentratul de bacterii
se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat,
lactoproteine pulbere lactoză, zaharoză) după care se
liofilizează. La liofilizare (faza de desicare secundară)
temperatura produsului nu trebuie să depăşească 40-45°C.
După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în
atmosferă de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate
trebuie să se facă la temperaturi scăzute (-18°C).
Culturile starter concentrate trebuie să conţină între 2,5·1010
– 5,5·1010 celule viabile-active/ g sau ml.
Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii
lactice în industria laptelui
Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se
folosesc în industria laptelui sunt acelea destinate:
• pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian şi
elveţian;
• pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.
Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de
bacterii lactice în industria laptelui sunt arătate în tabelul de
mai jos.
Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de
bacterii acterii lactice
Culturi starter concentrate de bacterii propionice
pentru industria laptelui
Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter
concentrate de bacterii propionice poate fi laptele degresat
cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie ca sursă de
vitamine şi factori suplimentari de creştere 1% lactat de
sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de
cultură se ajustează la pH = 7,0 şi se sterilizează.
Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii
propionice din cultura stoc se face la 32°C/3 zile.
Dacă mediul de cultură conţinând bacterii propionice
dezvoltate după incubare se utilizează ca o cultură (maia)
de producţie, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se
opreşte înainte de coagularea laptelui, deoarece în stare de
coagul, cultura starter se repartizează greu în laptele
destinat fabricării brânzeturilor.
Celelalte operaţii de obţinere a culturii starter concentrate
de bacterii propionice sunt aceleaşi ca cele descrise la
celelalte tipuri de culturi starter concentrate.
Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii
propionice se face la 5°C în care caz celulele îşi păstrează
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.
Culturi starter de microorganisme.
viabilitatea şi activitatea 8 săptămâni. Depozitarea la 25°C
poate fi făcută pentru cel mult 2 săptămâni.
Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele
destinat fabricării brânzeturilor (deci nu se mai folosesc
obţinerea de culturi intermediare).
Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii în
industria cărnii
Culturile starter concentrate de bacterii folosite în industria
cărnii pot fi singulare sau în amestec. Ele pot fi formate din
bacterii lactice (L. plantarum, L. sake, L. pentosus, L.
alimentarius), pediococi (P. acidilacti, P. pentosaceus),
stafilococi (S. carnosus, S. xilosus), micrococi (M.
varians), streptomicii (Streptomyces griseus).
În literatura de specialitate sunt menţionate următoarele
culturi starter concentrate de bacterii singulare sau în
amestec:
• S. carnosus
• S. carnosus + P. pentosaceus;
• S. xylosus + P. pentosaceus;
• M. varians;
• M. varians + P. pentosaceus + P. acidilacti;
• M. varians + P. pentosaceus;
• S. carnosus + Streptomyces griseus.
Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt
recomandate la maturarea lentă a salamurilor crude unde se
realizează o scădere lentă a pH-ului şi deci consistenţa
produsului se realizează în timp. Gustul acestor produse
este puţin acrişor (pH 5,6-6,1).
Culturile starter mixte (micrococi/stafilococi/lactobacili) se
utilizează la maturarea rapidă a salamurilor crude în care
caz realizarea consistenţei merge paralel cu acidifierea.
Culturile starter concentrate de utilizare în industria cărnii
pot fi livrate în stare lichidă subrăcită sau uscată. Adaosul
în compoziţie trebuie să asigure o concentraţie de cel puţin
106-107/g pastă. Modul de folosire al culturilor starter
concentrate este în funcţie de modul lor de conservare.
Cele congelate în antigel se utilizează ca atare; cele
liofilizate se suspend în apă pentru o distribuţie mai
uniformă în compoziţie.
Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru
industria cărnii nu se amestecă cu sare, condimente, acid
ascorbic, acizi alimentari şi nici nu se păstrează în amestec
cu substanţele menţionate deoarece se inactivează rapid.
De asemenea trebuie să se aibă în vedere două situaţii
particulare:
• Folosirea culturilor starter concentrate în pasta cu
adaos de GDL (glucono delta lactona). În condiţiile
folosirii GDL pH-ul pastei scade rapid, proteinele sunt
aduse la pH izolelectric şi pierd apa de hidratare, azotitul
de reduce bine la NO, se favorizează dezvoltarea bacteriilor
lactice care produc şi H2O2. Acidifierea rapidă împiedică
însă dezvoltarea micrococilor care sunt necesari dacă se
lucrează cu NaNO3. La folosirea GDL este deci recomandat
să se folosească culturi starter concentrate de stafilococi
care produc catalază, reduc azotatul la azotit şi se pot
dezvolta la pH 4,7 fiind şi un bun producător de aromă;
28
• Folosirea culturilor starter în pasta cu adaos de
uleiuri eterice. Aceste uleiuri eterice au acţiune
bacteriostatică, mai ales dacă solventul lor este şi alcoolul
etilic şi, deci, inhibă culturile starter. În acest caz se
recomandă să se folosească o cantitate mult mai mare de
cultură starter, pe de altă parte uleiurile eterice să fie
încapsulate.
Culturile starter concentrate folosite în industria cărnii
trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să fie tolerante la NaCl (concentraţie 2,5-3%);
- să se dezvolte bine în saramura de concentraţie 6%;
- să se dezvolte bine în prezenţă de 80-100 mg
NaNO2/kg compoziţie dar să acţioneze şi la temperatură
mai scăzută (14-24°C);
- să producă numai acid lactic (culturile starter
concentrate de bacterii lactice să cuprindă numai specii
homofermentative);
- să fie puţin lipolitice şi proteolitice;
- să nu producă mirosuri şi gusturi nedorite din cauza
produşilor secundari de metabolism;
- să fie nepatogene (să nu producă infecţii şi să nu
producă toxine);
- să se adapteze compoziţiei de carne utilizată şi
condiţiilor de fermentare a produselor, respectiv la
creşterea concentraţiei de NaCl, la temperatura de afumare
rece şi de uscare, de activitate a apei care scade progresiv
pe măsura uscării produsului;
- să producă catalază şi nitratreductază (cele cu
micrococi, streptomicii, stafilococi);
- să fie inactivate la 57-60°C.
Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii (în
special lactice şi pediococi) prezintă următoarele avantaje:
- se micşorează durata de maturare a produselor
carnate;
- se îmbunătăţesc proprietăţile senzoriale (gust,
miros, consistenţă);
- se asigură un grad înalt de inocuitate produsului
carnat (salamurile şi cârnaţi cruzi) prin controlul dezvoltării
microorganismelor patogene şi de alterare şi prin limitarea
folosirii unor substanţe cu caracter toxic (amine şi
nitrozamine).
Lactobacilii din culturile starter concentrate produc în
compoziţia salamurilor crude următoarele efecte:
• acidifierea pastei cu următoarele consecinţe:
- scăderea pH-ului şi deci aducerea proteinelor la
punctul izoelectric deci şi la starea de hidratare minimă,
favorizându-se în acest fel uscarea;
- reducerea mai rapidă şi mai completă a NaNO2;
Capitolul 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. 29
Culturi starter de microorganisme.
- inhibarea microorganismelor patogene:
Staphilococcus aureus, Salmonella, Cl. botulinum;
• producerea de substanţe de aromă;
• controlul producţiei de amine biogene prin
inhibarea bacteriilor cu activitate decarboxilazică (inhibare
prin competiţie faţă de nutrienţi şi, respectiv, prin
acidifiere);
• controlul producţiei de nitrozamine (aciditate
formată, respectiv pH-ul scăzut favorizează transformarea
NaNO2 în NO şi deci rămâne în produs o cantitate mai
mică de NaNO2 care ar putea intra în combinaţie cu
aminele secundare pentru a forma nitrozaminele;
• controlul microflorei de alterare şi patogene prin
producţia de H2O2, bacteriocine.
Pediococii din culturile starter concentrate produc în
compoziţia salamurilor crude următoarele efecte:
• acidifierea mai redusă a pastei la temperaturi mai
ridicate fără formarea de produşi care să afecteze negativ
gustul şi mirosul;
• producerea de H2O2, bacteriocine cu acţiune
inhibitoare faţă de microorganismele patogene.
Culturi starter concentrate de spori de mucegai
Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii:
• prepararea mediului de cultură, sterilizarea acestuia
şi repartizarea în eprubete (agar înclinat);
• însămânţarea mediului în eprubete cu spori de
mucegai ce se doreşte a se cultiva;
• termostatare pentru germinare spori cu organe
purtătoare de spori şi sporulare;
• preluare spori cu 2 ml ser fiziologic 0,8% şi
însămânţare medii de cultură Czapek cu 2% agar aflate în
vase Roux;
• recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic
0,8% astfel ca să se asigure în suspensie 108-1010 spori/ml;
• păstrare suspensie la 0-4°C.
Cultura cu spori de mucegai concentrată poate fi livrată şi
sub formă de emulsie liofilizată, emulgatorul fiind
polietilsorbitanul .
Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu
mucegaiurile utilizate în industria laptelui şi cărnii,
utilizarea lor fiind în funcţie de produsul alimentar în care
se foloseşte cultura respectivă de spori de mucegai.
Pentru industria cărnii, la utilizare suspensia de spori de
mucegai concentrată se diluează cu apă fiartă şi răcită în
raport de 1/3.