Microbiologia 1/3/2010

Prof.ssa Fusi

VIROLOGIA
Il termine virus deriva dal termine latino veleno.
I virus sono oggetto di studio per vari motivi:
• possono causare delle malattie infettive;
• alcuni causano il cancro;
• sono importanti sopratutto perché vengono studiati e utilizzati per produrre vaccini
antivirali;
• negli ultimi anni sono molto utili perché possono essere usati come vettori ( ad esempio
vettori di antigeni o di sequenze particolari) nel campo della produzione dei vaccini, della
prevenzione e nel campo della terapia genica (terapia che nella medicina moderna è adottata
per curare malattie rare o malattie che hanno base genetica. I virus vengono utilizzati come
vettori di sequenze geniche che possono essere introdotti in un organismo e favorire
l'espressione di un gene che nell'individuo ospite era mutato o deficiente).

SCOPERTA VIRUS
• 1892 Ivanovsky scoprì il virus del mosaico del tabacco; si accorse che le foglie delle piante
di tabacco avevano una forma strana, una malattia strana e si accorse che era dovuta ad un
tipo di virus;
• 1898 fu scoperto che un agente della sindrome “mani-piedi” (tipo di malattia che colpisce
spesso i bambini) era filtrabile, cioè attraverso dei sistemi di sterilizzazione artigianali in cui
si faceva uso di particolari filtri, si accorsero che l'agente che provocava questa malattia
passava attraverso il filtro mentre i batteri rimanevano intrappolati;
• 1901 virus della febbre gialla (primo virus scoperto);
• 1915 scoperti i batteriofagi (virus che infettano i batteri, sono molti importanti nella genetica
batterica dove è presente un meccanismo di trasmissione genetica mediato dai batteriofagi)
• 1933 fu scoperto il virus dell'influenza (abbastanza dopo la grande pandemia che colpi la
popolazione umana nella prima guerra mondiale cioè la spagnola).

Virus
Sono parassiti intracellulari obbligati poiché vivono e si replicano unicamente nella cellula (un
concetto chiave dei virus è che questi sono agenti piccoli che si replicano solo nell'ospite e non nel
brodo di coltura che è il terreno liquido dove crescono i batteri).
Il loro genoma è costituito solamente o da DNA o da RNA e non da entrambi. Questa caratteristica
li rende dei parassiti endocellulari obbligati. All'interno della cellula il genoma si replica e dirige la
sintesi di componenti virali sfruttando il sistema cellulare.
La traduzione delle proteine avviene al livello del RE, la glicosilazione avviene al livello del Golgi.
Il virus non avendo queste strutture nella sua composizione è obbligato ad utilizzare quelle della
cellula. I virioni (cioè la progenie virale) che si formano dopo la replica del virus, sono numerosi e
si trovano all'interno della cellula. Vengono poi espulsi da questa avviando un nuovo ciclo infettivo.
Dal punto di vista del genoma i virus sono gli agenti biologici che hanno il genoma più piccolo.
Ad esempio i Circovirus sono costituiti soltanto da 1700 paia di basi mentre i batteri hanno circa
4.700.000, il genoma umano raggiunge invece l'ordine dei miliardi.
Questo è un motivo in più che spiega il perché un virus possa crescere soltanto all'interno della
cellula, in quanto il suo genoma non ha abbastanza codici per sopravvivere senza una cellula.
Per quanto riguarda le dimensioni bisogna dire che già il batterio è più piccolo di un nucleo
cellulare. L'ordine di grandezza dei virus è nell'ordine dei nanometri (100 nm, 70 nm, ma anche più
piccoli come il Parvovirus 20 nm). La grandezza di una cellula eucariotuica è di 10.000 nm.
MORFOLOGIA
Al microscopio elettronico si possono osservare questi parassiti poiché si raggiungono grandezze
nell'ordine dei nanometri mentre questo non è possibile al microscopio ottico.

I virus hanno una morfologia varia:

• cilindrica ( ex. Virus del tabacco). L'acido nucleico si trova all'interno di una struttura
proteica (sembra essere fatta da tanti fagioli e ogni fagiolo rappresenta una proteina). Quindi
le proteine del virus rivestono e proteggono l'acido nucleico;

• Icosaedrica (struttura solida costituita da 20 facce triangolari). Costituito da sferule e ognuna

rappresenta una proteina Le proteine proteggono e rivestono l'acido nucleico (ex
Adenovirus);

• Isometrica (tondeggiante all'incirca). Ha delle spicole all'esterno (rappresentate dalle

glicoproteine) e l'acido nucleico all'interno. Quindi il genoma virale risulta sempre rivestito
da proteine.

• Una morfologia dei batteriofagi (batteriofago T4, quello più complesso). Ci sono anche
batteriofagi costituiti da un filamento genomico rivestito da proteine. Quella del T4 è la
forma classica e presenta:

1. Testa, rivestita da proteine all'interno della quale si trova l'acido nucleico;

2. Collare;
3. Coda contrattile a cui sono associate delle fibre. Queste fibre servono per attaccarsi ai
recettori della parete batterica, in seguito all'attacco con i recettori la coda si contrae come
una molla e dalla testa parte, come se fosse sparato, l'acido nucleico che entra dentro il
batterio.

In laboratorio il virus cresce su colture cellulari e queste crescono in uno strato su vari recipienti di
plastica a 37° C (temperatura ottimale per la crescita cellulare).
Quando il virus viene cresciuto sulle colture cellulari, nella maggior parte dei casi, dà un effetto
citopatico (cioè un effetto di danneggiamento sulle cellule che permette di evidenziare la presenza
di un virus).
Un tipo di diagnosi di virologia classica si basa proprio su questo fenomeno cioè, il campione
biologico viene cresciuto su colture cellulari che giornalmente vengono analizzate al microscopio
ottico. Si va a vedere se la morfologia cellulare è sempre la stessa o meno. Se la morfologia è
sempre la stessa si deduce che non vi è la presenza di un virus, se inveci si evidenzia un effetto
citopatico allora è probabile la presenza di un virus.

STRUTTURA
Il virus presenta proteine, acido nucleico e in alcuni casi envelope.
Proteine
• strutturali: costituiscono la struttura del virus (ad esempio quelle che costituiscono il
capside)
• di membrana: sono proteine che di solito riconoscono il recettore. Il virus non si attacca a
tutte le cellule ma solo a quelle che hanno uno specifico recettore. I virus hanno uno spettro
d'ospite ben delimitato. Esempio di proteine di memebrana sono le spicole che fuoriescono
dal pericapside.
• enzimi: in particolare quelle proteine che hanno attività polimerasica utili per la replica e per
la trascrizione del virus.
Envelope o pericapside
Struttura di natura lipidica di derivazione cellulare. Quando il virus infetta cellula deve poi
fuoriuscire e alcuni virus nell'uscire si portano dietro porzioni di membrana. Questa membrana può
derivare dalla:
- membrana plasmatica;
- membrana nucleare;
- membrana del Golgi.

CLASSIFICAZIONE
Ci sono vari sistemi di classificazione del virus che si possono basare su:
• natura del genoma del virione (DNA o RNA);
• simmetria del capside (involucro proteico che ricopre e protegge l'acido nucleico virale);
• presenza o meno di envelope o pericapside (membrana che contiene proteine e glicoproteine
virali che si trova esternamente al capside);
• dimensioni del virione.

Parlando di classificazione virale si deve definire la famiglia, il genere e gruppi del genere mentre
in batteriologia si parla di specie.
Il pericapside risulta comunque diverso per costituzione di base dalla membrana cellulare perché è
arricchito di proteine virali.

Classificazione virus a DNA:

In base al criterio di classificazione si guarda in ordine cronologico:
• simmetria del capside che nel caso di virus a DNA può essere icosaedrica oppure molto
complessa;
• presenza o meno di envelope, se manca il pericapside il virus viene definito nudo o
naked??? mentre se è presente viene detto vestito;
• architettura genomica, tutti i virus a DNA hanno doppio filamento ad eccezione dei
parvovirus (che sono quelli più piccoli) che hanno genoma a singolo filamento;
• struttura dell'acido nucleico, il DNA può essere o circolare o lineare (ad esempio i Coxvirus
hanno le estremità del genoma legate covalentemente per cui il genoma risulta circolare).

Esiste una classificazione di Baltimore che è quella classica.

Herpesvirus, Adenovirus, Papillomavirus, Coxvirus, virus dell'epatite b e i parvovirus sono tutti
virus a genoma a DNA.
Nella classificazione dei virus sono presenti anche delle classi indicative ma la prof ha detto che
non è importante ricordarsele, l’importante è sapere se un virus è a DNA o a RNA.

Classificazione virus a RNA:

Sono molti di più rispetto a quelli a DNA.
• simmetria del capside che può essere o icosaedrica o elicoidale;
• presenza o meno di envelope;
• architettura genomica, sono tutti a singolo filamento, esiste solo una famiglia con RNA a
doppia elica che è quella dei Reoviridae;
• struttura dell’acido nucleico, l’RNA può essere o a polarità positiva o negativa.

RNA positivo e negativo:

L’RNA positivo ha la stessa polarità dell'RNA messaggero mentre il negativo sarà il suo
complementare.
Famiglie di virus a RNA a polarità positiva: Picornaviridae, Togaviridae, Retroviridae (retrovirus a
cui appartiene anche il virus HIV)
Famiglie di virus a RNA a polarità negativa: Rhabdovirus (virus della rabbia), Orthomyxovirus
(virus dell'influenza).

Capsomeri: strutture proteiche che vanno a costituire il capside e sono proteine strutturali.

Morfologia di alcuni virus:

Adenovirus: icosaedrico.
Papillomavirus: rotondeggianti, isometrici.
Parvovirus: rotondeggianti, isometrici ma molto piccoli.
Morbillivirus (virus del morbillo): struttura pleomorfa (cioè non ben definita).
Toxvirus (quelli del virus vaccinico quello del vaiolo???): struttura complessa e un po' particolare.

Nella morfologia icosaedrica si nota che a secondo del punto di osservazione potremmo
visualizzare degli assi di rotazione diversi.
Ad esempio se si prende in considerazione un vertice avremo 5 assi di simmetria, se si prende in
considerazione uno dei lati gli assi di simmetria sono 2, 3 se si prende in considerazione la faccia
triangolare. Questo significa che ci sono dei calcoli matematici che permettono di poter valutare gli
assi di simmetria dei virioni e dei capsidi e in questo modo calcolare il numero dei capsomeri che
costituiscono un capside.
Queste proteine sulla superficie del capside possono assumere delle forme diverse; ad esempio le
proteine che si trovano al vertice di un icosaedro si possono unire in numero di 5 proteine dello
stesso tipo, questa struttura capsumerica si definisce pentone in quanto è costituito da 5
proteine/capsomeri uguali.
Nel caso delle proteine che rivestono la faccia triangolare, queste si raccolgono in gruppi di 6 e si
chiamano esoni.
Di solito le proteine che costituiscono il capside sono pochissime , cioè sono pochissime unità
monomeriche ripetute. Possono essere 2, 3, 4 al massimo e poche di più nel caso si tratti di virus
grandi. Questo si spiega con il fatto che il genoma del virus è piccolo, quindi non ha tantissime
sequenze disponibili per la codificazione di molte proteine diverse.
Bisogna tenere sempre presente che il genoma del virus è piuttosto limitato, quindi è necessario per
il virus adottare una politica di risparmio. Tutto quello che il virus produce è fatto per permettere al
virus stesso di sopravvivere e replicarsi.

Tornando alla simmetria c'è anche quella ad elica come nel caso del virus della rabbia
(Rhabdovirus), questa simmetria viene detta anche a polie????? perché i capsomeri si ritrovano
all'esterno di questa struttura e ricoprono l'acido nucleico che si trova all'interno.

Adenovirus (in maniera schematica):

Sulla superficie gli esoni vanno a ricoprire la faccia triangolare dell'icosaedro mentre i pentoni si
trovano ai vertici. L'adenovirus è particolare, presenta delle fibre che sono delle strutture lunghe,
assiali, che partono dai vertici (cioè dalla base del pentone), necessarie per l'attacco del virus al
recettore specifico.
Vaxiniavarius:
Sarebbe tipo il virus del vaiolo, è l'unico che ha una struttura complessa e sembra quasi una cozza
con due corpi laterali e un genoma abbastanza grande. Ci sono all'interno del nucleocapside anche
degli enzimi virali necessari per la replica del virus e presenta anche una membrana interna e una
esterna.

PROTEINE AD ATTIVITA’ ENZIMATICA

Alcuni virus hanno enzimi che intervengono nell'interazione virus-cellula ospite (cioè o nell'attacco
o nel distacco tra virus e cellula ospite).
Ad esempio la neuroaminidasi (proteina del virus dell'influenza).
Tra queste proteine bisogna anche ricordare tutti quegli enzimi necessari per la replica del virus:
• RNA polimerasi DNA-dipendente;
• RNA polimerasi RNA-dipendente (si trova solo nei virus);
• trascrittasi inversa ( è una DNA polimerasi RNA-dipendente che scrive un filamento di
DNA su uno stampo di RNA);
• enzimi che servono per la replica e il processamento dell'acido nucleico;
• proteinchinasi che fosforilano altre proteine.
• enzimi che servono per bloccare alcune attività specifiche della cellula.

COME IL VIRUS INFETTA LA CELLULA

Le fasi della replica sono:
• adsorbimento;
• penetrazione;
• uncoating (svestimento, cioè la liberazione dall'involucro);
• trasduzione e traduzione;
• replica genoma;
• assemblaggio;
• rilascio.

Adsorbimento
Significa attacco del virus alla cellula. Il virus si attacca a recettori specifici tramite le proteine che
sono presenti o nel capside (nel caso si tratti di virus nudo) o nel pericapside (nel caso si tratti di un
virus rivestito). Quindi ci sono delle glicoproteine o delle proteine virali che si attaccano al recettore
specifico.
I virus hanno uno spettro d'ospite ben definito, cioè si attaccano in maniera specifica ai recettori e
non in maniera casuale.
Esempi:
- Poliovirus della famiglia picornavirus, virus che provoca la poliomelite. Ha una forma che sembra
icosaedrica, è piccolo, nudo. Le proteine che rivestono il virus hanno la capacità di attaccarsi ad
alcuni recettori specifici presenti sulla membrana. Nell'attacco si ha una specie di endocitosi per cui
il virus può essere introdotto all'interno.
In dettaglio le proteine VP1, VP2, VP3 che sono delle proteine strutturali del capside virale,
interagiscono con il recettore e aprono un varco all'interno della membrana citoplasmatica
attraverso cui l'acido nucleico fuoriesce dal virione e entra nel citoplasma.
- virus dell'influenza (famiglia orthomyxoviridae) presenta il pericapside. Il virus si attacca ai
recettori dell'acido sialico sulla membrana citoplasmatica. In realtà i recettori dell'acido sialico sono
presenti in moltissime cellule per cui di principio questo virus potrebbe attaccarsi a quasi tutti i tipi
cellulari. Il virus entra per coalescenza??? all'interno della cellula e attraverso una fagocitosi entra
in un endosoma (membrana citoplasmatica che riveste il virus nel momento in cui è entrato, si ha un
endocitosi che porta il virus a trovarsi all'interno dell'endosoma). In un ambiente acido la fusione
dell'envelope del virus con la membrana citoplasmatica viene favorita per cui il virione si fonde con
la membrana citoplasmatica e il genoma all'interno del virus fuoriesce nel citoplasma.

- HIV presneta due proteine di membrana dell'envelope, la GP120 e la GP41, implicate nell’attacco
del virus alla cellula bersaglio e nella penetrazione. La GP120 serve per il riconoscimento del
recettore che è il CD4 (recettore presente sui linfociti T). Il CD4 riconosce la GP120 grazie anche
alla presenza del co-recettore CCR 5. quindi talvolta è necessario per il riconoscimento del recettore
da parte del virus di un co-recettore. La presenza di un co-recettore serve a rendere ancora più
limitato il campo dello spettro d'ospite.
Nel momento in cui la GP120 si attacca al CD4 e riconosce il co-recettore, la proteina GP41
(proteina di fusione) cambia morfologia e favorisce un cambiamento conformazionale per cui la
GP120 si apre e permette il passaggio dell'acido nucleico dall'interno del virus all'interno della
cellula.
Ricapitolando la GP120 si attacca al recettore mentre la GP41 favorisce il cambiamento
conformazionale della GP120 favorendo la fusione dell'envelope virale con la membrana
citoplasmatica, questo provoca l’apertura di un varco attraverso cui può passare il genoma virale
all'interno della cellula.

Alcuni recettori virali:

• Poliovirus: la cellula bersaglio è la cellula epiteliale, i recettori sono proteine appartenenti
alla superfamiglia delle immunoglobuline;
• virus dell'influenza: recettori contenenti acido sialico;
• HIV: CD4 e co-recettori;
• Epstein-Barr virus (virus che provoca la mononucleosi infettiva): recettore del complemento
CD3 (il complemento è un sistema proteico multifattoriale presente nel sangue in circolo
che svolge un ruolo importante nella difesa contro le infezioni).

Penetrazione
Entrata dell'acido nucleico all'interno della cellula.
Può essere attuata in maniera diversa a seconda del virus, in particolare differisce tra virus nudo e
virus con envelope.
Nel caso di virus nudo si ha un fenomeno di endocitosi, cioè invasione del virus dopo che questi si è
attaccato al recettore.
Nel caso di un virus con envelope si ha una fusione tra envelope e membrana citoplasmatica
cellulare che favorisce l'entrata del nucleocapside all'interno della cellula.

Uncoating
Il genoma si deve liberare delle proteine che lo rivestono per potersi replicare.

Assemblaggio
Consiste nell’assemblaggio dei nuovi genomi virali, delle proteine virali neo-formate all'interno
della cellula, e nella formazione di tanti virioni. Da un virione si possono ottenere milioni di virioni.
Termonato l’assemblaggio il virione deve fuoriuscire dalla cellula.

Fuoriuscita
E’ differente a seconda che si tratti di un virus nudo o di un virus dotato di pericapside.
Se si tratta di un virus nudo di solito si ha lisi cellulare e i virioni fuoriescono dalla cellula.
Nel caso di virus con envelope i virioni devono prendere dalla cellula una parte di membrana che
può essere citoplasmatica o nucleare o del Golgi a seconda del virus in questione.
Il virione con il capside virale si avvicina a una di queste membrane per un processo opposto
all'endocitosi e alla fagocitosi, detto gemmazione. In questo modo il virus fuoriesce acquisendo
come envelope la membrana della cellula ospite con le proteine virali.

BATTERIOFAGI (alcune nozioni essenziali)

Sono virus di batteri. Possono provocare o un ciclo litico o un ciclo lisogeno.
Il ciclo litico è mediato da un fago detto virulento. Il batteriofago specifico per una cellula batterica
la infetta e viene rilasciato in seguito a lisi cellulare.
Il batteriofago (in questo caso il T4) si attacca alla cellula batterica (a recettori della parete
batterica) attraverso la coda (dotata di fibre), si contrae la coda e l'acido nucleico viene immesso
nella cellula batterica.
In seguito quando il genoma a DNA del batterio verrà trascritto, le proteine fagiche verranno
prodotte, si avrà l'assemblaggio (cioè l'acido nucleico sarà rivestito dalle proteine del fago), si
formeranno tanti piccoli fagi all'interno della cellula batterica. Una volta che la cellula si è riempita
di batteriofagi lisa e i batteriofagi fuoriescono.
Il ciclo lisogeno è invece mediato da fago temperato (cioè è più buono) non lisa immediatamente la
cellula ma riesce a sopravvivere all'interno della cellula batterica perché il suo genoma si integra
con il genoma cellulare.
Questo fago trasporta una parte del suo genoma nella cellula batterica, questo fa si che la cellula
batterica puossa produrre delle proteine che non self ma proprie del fago. Il fago integrato nella
cellula batterica è detto profago.
Nel caso in cui abbiamo un fago temperato il fago si attacca e inietta il suo DNA. Questo DNA di
solito circolarizza e attraverso un meccanismo di crossing-over si integra all'interno del genoma
batterico. Questo fa si che quando la cellula batterica si divide otterrà anche il genoma del fago.
Quando il fago è integrato all'interno della cellula batterica si può avere la produzione di alcune
proteine che caratterizzano la cellula batterica ospite.
Il fago temperato è detto silente (NON SO SICURO) perché produce delle proteine che fanno tacere
l'espressione delle altre proteine del fago che magari indurrebbero il ciclo litico.
Quando c'è la fase lisogena ci possono essere alcuni elementi dell'ambiente esterno che posso
favorire il ciclo litico. Infatti quando una cellula batterica contiene all'interno il profago è possibile
comunque indurre in questa anche un ciclo litico con particolari meccanismi o con particolari
reattivi.

REPLICA DI ALCUNI VIRUS A DNA

I virus a DNA hanno tutti doppio filamento tranne i Parvovirus.
A doppio filamento la replica avviene come quella del DNA di una cellula eucariotica.
L’apparato di replicazione necessita di:
• proteine destabilizzanti che favoriscono l'apertura del doppio filamento;
• DNA polimerasi DNA-dipendente cellulare che il virus sfrutta per sintetizzare in direzione
5'-3' il DNA;
• ligasi.
Si apre la forcina e la polimerasi inizia ad attaccare ai primer dei nucleotidi complementari al
filamento parentale, poi intervengono le ligasi che attaccano i frammenti di okazaki via via
sintetizzati. In seguito a vari cicli replicativi si accumulano all'interno della cellula numerosi
filamenti genomici a doppio filamento di DNA virale.
Nel momento in cui la cellula è piena di questi genomi avverrà l'assemblaggio con le proteine
strutturali e poi la fuoriuscita dei virioni verso l'esterno.
In più questi virus utilizzeranno anche una RNA polimerasi DNA-dipendente per trascrivere RNA
necessari per produrre proteine virali.
ESEMPI:
- nel caso dell'Herpesvirus (classico virus a DNA a doppio filamento lineare) si vedranno espressi
dei geni a blocchi cioè, prima verranno espressi i geni alfa, poi i beta e poi i gamma. Questo perché
il tipo di trascrizione dei messaggeri avverrà in tempi diversi: geni alfa produrranno messaggeri e
quindi proteine dette precoci (proteine prodotte all'inizio dell'infezione cellulare, sono quelle che
saranno necessarie soprattutto per la fase di replica del virus, e poi delle proteine che bloccheranno
degli apparati sintetici cellulari). Le proteine alfa che hanno attività enzimatica tipo polimerasi di
acidi nucleici e quindi serviranno a loro volta per trascrivere i geni beta (geni intermedi). Poi ci
sono i geni tardivi che sono i gamma e questi trascrivono dei messaggeri che produrranno proteine
strutturali.
Quindi nel caso dei virus herpetici avremo un tipo di replica genomica a tre tappe (geni alfa, beta ,
gamma). Parlando invece dei prodotti di questi geni, le diverse proteine verranno dette: immediate
early, early, late.
- il Papillomavirus è a doppio filamento di DNA ma circola.
- il Poxvirus (virus del vaiolo) ha struttura complessa e ha le estremità legate covalentemente quindi
è in forma circolare.