Jurnal Mikrobiologi Indonesia, September 2005, him. 75-78 Vol. 10, No.

2
ISSN0853-358X

Dinamika Populasi Acetobacter Selama Proses Fermentasi

Nata de Coco
Pqpulation Dynamics ofAcetobacterDuring
Nata de Coco Fermentation
CECILlA A. SEUMAHU'j, ANTONIUS SUWANT02' & MAGGY T. SUHARTON03

'Program Pascasnrjana Bioteknologi, Instilul Pertnnian Bogor, Knmpus Darmngn, Bogor 16680
'Deportemen BioIogi, FMIPA, Instilul Pertaninn Bogor, Jnlnn Rayn Pnjnjaran, Bogor I6144
IDepartemen Teknologi Pnngpn dnn Gizi, InslitnlPertnninn Bogor, Knmpus Dnrmngn, Bogor 16680

One of the important problems in traditional nara de coco (nala) fermentation is production inconsistency due to
strain composition. This research was aimed to examine population dynamics o f Acefobacler community during
fermentation processes. We also examined genetic diversity of Acelobocfer xylinum strains employing pulsedfield gel
electrophoresis. Samples were collected everyday f o r six days from fermentation media derived from "good"
and "bad" natn fermentation. We compared the levels of bacterial community diversity through amplified ribosomal
DNA restriction analysis (ARDRA). DNA was extracted directly from fermentation media. The amplicons were cloned
into pGEM-T Easy vector, and restriction enzymes HneIII and RsnI were used to generate ARDRA profiles. 16s-rRNA
gene from single colony was amplified employing specific Acefobacler primers. Phylotype profiles demonstrated
unique Acerobocter community profiles for different condition of nafa quality. The dynamics of Acelobocfer population
involved in noln fermentation are crucial factor for determining traditional nala quality.

Key words: nata de coco, bacterial community dynamics, ARDRA, Acetobacterxylinum

Dinamika dan aktivitas komunitas bakteri selama produksi
keju dan fermentasi sour cassava telah dipelajari dan ditemukan
adanya perubahan dinamika populasi mikroorganisme selama
proses fermentasi (Ampe et al. 2001; Randazzo et al. 2002).
Dinamika populasi mikroorganisme ini dipelajari untuk melihat
peranan masing-masing mikroorganisme dalam proses
fermentasi sehingga dapat dirancang suatu kultur starter yang
cukup baik. Keberadaan mikroorganisme ini akan
mempengaruhi kualitas hasil fermentasinya. Marsh et al. (2000)
menyatakan bahwa dinamikapopulasi perlu dipahami melalui
analisis komunitas untuk memahami struktur dan fungsi suatu
komunitas. Analisis komunitas memberi peluang untuk
mengidentifikasi galur-galur tertentu yang unik dan dominan
dalam lingkungan yang terkontrol.
Kendala yang dibadapi dalam mempelajari komunitas
mikroorganisme pada makanan ialah sulitnya mengultivasi
miboorganisme tersebut pada media standar laboratorium dan
ha1 ini menjadi penyebab sangat sedikitnya bakteri yang
teramati dari bahan makanan. Padahal keragaman
mikroorganisme karma adanya tekanan proses pengolahan
makanan itu sendiri tinggi (Giraffa & Neviani 2001). Proses
fermentasi nata de coco (nata) saat ini belum banyak dipelajari
dan dipahami, padahal proses tersebut memiliki aspek yang
tAlamat kini: FMIPA, Universitas Pattimura, Jalan Ir. M. Putuhena,
Kampus Poka, Ambon 97233
'Penulis untuk korespondensi, TelFax. +62-251-315107,
E-mail: asuwanto@indo.net.id
cukup menarik dan penting dari aspek komersial maupun
penelitian dasar untuk dikaji. Kondisi medianya bersifat sangat
asam (pH 2-3) sehingga tidak semua bakteri dapat dikulturkan.
Ampe et al. (1999) menyatakan teknik yang tidak bergantung
pada proses kultivasi, dapat menggambarkandinamikapopulasi
secara lebii baik. Amplilikasigen yangmenyandikan 16s rRNA,
kloning, dan sekuensing mempakan salah satu metode untuk
mengidentifkasi mikroorganisme tanpa harus mengulturkan
(Weisburg et a[. 1991).
Penelitian ini bertujuan mengetahui dinamika keragaman
populasi bakteri selama proses fermentasi nata menggunakan
teknik amplified ribosomal DNA restriction analysis
(ARDRA). Keragaman di antara galurA.xylinum sampai saat
ini belum pernah dilaporkan. Keragaman galur A. xylinum
dianalisis menggunakan teknikpulsedfieldgel electrophoresis
(PFGE) (Suwanto 1994) untuk memberikan gambaran skisotipe
masing-masing galur secara lebih spesifik.
BAHAN DAN METODE
Bahan. Sampel berupa cairan media fermentasi nata dari
proses fermentasi dengan hasil yang baik dan jelek diambil
pada bari 5,6,7,8,9, dan 11 untukanalisisARDRA. Pengambilan .
sampel ini dilakukan setelab mulai jelas teramati nata yang
dikategorikan baik dan jelek. Sampel cairan media fermentasi
nata yang dikategorikan baik ialah yang menghasilkan nata
dengan tekstur tebal dan mulus sedangkan yang dikategorikan
jelek menghasilkan nata dencan tekstur bergelembung dan
76 SEUMAHU ETAL.
agak keras. Galur yang digunakan untukmengetahui keragaman
A. xylinum adatujuh yaitu 5 galur koleksi: galur M, G4IK, M*,
IB-1, RMlC; dan 2 galur hasil isolasi dari media fermentasi
nata: galur B dan K-1. Keragaman galur A. xylinum dianalisis
menggunakan PFGE. Sampel cairan media fermentasi dan galur
A. xylinum yang digunakan diambil dari salah satu perusahaan
nata di Jakarta (nama perusahaan tidak dipublikasikan).
Pembuatan GelInsert dan PFGE. Pembuatan gel insert
dan PFGE dilakukan mengikuti Suwanto dan Kaplan (1989)
menggunakan piranti CHEF-DRII (Biorad, Richmond, CA). Sel
A. xylinum terlebih dahulu diberi enzim pendegradasi selulosa
untuk memudahkan proses h i s sel. Sel selanjutnya dijerap
dalam low melting agarose (Sigma). Gel insert diberi larutan
pelisis sel dan dicuci untukmenghilangkan sisa-sisamateri sel
yang lisis sehingga banya genom total A. xylinum terjerab
yang ada di dalam gel insert. Genom A. xylinum selanjutnya
dipotong dengan enzim SpeI dan selanjutnya dilarikan pada
PFGE dengan kondisi elektroforesis: waktu pulsa awal (It) = 4
detik, waktu pulsa akhir (Ft) = 40 detik, waktu elektroforesis
(Rt) = 24 jam, dan voltase = 5.4 V. Sebagai penanda molekuler
digunakan Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 yang dipotong
dengan AseI (Suwanto & Kaplan 1989).
Isolasi DNA. Isolasi DNA dari sampel dilakukan
menggunakan metode Ampe et al. (1999).
Amplifikasi dan Kloning Gen 16s rRNA. Amplifikasi gen
16s rRNA dilakukan menggunakan pasangan primer spesifk
bagi kelompok Acetobacter Xyl-f dan Xyl-r (sekuen primer
tidak dipublikasikan) dengan kondisi polymerase chain
reaction (PCR): jumlah siklus 30; denaturasi 92 "C, 30 detik;
penempelan primer 55 OC, 30 detik; dan pemanjangan 75 OC,
I menit.
Gen 16s-rRNA hasil amplifikasi dimumikanmenggunakan
WizarPSV Gel andPCR Clean Up System. Hasil pernumian
diligasikan ke vektor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI,
USA) dan ditransformasikanke dalam Escherichia coli DHSa.
Transforman diseleksi pada media agar-agar Luria (AL) yang
dibubuhiampisilii(100 p g d ' ) danx-Gal(40 pgml-'). Gen 16s-
r-RNA pada plasmid rekombinan selanjutnya diamplifhsi lagi
menggunakan pasangan primer M13f dan M13r (Moffett et
al. 2000). Penggunaan primer ini dimaksudkan untuk
mengamplifikasi gen 16s-rRNA yang hanya terdapat pada
plasmid rekombinan.
AmplifiedRibosomal DNA Restriction Analysis. Analisis
.-
ARDRA dilakukan terhadau Zen 16s-rRNA hasil amnlifikasi
dari plasmid rekombinan menggunakan enzim RraI dan HaeIII.
Gen 16s-rRNA hasil amplifkasi dari plasmid rekombiian yang
dipotong dengan enzim restriksi akan menghasilkan sejurnlah
pola pita spesifik yang mewakili genotipe Acetobacter yang
ada dan dikodekan dengan profil 1, profil2, dan seterusnya.
Pola pita yang muncul selanjutnya dihitung persentasinya per
hari fermentasi dan dibuat kurva dinamika populasinya.
SkisotipeSpeIdari Sejnmlah IsolatAceiobacierxylinum.
Galur koleksi Acetobacter maupun biakan murni hasil isolasi
dari contoh cairan media fementasi nata menunjukkan ada
JMikrobiol Indones
enam galur yangmemiliki profil berbeda sedangkan satu profil
menunjukkan kesamaan dengan salah satu dari ketujuh profil
yang ada. Dua galur Acetobacter xylinum yang menunjukkan
skisotipe SpeI yang sama ialab galur G4IK dan galur B. Selain
itu ditemukan pula galur Acetobacter yang baru, galur K-1
yang berbeda dari galur koleksi perusahaan (Gambar 1).
Galur B dan galur K-l digolongkan sebagai kelompok
Acetobacter karena gen 16s-rRNA keduanya hanya dapat
diamplifikasi menggunakan primer spesifik untuk kelompok
Acetobacter, dan memiliki profil ARDRA yang sama dengan
isolat kultur koleksi yang lain. Selain itu, galur B mampu
membentuk pelikel selulosa walaupun kemampuan ini tidak
terlihat pada galur K-1 .
Profil Acetobacier y a n g Terlibat dalam Proses
Fermentasi. Hasil analisis ARDRA dari gen 16s-rRNA yang
dipotong dengan RsaI dan HaeIII menunjukkan adanya tiga
belas pola pita kelompok Acetobacter yang berbeda (Gambar
2). Masing-masing profil ARDRA yang ditemukan pada proses
fermentasi selanjutnya dihitung persentasi keberadaannya
setiap hari fermentasi dimulai dari hari ke-5 sampai hari ke-1 1.
Tiga profil ARDRA dianggap unik keberadaannya karena
ditemukan pada setiap bari fermentasi dan adanya cukup
menonjol, ketigaprofil ARDRA tersebut ialahprofil 1,2, dan 3
(Gambar 3). Kurva pola pertumbuhan Acetobacter profil 2
cenderung berfluktuasi secara ekstrem pada proses fermentasi
dengan hasil nata yang jelek (Gambar 3a) sedangkan pada
fermentasi dengan hasil nata yang baik cenderung stabil
(Gambar 3b). Profil4-13 tidak digambarkan pada kurva pola
pertumbuhan karena hanya dijumpai pada hari-hari tertentu
saja dan tidak berada dalam persentasi yang cukup besar (data
tidak disajikan).
PEMBAHASAN
SkisotipeSpeI dari Sejnmlah IsolatAcetobacterxylinum.
Hasil skisotipe DNA genom Acetobacter yang dipotong
dengan SpeI menunjukkan bahwa galur M, M*, G41K, K-1, IB-
1,dan RMlC memiliki profilberbeda (Gambar 1).GalurB memiliki
kemiripan profil dengan galur G4IK, berarti galur ini
sebenarnya merupakan galur G4IK ditinjau dari sisi total
genomnya.
Hasil isolasi Acetobacter pada media agar-agar memang
sering menunjukkan adanya penampakan koloni yang sama.
Hal ini terutama terjadi karena bakteri ini merupakan genus
yang sama bahkan dalam spesies yang sama. Penampilan koloni
yang sama tidakselalumenjamin bahwa koloni tersehut benar-
benar sama. Pulsed field g e l electrophoresis dapat
menunjukkan sidikjari setiap isolat yang menjadi ciri khasnya.
Hasil di atas menunjukkan bahwa galur yang tadinya diduga
sebagai galur B ternyata merupakan galur G4IK sedangkan
galur K-1 memang merupakan isolat yang benar-benar berbeda
dari kultur koleksi.
Dalam proses fermentasi, dinamika populasi bakteri yang
tumbuh memang sulit diduga. Hal ini terutama terjadi karena
kondisi lingkungan yang tidak dapat dikontrol dengan baik
selama fementasi berlangsung. Skisotipe SpeI di atas tidak
hanya menggambarkan ciri khas masing-masing galur saja,
78 SEUMAHU E T A L .
media. Hasil profil ARDRA yang diperoleh mengindikasikan
bahwa dalam suatu proses fermentasi nata secara hadisional,
A. xylinum yang ditambahkan pada awal fermentasi sebagai
bibit dapat juga bersimbiosis dengan Acetobacter lain yang
muncul selamaproses fermentasi berlangsung. Keberadaannya
dapat saja bersifat menguntungkan maupun memgikan bagi
proses fermentasi tersebut.
Acetobacter profil 2 memiliki kesamaan profil ARDRA
dengan kultur koleksi (data tidak disajikan). Acetobacter profil
2, yang sering digunakan sebagai bibit, cenderung berfluktuasi
secara ekstrem pada proses fermentasi dengan hasil nata yang
jelek, demikian pula dengan profil Acterobocter yang lain.
Selain itu jumlah profil lain yang tidak dominan cenderung
lebih banyak muncul pada fermentasi dengan hasil nata yang
jelek(data tidak disajikan).
Hal yang dapat dijelaskan dari hasil ini ialah keberadaan
isolat inokulum haruslah stabil selama proses fermentasi.
Fluktuasi populasi inokulum selama proses fermentasi akan
berpengaruh terhadap banyaknya serat selulosa yang
dihasilkan. Selain itu padaproses fermentasi dengan hasil yang
baik, keragaman spesies Acetobacter yang ada dalam media
hams terkontrol, karena isolat Acetobacter yang berbeda akan
menghasilkan karakter serat selulosa yang berbeda pula.
Beragamnya galur-galur Acetobacter yang tidak terkonhol
dalam suatu proses fermentasi nata diduga akan menghasilkan
tekstur nata yang tidak terlalu baik.
Fluktuasi Acetobacter yang cukup besar pada media
fermentasi dengan hasil yang jelek diduga karena adanya
pengaruh simbiosis dengan bakteri lain. Pada fermentasi
dengan hasil yang baik, dijumpai jenis bakteri dalam Domain
Bacteria yang cukup beragam dihandingkan dengan pada
fermentasi dengan hasil yangjelek. Padafermentasi yangjelek
jenis bakteri dari Domain Bacteria tidak terlalu heragam dan
relatif sedikit jumlahnya. Keberadaan bakteri-bakteri lain ini
diduga dapat menunjang kebutuhan galur inokulum yang
mungkin tidak tersedia pada media fermentasi dengan
komposisi yang tidak terdefinisi dan terukur konsentrasinya
secara tepat. Faktor lain yang mungkin juga berpengamb ialah
pH cairan media fermentasi selama proses fermentasi
berlangsung. Profil ARDRA pada hari ke-6 fermentasi tidak
teramplifikasi, ha1 ini dapat disebabkan karena konsentrasi
DNA yang diperoleh sangat sedikit.
Secara keseluruhan dapat terlihat bahwa suatu proses
fermentasi yang pada awalnya dimulai dengan galur yang
mumi pada akhimya mempakan kultur campuran. Keberadaan
galur tertentu dalam jumlah yang kecil penting untuk
keberhasilan fermentasi, namun dalam jumlah yang terlalu
JMilirobiol Indones
tinggi jushu memgikan. Meskipun demikian, ada pula bakteri
yang keberadaannya tidak terlalu berpengaruh dalam
menghasilkan nata. Bakteri-bakteri kelompok ini dapat
ditemukan pada nata yang baik atau jelek. Untuk
mempertahankan stabilitas fermentasi perlu adanya
pengontrolan pertumbuhan kultur yang mungkin dapat
memberikan hasil negatif. Faktor-faktor pengonhol itu sendiri
perlu dipelajari lebih lanjut.
UCAPAN TERIMA KASM
Penelitian ini didanai oleh Research Centerfor Microbial
Diversity. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor dan PT Niramas Utama Jakarta.
Penelitian ini mempakan bagian dari tesis CAS.
D m A R PUSTAKA
Ampe F, Ben Omar N, Moizan C, Wacher C, Guyot 1. 1999. Polyphasic
study of the spatial distribution of microorganisms in mexican
pozol, a fermented maize dough, demonstrates the need for
cultivation-independent methods t o investigate traditional
fermentations. Appl Environ Microbiol 65:5467-5473.
Ampe F. Silvent A, Zakhia N. 2001. Dynamics of microbial community
responsible for traditional sour cassava starch fermentation studied
by denaturing gradient gel electrophoresis and quantitative rRNA
hybridisation. In1 J Foad Microbiol 65:45-54.
Giraffa G, Neviani E. 2001. DNA-based, culture independent strategies
for fvaluating microbial communities in food-associated ecosystems.
In1 J Food Microbiol 67:19-34.
Marsh TL, Saxman P, Cole J, Tiedje 1. 2000. Terminal restriction
fragment length polymorphism analysis program, a web-based
research tool for microbial community analysis. Appl Environ
Microbiol 66:3616-3620.
Moffet BF, Walsh KA, Harris JA, Hill TCJ. 2000. Analysis of bacterial
community structure using 1 6 s rDNA analysis. Anaerobe 6:129-
131.
Moschetti G, Blaiotta G Villani F, Copola S. 2001. Nisin-producing
organisms during traditional 'Fior di lane' cheese-making monitored
by multiplex-PCR and PFGE analyses. In1 JFoad Microbiol 63:109-
116.
Randazzo CL, Toriani S, Akkermans DADL, de Vos WM, Vaughan EE.
2002. Diversity, dynamics and activity of bacterial communities
during production of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16s
rRNA analysis. Appl Environ Microbiol 68:1882-1892.
Suwanto A. 1994. Pulsed field gel electrophoresis : A revolution in
microbial genetics. AsPac J Mol Biol Biotechnol 2:78-85.
Suwanto A, Kaplan S. 1989. Physical and genetic mapping of the
Rhodobacler sphoeroides 2.4.1 genome : presence of two unique
circular chromosome. J Bacleriol 171:5850-5859.
Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Jane DJ. 1991. 16s Ribosomal
DNA amplification for phylogenetic study. J Bacreriol 173~697-
703.