TINCIONES HEMATOLOGICAS

Para poder diferenciar los componentes de un extendido de sangre es necesario

teñirlos.

Los colorantes más comúnmente usados para las tinciones hematológicas son los
derivados de la anilina : colorantes de Romanowsky.
La tinción de tipo Romanowsky es muy importante en el laboratorio de
hematología porque con ella puede obtenerse una cantidad importante de
información a partir de un frotis sanguíneo bien teñido.
Consiste en :
-azul de metileno y sus productos de oxidación (azul B)
- eosina Y
La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky.
Las propiedades de tinción de las tinciones de Romanowsky dependen de:
- del enlace de los colorantes a las estructuras químicas
- de las interacciones del azul B y la eosina Y

Ejemplos de tinciones efecto Romanowsky:

- Wright
- Wright – Giemsa
- Leishman
- May Grumwald
- Jenner
- May Grunwald-Giemsa

Según su composición química se distinguen tres grupos de colorantes:

- los ácidos como la eosina;
- los básicos, como el azul de metileno y
- los neutros, combinaciones de uno ácido y uno básico que dan tinciones
policromas.

Los colorantes ácidos y básicos se encuentran como sales y su característica

ácida o básica la da su fracción cromogénica (generadora de color) al tener carga
positiva o negativa.
En un colorante ácido, la fracción cromogénica posee carga negativa (colorante
aniónico)
En un colorante básico, la fracción cromogénica posee carga positiva (colorante
catiónico)
Durante la coloración las fracciones cromogénicas se ligan a componentes
tisulares de carga contraria.

El mecanismo por el cual determinados componentes de la estructura celular se

tiñen por ciertos colorantes y no por otros depende de:
- diferencias en la estructura química
- diferencias de afinidad

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Las sustancias basófilas reciben este nombre porque muestran afinidad por los
colorantes básicos (o alcalinos).
Las sustancias acidófilas tienen afinidad por los colorantes ácidos.

Los colorantes son sensibles a la concentración iónica de protones (pH)

Las distintas estructuras celulares se teñirán con el colorante de pH antagónico.

Así.:
-Los colorantes ácidos teñirán las estructuras básicas (hemoglobina, gránulos de
los eosinófilos llamados así por su atracción a la eosina.)
-Los colorantes básicos teñirán las estructuras ácidas (ADN, ARN citoplasmático)
denominadas estructuras basófilas.
-Las estructuras neutrófilas son aquellas que tienen afinidad por ambos
colorantes.

Colorante ácido Colorante básico

Fracción cromogénica (-) Fracción cromogénica(+)

(aniónico) (catiónico)

Eosina Azul de metileno

Para sustancias ácidofilas (+) Para sustancias basófilas (- )

Grupos básicos Grupos ácidos

(hemoglobina, granulación eosinófilos) (núcleo, citoplasma, ribosomas)

Desarrollan color rojo Desarrollan color azul

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Tinción de May Grunwald-Giemsa ( Tinción panóptica)

El empleo combinado de los colorantes May Grunwald y Giemsa se conoce con el

nombre de tinción panóptica de May Grunwald Giemsa.

Se basa en el uso de soluciones preparadas a base de colorantes de acentuado

poder policromatófilo y metacromático

Fundamento:
Se basa en el agregado de la solución de May Grunwald formada por eosinato de
azul de metileno en alcohol metílico , la que fija el extendido y tiene afinidad por
los citoplasmas.
Luego se agrega el colorante Giemsa diluido (en el momento de realizarse la
coloración), Esta constituido por Azures que son derivados por oxidación del azul
de metileno. Tiene afinidad por los núcleos y ciertas granulaciones.

La eosina es un colorante ácido por lo tanto tiñe los componentes acidófilos de las
células.
El azul de metileno es un colorante básico por lo tanto se une a las fracciones
basófilas

Es importante respetar las condiciones de la coloración ya que variaciones de pH

pueden alterarla. En esta coloración se trabaja a pH neutro o ligeramente alcalino.
Si se trabaja a pH ácido, habrá mayor cantidad de sustancias cargadas
positivamente y se absorberá mayor cantidad de eosina. Los extendidos adquieren
una tonalidad rojisa.
Si el pH es muy básico, habrá mayor fijación de azul de metileno y se exagerarán
los colores azules.

May Grunwald

Combina la eosina (colorante ácido) con el azul de metileno (colorante básico)

El proceso de tinción empieza con la fijación con metanol cuya acción es fijar la
película de sangre por precipitación y adherencia de las proteínas celulares al
portaobjetos de vidrio.
La tinción efectiva se inicia con la adición de un amortiguador al colorante lo que
da lugar a su ionización.
La eosina y el azul de metileno son sensibles a cambios de pH de las diferentes
estructuras celulares.

El reactivo en medio acuoso tiene la acción de diferenciar tiñiendo:

Sustancias acidófilas color rojo

Sustancias basófilas color azul

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 Núcleo se colorean azul

Los grupos ácidos de citoplasma (estructuras basófilas)

Ribosomas afinidad por colorantes básicos

Tienen apetencia por el colorante básico tinción por azul de metileno

Los grupos básicos de molécula de se colorea rojo

hemoglobina (estructura acidófila)
afinidad por colorantes ácidos

Tienen apetencia por el colorante ácido tinción por la eosina

Giemsa

Derivados por oxidación del azul de metileno (metiltionina) Azures (A,B,C)

Es responsable de la coloración púrpura de la cromatina leucocitaria y granulaciones

citoplasmáticas (azurófilas)

Observadas al microscopio, las células presentan las siguientes coloraciones.

Hematíes: color rosado
Gránulos neutrófilos: de rosa a lila
Gránulos eosinófilos: de rojo a anaranjado
Gránulos basófilos: azul violáceo oscuro
Citoplasma de neutrófilos: rosa claro
Citoplasma de linfocitos: azul celeste claro
Citoplasma de monocitos: azul grisáceo
Núcleo de neutrófilos y linfocitos: violeta oscuro
Núcleo de monocitos: púrpura azulado algo más claro que los anteriores

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Eritrocitos policromatófilos: azul violeta
Punteado basófilo: azul oscuro
Cuerpos de Howell Yollie: rojo púrpura
Plaquetas: púrpura oscuro o violeta con un halo azul claro a su alrededor.

La coloración celular es muy variable en cuanto a tonalidades, dependiendo del

tiempo de tinción y de los lotes de colorantes,

Causas de error
Tinción demasiado azulada:
- extensión demasiado gruesa
- excesivo tiempo de tinción
- lavado inadecuado
- alcalinidad del colorante, del agua o tampón

Tinción demasiado rosada:

- tinción insuficiente
- excesivo tiempo de lavado
- acidez del colorante o tampón

Otras causas:
- utilización de portas sucios
- secado del colorante durante el periodo de tinción
- lavado inadecuado durante la tinción
- presencia de polvo en el portaobjeto
- mala filtración del colorante antes de su uso
- pH impropio del colorante o los diluyentes
- el agua destilada no es siempre neutra
- precipitación del colorante sobre el port-objeto debido a inadecuado lavado o
uso del colorante que no ha sido filtrado adecuadamente

Tinción ácida: los eritrocitos se tiñen bien pero los leucocitos se tiñen muy pálidos
o no se tiñen.
Tinción básica o alcalina: los eritrocitos se tiñen pálidos y el núcleo de los
leucocitos excesivamente azules.
Debe corregirse el pH del agua destilada o amortiguador.

Advertencias:
1.- Limpieza del porta-objetos
Para evitar coloraciones defectuosas deben utilizarse siempre porta-objetos
cuidadosamente limpios, desengrasados y secos. Debe evitarse el contacto de
los dedos con la superficie destinada a la extensión.

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2.- Agua destilada
Las coloraciones defectuosas de extensiones de sangre se deben casi siempre
al empleo de agua destilada con exceso de ácido carbónico. Por eso hay que
emplear agua recién destilada para diluir los colorantes y para lavar las
extensiones sanguíneas. El pH adecuado es 5.8
3.- Preparación de la extensión
Las extensiones una vez secas deben fijarse lo antes posible (no más de 24
horas) para luego ser teñidas por el colorante de elección. Sólo se puede usar
EDTA, nunca utilizar otro anticoagulante para hacer el frotis.
4.- Método de coloración
No teñir nunca las preparaciones cerca de humos de ácidos o álcalis fuertes.
La tinción en extensiones sobre porta-objetos se realiza en general de tal
manera que ésta queda cubierta por la solución colorante con una capa de 2 cm.
de espesor pero evitando que se derrame por los bordes .Si se aplica una
cantidad demasiado pequeña de solución de colorante se pueden producir
precipitados del colorante.

5.-Dilución del colorante Giemsa

Es importante que la dilución del Giemsa debe ser preparada en el instante en
que se va a usar y jamás antes, dado que el colorante produce su efecto máximo
en el momento en que la solución stock se adiciona al agua.
6.- Lavado de las extensiones
Sin volcar el colorante, eliminando del porta-objetos mediante un breve y
vigoroso chorro de agua. Si se volcara antes de lavar, se adheriría al frotis el
precipitado que siempre se forma en las mezclas de colorantes y del que una
parte se acumula en la superficie en forma de película irisada. El lavado no debe
ser prolongado debido a que el agua decoloraría los elementos recientemente
teñidos. Conviene efectuarlo con agua destilada.
7.- Secado
Inmediatamente después de efectuado el lavado escurrir el agua colocando el
porta-objetos en posición casi vertical, limpiando previamente su parte posterior
con un lienzo.

Metacromasia; una coloración es metacromática cuando tiñe selectivamente

determinadas estructuras de otro color distinto al colorante. (azul de metileno, azul
de toluidina, tionina)
Policromática:
Panóptica :
Supravital:

Prof. V. Saldivia F.