Estrategia Catalítica de La Lisozima

Ludwig O.
Julca Universidad Nacional de Trujillo

ludwigjulca@gmail.com
ESTRATEGIAS CATALÍTICAS DE LAS ENZIMAS

La catálisis enzimática comienza con la unión del sustrato. La formación del
complejo enzima-sustrato es favorecida termodinámicamente porque hay un
cambio negativo en la energía libre durante la formación del complejo, debido a
que se crea un gran número de interacciones débiles entre la enzima y el
sustrato. Se puede prever que esta energía de unión sirve para dos propósitos:
para establecer la especificidad de sustrato y para aumentar la eficacia
catalítica. Sólo el sustrato correcto puede participar en la mayor parte de las
interacciones con la enzima, potenciando así la energía de unión, lo que
explica la alta especificidad por el sustrato exhibida por muchas enzimas.
Además, el complemento perfecto para dichas interacciones solamente se
forma cuando el sustrato se encuentra en el estado de transición. De este
modo, las interacciones entre la enzima y el sustrato no sólo favorecen la unión
del sustrato, sino que también estabilizan al estado de transición, disminuyendo
así la energía de activación. La energía de unión puede promover también
cambios estructurales, tanto en la enzima como en el sustrato, los que
favorecen la catálisis, en un proceso denominado ajuste inducido.(1)
Para catalizar reacciones específicas, los enzimas normalmente emplean una o
más de las estrategias siguientes:
 Catálisis covalente. El centro activo contiene un grupo reactivo,
habitualmente un nucleófilo potente que, en el transcurso de la catálisis,
llega a ser modificado covalentemente de forma temporal. La quimotripsina,
una enzima proteolítica, proporciona un excelente ejemplo de este
mecanismo.(1)
 Catálisis general ácido-base: Por lo general en la catálisis ácido-base, una
molécula diferente al agua desempeña el papel de donador o aceptor de un
protón. La quimotripsina utiliza un residuo de histidina como un catalizador
básico para incrementar el poder nucleofílico de la serina de su centro
activo.(1)
 Catálisis por ion metálico: Los iones metálicos pueden funcionar
catalíticamente de varias maneras: Por ejemplo, un ion metálico puede
actuar como un catalizador electrofílico mediante la estabilización de una
1
Ludwig O. Julca Universidad Nacional de Trujillo
carga negativa sobre un intermediario de la reacción. De forma alternativa,

un ion metálico puede generar un nucleófilo cuando aumenta la acidez de
una molécula cercana, como el agua. Así sucede en la hidratación de CO2
mediante la anhidrasa carbónica. Finalmente, el ion metálico puede unirse
al sustrato, ya que aumenta el número de interacciones con el enzima y,
así, la energía de unión.(1)
 Catálisis por aproximación: La reacciones incluyen dos sustratos diferentes.
En estos casos, la velocidad de la reacción puede aumentar
considerablemente si se atraen a los dos sustratos juntos sobre una misma
superficie de unión del enzima. Las NMP quinasas atraen dos nucleótidos a
la vez para facilitar la transferencia de un grupo fosforilador desde un
nucleótido al otro. (1)
LISOZIMA
La lisozima (EC 3.2.1.17), sistemáticamente
llamada peptidoglucan N-
acetilmuramoilhidrolasa, y también conocida
como: 1,4-N-acetilmuramidasa, N,O-
diacetilmuramidasa, L-7001, lisozima PR1,
globulina G, globulina G1, lisozima g,
mucopeptido N-acetilmuramoilhidrolasa,
mucopeptido glucohidrolasa, y muramidasa,1
es una enzima hidrolítica –una hidrolasa.
Ilustración 1. Modelo molecular de

La lisozima fue descubierta por cintas de la lisozima, mostrando las
estructuras secundarias. En verde, el
Laschtschenko2 en el huevo de gallina, y por residuo GLU 35, y en rojo, el residuo
ASP 52.18
Fleming3, como agente antibacteriano del
moco nasal y otros tejidos y secreciones naturales4. Interviene en la defensa
natural contra las infecciones.5,6 Su nombre se debe a su acción lítica sobre las
células bacterianas. La lisozima carece de actividad como proteasa, quinasa,
amilasa, lipasa o fosfatasa7. La lisozima rompe los peptidoglucanos de la pared
celular de ciertas bacterias8 las que estallan, por falta de soporte mecánico, por
2
la alta presión osmótica intracelular.9 Sin embargo, la lisozima ha mostrado

actividad bactericida independientemente de su capacidad lítica.10
Estructura y clasificación
Las lisozimas constituyen una superfamilia de proteínas, las mismas que están
clasificadas como proteínas alfa+beta.11 Cada molécula de lisozima es una
cadena polipeptídica simple. Existen varios tipos de lisozimas. La lisozima de la
clara del huevo de gallina Gallus gallus (HEWL) tiene una masa molecular
Ilustración 2. Estructura primaria de la lisozima de huevo de Gallus g.allus.

aproximada de 14 400 Da, y consta de 129 aminoácidos.12 La lisozima humana
(HTL) tiene una masa molecular ligeramente mayor, y consta de 130
aminoácidos. La diferencia radica en que HTL tiene un residuo de glicina
inserto en la posición 49.13 La lisozima de clara de huevo de pavo común
Meleagris gallopavo (TEWL) consta también de 129 aminoácidos, y guarda
algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos con HEWL.14 Las
lisozimas HEWL, HTL, TEWL, así como de: Numida meleagris (guinea),
Phasianus colchicus (faisán), Colinus virginianus (codorniz cotuí norteña),
3
Coturnix coturnix japonica (codorniz japonesa), Equus caballus (caballo), Canis

familiaris (perro), Mus musculus (ratón), Tachyglossus aculeatus (equidna
australiano), Oncorhynchus mykiss (trucha arcoiris) y Bombyx mori (gusano de
la seda), son lisozimas del tipo “c”. También son lisozimas de tipo “c” las α-
lactoalbúminas. La lisozima de clara de huevo de ganso Anser anser anser
(GEWL) tiene una masa molecular aproximada de 20 500 Da.15 Junto con la
lisozima de cisne negro australiano Cygnus atratus, constituyen lisozimas del
tipo “g”. Las glucosidasas de la familia 19 incluyen la quitinasa de la cebada
Hordeum vulgare y la quitinasa de Canavalia ensiformis. Los bacteriófagos T4
tienen lisozima en la cola, la que les permite ingresar su material genético a
través de la pared celular bacteriana. Estas lisozimas se conocen como
lisozimas fago. El bacteriófago lambda posee su propia lisozima, una lisozima
lambda. Escherichia coli también posee su propia muramidasa bacterial. Las
quitanasas, como de Streptomyces sp. y Bacillus circulans, también pertenecen
a esta superfamilia.
La estructura primaria de HTL es:16
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRS
TDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDP
QGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV.
Presentando puentes disulfuro entre los residuos de cisteinilo: 6 y 128, 30 y
116, 65 y 81, 77 y 95.
La lisozima se hizo repentinamente popular cuando el profesor D. C. Phillips y
sus colegas de la Royal Institution en Londres describieron la estructura
tridimensional de la lisozima de clara de huevo de gallina17, determinada
mediante análisis de cristalografía de rayos X (ver Ilustración 1)18. Actualmente,
la posición de cada uno de los átomos en la molécula se conoce dentro de un
margen de 0,28 Å, distancia suficientemente reducida.19 La lisozima es la
primera enzima para la que se ha determinado una estructura tridimensional
tan detallada, y el conocimiento de su estructura ha sido extraordinariamente
útil para la determinación de su mecanismo de acción.20
La lisozima HEWL es una proteína básica, presentando punto isoeléctrico en el
rango 10,5 – 11,0.4
4
El polisacárido de la pared celular de muchas

bacterias se forma con dos clases de
Ilustración 3. Modelo molecular de la azucares: N-acetilglucosamina (NAG) y N-

lisozima, complejada con tri-N- acetilmuramato (NAM).21,22 Ambos son
acetilglucosamina, superficie de la
enzima generada usando una sonda derivados de la glucosamina, en que el grupo
esférica de 1,0 Å de radio. Los colores
indican estructuras secundarias amino está acetilado. En el NAM, una cadena
locales.30
lateral lactilo se une al C-3 del azúcar por
23,24
medio de un enlace éter. En la pared de las células bacterianas, el NAM y
el NAG están unidos por enlaces glucosídicos entre C-1 de un azúcar y el C-4
de otro. Todos los enlaces son de tipo β.25 En el polisacárido hay una
alternancia de residuos de NAM y NAG unidos por enlaces β.21 La lisozima
hidroliza el enlace glucosídico entre C-1 de NAM y C-4 de NAG. Los otros
enlaces glucosídicos entre C-1 de NAG y C-4 de NAM no son rotos.1
Mecanismo de unión lisozima-sustrato

Los oligómeros de NAG con menos de cinco
residuos son hidrolizados muy lentamente, o
no lo son.20,26,27 Sin embargo, se unen al sitio
activo de la enzima, y reaccionan
preferentemente como aceptores en
reacciones de transglucosilación.28 El trímero
de N-acetilglucosamina es un potente
inhibidor competitivo de la lisozima.29 El
estudio por rayos X del complejo lisozima-
(NAG)3 muestra que el sustrato se liga a una
Ilustración 4. Modelo molecular de la
lisozima, superficie generada usando hendidura en la superficie de la enzima
una sonda esférica de 1.0Å de radio.
Se ve claramente la hendidura del ocupando cerca de la mitad de ella.29,30 La
centro activo, con el residuo GLU 35
en verde, y el residuo ASP 52 en rojo.18
unión del (NAG)3 y la lisozima se hace por
puentes de hidrogeno e interacciones de Van der Waals. El grupo carboxílico
del aspartato 10131 se une por enlaces de hidrogeno a los residuos A y B, entre
el residuo C y la enzima hay cuatro enlaces de hidrogeno: uno entre el NH del
anillo indol del triptófano 62 y el oxigeno del C6.32 Este enlace aún se produce
cuando el triptófano 62 es convertido en kinurenina33, y lisozimas mutantes con
5
otros aminoácidos (Leu, Ile, Val, Ala) en la posición 62 poseen una mayor
actividad lítica.34 Otro enlace se produce entre el triptófano 63 y el oxigeno del
C3,32 otro entre los grupos NH y CO de la cadena lateral acetamida y los
grupos CO y NH de la cadena principal de los aminoácidos 107 y 59,
respectivamente.35 El (NAG)3 tiene también contactos tipo Van der Waals con
la enzima, así el residuo B se acomoda al anillo indol del triptófano 57.
6
El hallazgo de que el (NAG)3 llena la mitad

de la hendidura de la lisozima sugería la
necesidad de residuos adicionales de azúcar
que llenen la hendidura para que se forme el
complejo enzima-sustrato. Habrá espacio
para tres residuos adicionales de azúcar.36
Tres residuos adicionales de azúcar
denominados D, E Y F fueron encajados en
la hendidura. El residuo D, para encajar, tuvo
que ser distorsionado de su conformación
normal. De los cinco enlaces del (NAG)6, el
único que se hidroliza es el enlace D-E por lo Ilustración 5. Modelo molecular de la
lisozima complejada con hexa-N-
siguiente: el enlace glucosídico entre A y B acetilquitohexosa, superficie de la enzima
generada usando una sonda esférica de
no puede ser el sitio de hidrólisis porque 1,0 Å de radio. El residuo GLU 35 se
(NAG)3 es estable. El enlace B-C se excluye muestra
44
en rosa, y el residuo ASP 52 en
rojo.
por la misma razón. Otra evidencia crucial es que el sitio C puede ser ocupado
perfectamente por NAG, pero no así por NAM, porque éste es muy grande
debido a su cadena lateral lactilo y no encaja37. Por otra parte, se sabe que el
enlace que se rompe en la pared de las bacterias es el enlace NAM-NAG. Si
NAM no puede encajar en C, se excluyen también E-F como sitio de hidrólisis,
ya que el polisacárido de la pared celular es un polímero en el que NAM y NAG
alternan, por lo que si NAM no puede ocupar el sitio C, tampoco podrá ocupar
el sitio E. Excluidos los enlaces A-B, B-C, C-D y E-F como sitios posibles de
hidrólisis, se concluye que la ruptura se da en el enlace D-E.38
7
MECANISMO DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA DE LA LISOZIMA

Esta enzima rompe los enlaces repetitivos NAM (β:1→4) NAG de los
peptidoglucanos (NAM-NAG) en las paredes celulares de las bacterias,39 y los
enlaces NAG (β:1→4) NAG en las quitodextrinas40, que se encuentran en las
paredes celulares de ciertos hongos. Dado que estos polímeros son
hidrofílicos, se espera que el sitio activo de la enzima contenga un canal
accesible por un solvente hacia el que pueda unirse el polímero. Se ha
obtenido estructuras cristalinas de la lisozima y complejos de la lisozima y NAG
a alta resolución.41,42,43,44 Los inhibidores y sustratos forman fuertes enlaces de
hidrógeno y algunas interacciones hidrofóbicas con la enzima.30 Los estudios
cinéticos llevados a cabo usando polímeros de (NAG)n muestran un agudo
incremento en la kcat cuando n aumenta de 4 a 5. Los valores de kcat para
NAG6 y (NAG-NAM)3 son similares. Los estudios en modelos han mostrado
que, para que pueda darse la catálisis, el polímero (NAG-NAM)3 se une al sitio
activo con cada monómero de azúcar en la conformación de silla, excepto el
cuarto, que está distorsionado a una forma de media silla45, lo que labiliza el
enlace glucosídico entre los azúcares cuarto y quinto. Estudios adicionales han
mostrado que si los azúcares que encajan en el sitio de unión se etiquetan de A
a F, debido al voluminoso sustituyente lactilo del NAM, los residuos C y E no
pueden ser NAM, lo que sugiere que B, D y F deben ser residuos NAM. La
ruptura se da entre los residuos D y E.46
8
Una revisión de la química de la formación del enlace glucosídico (un acetal) y

su ruptura muestra que la ruptura de un acetal es catalizada por ácidos, y
procede por un mecanismo en el que aparece un ion oxonio, el cual existe
también debido a la resonancia, como un carbocatión.47,48,49
Ilustración 6. Mecanismo reversible de acetalización de aldehídos

La catálisis de la enzima involucra a los residuos Glu 35 y Asp 52, que están en
el centro activo. El aspartilo 52 está rodeado por grupos polares, pero el
glutamilo 35 está en un ambiente hidrofóbico. El triptófano 108, en contacto de
van der Waals con el residuo Glu 35, es especialmente importante en crear el
ambiente hidrofóbico. 50 Esto debiera aumentar el pKa aparente del residuo de
glutamilo 35,50 haciéndolo menos apto de donar un protón y adquirir una carga
negativa a valores bajos de pH, haciendo de él un mejor ácido a valores de pH
altos. El mecanismo general parece involucrar:
1. La unión de una unidad de hexasacárido al peptidoglucano, con la
concomitante distorsión del NAM en la posición “D”.
9
Ilustración 7. Fijación del peptidoglucano en el centro activo de la lisozima.51

2. La protonación del átomo de oxígeno de la cadena de acetilo sésil, por el
ácido genérico Glu 35 (con el pKa elevado), lo que facilita la apertura del
enlace glucosídico y la formación del ion carbenio estabilizado por
resonancia52 con el átomo de oxígeno adyacente.
Ilustración 8. Protonación del enlace glucosídico del peptidoglucano en el centro activo de la

lisozima.51
10
3. El residuo de aspartilo 52 estabiliza al catión oxonio a través de interacción

electrostática. La forma de media silla distorsionada del NAM en la posición
“D” estabiliza el catión oxonio, lo que requiere la coplanaridad de los
sustituyentes unidos al átomo de carbono hibridado en sp2 de la forma
resonante del carbocatión (del mismo modo que en los enlaces peptídicos
planares).
Ilustración 9. Ruptura del enlace glucosídico, y formación de carbocatión estabilizado por

aspartato.51
4. El agua ataca al carbocatión estabilizado, formando el hemiacetal, con
liberación del protón adicional del agua al residuo de glutamilo 35 que
previamente fue deprotonado, regenerando el catalizador.
11
Ilustración 10. Interacción de agua con el carbocatión, y regeneración de la actividad enzimática.
Ilustración 11. Mecanismo de Phillips para la hidrólisis enzimática de peptidoglucanos, catalizada

por lisozima.51
La unión y distorsión del sustituyente D del sustrato (a la forma de silla como se

muestra arriba) se da previo a la catálisis. Dado que la distorsión ayuda a
12
estabilizar al intermediario oxonio, se presume que también estabiliza al estado

de transición. De ahí que parezca que esta enzima une al estado de transición
más fuertemente que al sustrato libre sin distorsionar, lo que es otro método de
catálisis.
Los estudios de pH muestran que se requieren cadenas laterales con pKa de
3,5 a 6,3 para la actividad enzimática. Estos valores de pKa corresponden
posiblemente a los residuos Asp 52 y Glu 35, respectivamente. Si los grupos
carboxilo de la lisozima son modificados químicamente en la presencia de un
inhibidor competitivo de la enzima, los únicos grupos carboxilo protegidos
corresponden a los residuos Asp 52 y Glu 35.
Una publicación reciente sugiere un mecanismo alternativo al mecanismo de
Phillips mostrado arriba.53 En este caso, el residuo aspartilo 52 actúa como
según catálisis nucleofílica, y forma un enlace covalente con NAM,
desplazando al grupo saliente NAG, con el residuo de glutamilo 35 actuando
como un ácido genérico. Este mecanismo alternativo también es consistente
con otras enzimas que rompen enlaces β-glucosídicos. La distorsión del
sustrato también es importante en este mecanismo alternativo54,55.
13
Ilustración 12. Mecanismo alternativo para la hidrólisis enzimática de peptidoglucanos, catalizada

por lisozima.53
Cinética de la reacción
Tabla 1. Velocidades de la reacción de hidrólisis catalizada por lisozima HEW de análogos de

sustratos de oligosacárido selectos
Compuesto kcat(s-1)
(NAG)2 2,5·10-8
(NAG)3 8,3·10-6
(NAG)4 6,6·10-5
(NAG)5 0,033
(NAG)6 0,25
14
(NAG-NAM) 0,5*
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Ludwig O.

Julca Universidad Nacional de Trujillo

ESTRATEGIAS CATALÍTICAS DE LAS ENZIMAS

carga negativa sobre un intermediario de la reacción. De forma alternativa,

Ilustración 1. Modelo molecular de

la alta presión osmótica intracelular.9 Sin embargo, la lisozima ha mostrado

Ilustración 2. Estructura primaria de la lisozima de huevo de Gallus g.allus.

Coturnix coturnix japonica (codorniz japonesa), Equus caballus (caballo), Canis

El polisacárido de la pared celular de muchas

Ilustración 3. Modelo molecular de la azucares: N-acetilglucosamina (NAG) y N-

Mecanismo de unión lisozima-sustrato

El hallazgo de que el (NAG)3 llena la mitad

MECANISMO DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA DE LA LISOZIMA

Una revisión de la química de la formación del enlace glucosídico (un acetal) y

Ilustración 6. Mecanismo reversible de acetalización de aldehídos

Ilustración 7. Fijación del peptidoglucano en el centro activo de la lisozima.51

Ilustración 8. Protonación del enlace glucosídico del peptidoglucano en el centro activo de la

3. El residuo de aspartilo 52 estabiliza al catión oxonio a través de interacción

Ilustración 9. Ruptura del enlace glucosídico, y formación de carbocatión estabilizado por

Ilustración 10. Interacción de agua con el carbocatión, y regeneración de la actividad enzimática.

Ilustración 11. Mecanismo de Phillips para la hidrólisis enzimática de peptidoglucanos, catalizada

La unión y distorsión del sustituyente D del sustrato (a la forma de silla como se

estabilizar al intermediario oxonio, se presume que también estabiliza al estado

Ilustración 12. Mecanismo alternativo para la hidrólisis enzimática de peptidoglucanos, catalizada

Tabla 1. Velocidades de la reacción de hidrólisis catalizada por lisozima HEW de análogos de

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