INDUCCION DE CALLO IN VITRO DE Daucus carota L.

(ZANAHORIA)
Martens Lisbel,Novoa Lorena,Sanchez Pilar,Veja Christian. Asesor: Dr. Mauro
Quiñones
Taller de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Ricardo Palma.

RESUMEN

Uno de los problemas en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión
y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica.
Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas
biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la
productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable.

Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un tejido cicatril de división
celular desdiferenciado y desorganizado, donde cada una de sus células es totipotente, es
decir capaz de crecer, dividirse y dar lugar a una planta.
En el presente trabajo se utilizó explantes de Daucus carota, sembrados en el medio MS
(Murashigue – Skoog) como medio de cultivo nutricional para obtener crecimiento de tejido
calloso.

INTRODUCCION Uno de los problemas

en los cultivos de Daucus carota es que
objeta mucho tiempo, inversión y áreas de
cultivo, ocasionando consecuentemente la
merma económica.
Además presenta una susceptibilidad al ser
afectada por diversas enfermedades, entre
ellas la “podredumbre negra” causada por
Stemphylium radicinum “hongo
ascomiceto”, que causa oscurecimiento y
muerte de las hojas y destrucción de la
raíz; plagas como pulgón, gusanos grises,
nematodos, etc.
Debido a esto, la demanda en la agricultura
moderna ha llevado a la utilización de
técnicas biotecnológicas que ayudan a
evitar la susceptibilidad a las enfermedades
y mejorar la productividad de las plantas,
que resulta un método más eficiente,
económico y rentable. (OMS, 2005 y
Sumpsi, J., 1982).
MATERIALES Y METODOS
Obtención de la planta
La planta Daucus carota (Zanahoria) fue
comprada en el supermercado wong, y
trasladada al laboratorio de Biotecnología
Vegetal de la Universidad Ricardo Palma
en bolsa ziploc.
Preparación de medio de cultivo
Para preparar el medio MS se separo una
alicota y se agregaron los carbohidratos.
Luego se enriqueció el medio con 2,4D
(diclorofenoxiacético) y se midió el pH, el
cual fue 5.5 – 6.5. Luego, se adiciono el
gel rite y fue llevado al microondas para
obtener el medio líquido. Se procedió a
servir en tubos de ensayo y fueron sellados
con papel aluminio. Por último se auto
clavaron a 121C.

Una de estas técnicas es el cultivo a partir Esterilización del material biológico

del callo. El callo es un proceso de
desdiferenciación celular formado por la
proliferación desordenada de células que
da origen a una masa amorfa de tejido; es
un proceso para obtener células
germinativas de la planta seleccionada.
(Quiñones, M., 2008); donde la respuesta
embriogénica del callo depende del
genotipo de planta. (Linz, 1984)
En el presente trabajo se obtendrá tejido
calloso en cultivo in Vitro de Daucus carota
siguiendo el procedimiento descrito por
Quiñones, M., 2008.
Los explantes obtenidos del cambium de
Daucus carota (Zanahoria) se colocaron en
un beacker y fueron lavados con
detergente, con ayuda de un cepillo y agua
de caño. Luego se enjuago con agua
destilada y seguidamente fueron
sumergidos en alcohol 96% por 40
segundos. Los explantes fueron
sumergidos en cloruro de mercurio (HgCl2
0.1%) por 10 minutos. Una vez transcurrido
el tiempo indicado, el material biológico fue
enjuagado en agua esterilizada 5 veces
con un intervalo de 5 minutos por enjuague.
Tratamiento del explante e introducción
en el medio de cultivo
En la cámara flujo laminar los explantes ya
esterilizados se transfirieron a una placa
Pietri estéril y se aíslo la parte nuclear del
explante, se libero la yema con ayuda del
bisturí y pinza de las células muertas que
cubren el explante. Con ayuda de la pinza
se introdujo el callo en forma aséptica en
los tubos con medio de cultivo. Luego se
sello el cuello del tubo con papel aluminio y
se incubo a una temperatura de 27º C.
Monitoreo de la formación del callo
El monitoreo se llevo a cabo cada 7 días
para evidenciar si hubo formación de tejido
calloso. Con ayuda de una cámara digital
se tomaron fotos.
RESULTADOS
Los explantes de Daucus carota fueron
cultivados en un medio de cultivo MS
enriquecido con 2,4D, se sembraron 8
tubos, observados en un periodo de cinco
semanas. De los cuales 7 tubos
evidenciaron contaminacion durante el
transcurso de las cinco semanas(Fig.1), es
decir el 88% de nuestras muestras fueron
contaminadas. Solo un tubo presento
desdiferenciacion y formacion de callo del
explante de Daucus carota,en la segunda
semana de cultivo, por lo tanto solo el 12%
de nuestra muestra fue viable. Mostrando
asi un alto indice de contaminacion de los
explantes, probablemente microbiana o
micotica o de fenolizacion.
Los explantes sembrados presentaban un
color naranja en la primera semana,
posteriormente fueron cambiando de color
debido a la contaminacion, tanto del medio
de cultivo enriquecido con 2,4D, como de
los explantes, mostrando ciertos tubos una
fenolizacion y por lo tanto un color oscuro
del medio y del explante, lo cual afecto el
desarrollo de la callogenesis.
Contaminación
micótica
Figure 1: Explante de Daucus carota con
contaminacion (2da semana).
El unico tubo con desdiferenciacion,
presento proceso de formación de callo en
las dos terceras partes de su estructura no
sumergida, sin tocar el medio de cultivo.
(Fig.2)
Figure 2: Dos semanas y se evidencia la
desdiferenciacion del explante de D.carota en
medio de cultivo MS.
La formación de tejido calloso despues de
tres semanas de cultivo exhibio un
crecimiento lento sobre la superficie del
medio y el color fue cambiando de naranja
a claro blanquecino, de consistencia seca y
granulosa (Fig.3). De morfologia
heterogenea, debido al crecimiento
desorganizado del callo.
Figure 3: 3ra. Semana, formacion de
callo,del explante de Daucus carota en un
medio de cultivo MS.
En la cuarta y quinta semana (Fig.4 y 5) se
sigue evidenciando la totipotencialidad, y
division constante del tejido calloso, en
medio de cultivo MS enriquecido con
2,4D,in vitro. La auxina 2,4D tiene la
capacidad para inducir procesos de
diferenciación por lo que es necesaria para
la formación del callo (Barba, 1987).
Los explantes estuvieron incubados en un
cuarto climatizado con temperatura de
25Co. El proceso de desdiferenciacion se
llevo a cabo en condiciones de oscuridad
durante las cinco semanas de observacion.

Figure 4: 4ta Semana,
Figure 5: 5ta Semana,
crecimiento en la formacion multiple granulacion,
de callo de D.carota. de callo de D.carota.
DISCUCION
Uno de los pasos importantes para la
obtención del callo es la esterilización del
explante, en la actualidad se ha
generalizado el uso de etanol (70% v/v) y el
hipoclorito de sodio de 1% al 3%
contenidos en productos de uso domestico,
con menor frecuencia hipoclorito de calcio y
cloruro de mercurio, porque son
compuestos altamente tóxicos y que no son
fácilmente removibles del explante (Linz
Re, Jarret RL.).
Se necesita la presencia de una auxina
para la iniciación de un callo embriogénico,
usualmente se emplea el 2,4-D, el cual
brinda el estimulo de la iniciación de la
embriogenesis somática en el callo. Sin
embargo, la maduración de los embriones y
la germinación no ocurren en la presencia
de 2,4-D; En consecuencia hay que
remover la auxina o usarla en
concentraciones más bajas (Halperin
1964).
Es posible aumentar el potencial
embriogénico de los callos de zanahoria
exponiéndolos a niveles altos de sacarosa
o de manitol; la sacarosa se utiliza en
concentraciones de 2% y 3% hasta 12%
demostrado por (Wheterell 1984).
CONCLUSIONES:
.Se obtuvo una muestra de tejido calloso
aproximadamente entre la 4ta- 5ta semana
de todas las muestras que se realizaron ya
que el resto de los explantes presentaron
una coloración más oscura a causa de la
fenolizacion , otros presentando una
despigmentación coloreando el medio MS,
como también se vieron afectados por la
contaminación por hongos ambientales .
.Para evitar la fenolizacion es requerida la
utilización de antioxidantes en el medio,
como el acido cítrico, acido ascórbico.
.Tener una asepsia adecuada para evitar el
ingreso de hongos ambientales.
.Se sugiere determinar la concentración
de sacarosa adecuada en el medio de
cultivo para la inducción en menor tiempo.
BIBLIOGRAFIA
1. REINERT J. (1958).
Untersuchungen iiber die
morphogenese und
gewebekulturen. Ber. Dtsch. Bot.
Ges. 71-15 p.
2. OKAWAZA Y, KATSURA N,
TAGAWA T. (1967). Effects of
Auxin and Kinetin on the
Development and Differentiation
of Potato Tissue Cultured in
vitro. Physiol. Plant. 20 (4): 862-
869 p.
3. Nickell, L. & Maretzki, A. 1970. The
utilization of sugar and starch as
carbon sources by sugarcane
cell suspension cultures. Plant
and Cell Physiology, Vol. 11 (1):
183-185 p.
4. MURASHIGE T. (1974). Plant
Propagation through Tissue
Cultures. Ann Rev. Plant Physiol
25:135-165 p.
5. WINKLER, J., COOK, J, KLIEWER,
N. LIDER, A. General Viticulture.
Univ. Cal. Press. 1974.
6. NARAYANASWAMY S. (1977).
Regeneration of plants from
tissue culture. En: Reinert J. y
Bajal YPS. (eds.). Applied and
fundamental aspects of plant cell,
tissue and organ culture. Springer –
Verlag 179-248 p.
7. BACKZ-HUSEMANN D, REINERT
J. (1979). Embryo formation by
isolated single cells from tissue
cultures of Daucus carota.
Protoplasma 70:49–60 p
8. Ojima, K. & Ohira, K. 1980. The
exudation and characterization
 of iron-solubilizing compounds
in a rice cell suspension culture.
Plant and Cell Physiology, , Vol. 21
(8): 1151-1161 p
9. THORPE TA. (1980).
Organogenesis in vitro.
Structural, Physiological and
Biochemical aspects. En: Vasil,
I.K. (ed.). Perspectives in plant cell
and tissue culture. Academic Press
71-111 p.
10. TRAN THANH VAN K. (1980).
Control of Morphogenesis by
Inherent and Exogenously
applied factors in thin cell layers.
En: Vasil, I.K. (ed.). Perspectives in
plant cell and tissue culture.
Academic Press 175-194 p.
11. AMMIRATO P V. (1983). En:
Handbook of Plant Cell Culture.
DA Evans, WR Sharp, PV
Ammirato, Y Yamada (eds).
Macmillan Publishing Co., New
York 1: 82-123 p.
12. BARBA R, NICKELL G. (1987).
Nutrition and differentiation in
tissue cultures of sugar cane a
monocotyledon. Planta 89:299-
302 p.
13. WENZEL, G. y FOROUGHI-
WEHR, B. 1990. Progeny test of
barley, wheat and potato
regenerated from cell cultures after
in vitro selection for disease
resistance. Theor. Appl. Genetics,
80: 359- 365.
14. SAKURAI A., S. FUJIOKA, H.
SAIMOTO. 1991.
Brassinosteroids. Chemistry,
Bioactivity and Applications. -
Washington: American. Chem.
Society.
15. LITZ RE, JARRET RL. (1993).
Regeneración de plantas en el
cultivo de tejidos: embriogénesis
somática y organogénesis. En:
Cultivo de tejidos en la agricultura.
Fundamentos y aplicaciones. 143-
172 p.
16. RECHINGER, C. 1893.
Untersuchungen uber die Grezen
der Teilbarketi in Pfianzenzenreich.
Abh. Zool. Bot. Gaz. 43, 310 – 34.
17. BANTHORPE V. (1994).
Secondary Metabolism in Plant
Tissue Culture: Scope and
Limitations. Natural Products
Report. 303-328 p.
18. Fukui, H. & Tanaka, M. 1995. An
envelope-shaped film culture
vessel for plant cell suspension
cultures and metabolite
production without agitation.
Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, vol 41(1): 17-21 p.
19. OROSCO, F. 1999.
Establecimiento de un cultivo de
células en suspensión de
Eucalyptus cinerea. Escuela de
Química. Universidad Nacional de
Colombia, sede Medellín.
Departamento de Agronomía.
Escuela de Geociencias.
20. FERNÁNDEZ, O., OJITO, E.,
PÉREZ, L. (2002) Obtención de
flavonoides a partir del cultivo en
suspensión de células vegetales de
Matricaria recutita. Universidad
Eafit. Medellín –Colombia. pp. 65-
71.
21. Gürel, S.; Gürel, E. & Kaya, Z.
2002. Establishment of Cell
Suspension Cultures and Plant
Regeneration in Sugar Beet
(Beta vulgaris L.). Turk J Bot
22. BUENO, M. (2004). Inducción de
Callos Embriogénicos en Raíces
de Soja (Glycine max). Facultad de
Ciencias Agrarias -Universidad
Nacional de Rosario, Facultad de
Ciencias Bioquímicas y
Farmacéuticas Universidad
Nacional de Rosario; Argentina.
23. GODOY, L.; VALERA, E. y
TORRES, A. (2006) Callogenesis
y regreneracion In vitro de arroz
(Oryza sativa L.) con los
bioestimulantes cubanos
Biostan y Liplant. Universidad
Agraria de La Habana Cultivos
Tropicales. vol. 27, nº3, pag 31-36.
Cuba
24. García Chavarría M., Colima Ponce
M., Ramos Viveros V., Vanegas
P.E., Del Villar-Martínez A.A.
(2006). INDUCCIÓN DE CALLO A
PARTIR DE PLANTAS
 CULTIVADAS EN INVERNADERO
DE Tagetes erecta. En: Centro de
Desarrollo de Productos Bióticos
del IPN.

25. ALAYÓN, P. (2006). Obtención

de callos por cultivo in vitro de
pulpa de manzana cv 'Anna':
Detección de actividad de Alfa-L
arabinofuranosidasa. Universidad
Nacional del Noreste,
Comunicaciones Científicas y
Tecnológicas.

26. ORIZA, C., BUENDÍA, L.,

OROZCO, J., LECHUGA,J., CRUZ,
F. 2007. Inducción del callo en la
planta Stevia rebaudiana
(Bertoni) Hemsl. productora de
edulcorantes. Dpto. de
Biotecnología, UAM. MEXICO DF