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Teoría y practica para la extracción y purificacion de ADN de Palma de aceite.

Teoría y practica para la extracción y purificacion de ADN de Palma de aceite.

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Documento básico, util en practicas de laboratorio. Rocha 2002
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Teoria y practica para la extracci6n y purificacion del ADN de palma de, aceite

Theory and Practice for the Extraction and Purification of the Oil Palm DNA

Pedro J. Rocha Sale. varr'ieta!

RESUMEN

Uno de los mas importantes aportes a la biolog[a ha sido el teconocimiento del ADN como "la molecula de La vida". El estudio de sus propiedad,esft!ri.coqu(micas y bio]6gicas ha desarrollado, en menos de 50 anes, uu emoque totalrnen te novedoso en 10 referente ,11 origen, flujo y almacenamlento de 13 infomlacWn gen~tic:a en toeo ser vivo. Debido a que en el ADN se encuentran ctfradas Las mstrucclones que definen las caracten~tiOlSpoopias de cada organismo, drversas tecnologfas y sistemas deanfLlisis se han desarrollado para la canu;teriz.adbn de esta molecula, Los resultados de tales esnrdlos demuestran que caractenstlcas como 'Ia reststencla a enfermedades, potenctaltdades de produccton, tamano y color de los fnitos, entre otros, son debldas ala expmsi6n de la jnfurmact6n genetlca Y su tnteracdon con el media ambrente, La aplicacion de este oonocimiento se ha convemdo en una herramien ta fundamental eI!I. programas de meioramieuto genetico. PoI 10 tanto, en 101 presente revision se presentan conceptos basicos y explicactones de los metodos utilizados para la exnaccien de esa informacion genetic a empleando, como ejemplo, el protccolo usado para el aislamlento de ADN de palma de aceite (Elneis guineensis ]acq.). Se espera queesta revision sea el comienzo de una sene dearticulos en los que se vera eJ vertiginoso desarrollo de la genetica y labiotecnologia en los tiltimos ,afioo y la lmpo,rtanda de apJ±car lastecnicas moleculares en palma de aceite,

SUMMARY

One' of the most important contrtbutions to biology has been the recognition of the DNA as th~ "W'fIS molecule ". The study of lts physicochemical and biological properties has developed, in less than 5(1 years, a complete different approach in relation to the origin, flux, and storege of geneti-c information in all known living-forms .. Because inside the DNA molecule are dphered the instructions that define all the characteristics of any organism, several technologies and systems of data analysis have been developed for the characterization of this molecule. The' results ovuch studies have demonstrated that eharactess such as resistance against diseases, productivity potential, size and colour of fruits are due to the expression of genetic information and its interaction with the environmerit. Nowadays, the use of this kno~'lf!dge is. a fundamental tool in b:reedin,g programms, In this reviewf some basic concepts and explanations about methods currently used for DNA extraction, in particular the protoeol used for oil palm, are presented. This review win be the starting polmt of 11 series of papersrelated with the Importance of applying molecular rechmques In oU palm.

Palabtas Claves: Biolo~a molecular, Palma d.e aoette, AnN, M.arcadores moleculares,

1 PhD. Invesrlgador Ti tt1lllr. Labotarono de Marcadores Mo]e~ru.ares,. Area de fi.sio]ogfa. y Mej oramiento, Cenlpalma" Cal]e 2.], xo. 42C-47, Bogota, Colombia, E-mail: pedro.rochaccenlpslma.org,

PA L lit A So . Vol. 23 No, 3, .;1;002

INTRonUCCION

Las caracteristtcas H.siol6gicas y bioquimicas de todo sa vivo estan corrterridas en . sus respectivos genomas (ver glosario), Los gf'no~ .mas de bactenas, bongos, plantas,

anlrnales y algunos vtrusestan compuestos por molecules de §:(ida desoxtrnbonucletco (comunmente Ilamado ADN).U ADN es una estructura quirmca cuyos elementos, fundamentales (nucleotidos) se organizan de manera lineal geuetar!Ldo enormes secuencias de Intormacton (Fig. 11 1abb 1L). La tnformacton que define y codiflca uncaracter determmado se denomina :sen (Lew.in 1995). LOiS genes se organtzan linealmente y se agrupan formando estructur as llamadas cromosomas, los cuales pueden s,e:l: vistas ba joel microscopto durante ciertaaetapas del clclo de vida de la celula,

Los genes que posee un mdividuo en su genoma dennen so. genonpo .. La expresion del genotlpo es afectada en gran medida pOI el medlo ambients, determtnando asi lao apanencta 0 rendimiento de un individuo (fenottpc), La. genetica estudia c6mo el genotipo y el

P. J. Rocha S.

.+.

Ganotipo

Fro1elR31 B

Flgmil. 1.NIwles de organtzacten del ADN. Toda celub pcsee un nuc;1e~) en. elcual se encaentra el ADN. La ,ondemad6n del ADN eonstitnye los cromosmas, EI ADN es una doble b§!:ice contormads par nucleotidos, A lolargo de la doble cadena de ADN se locallzan 10:5 genes. los cuales eodlflcan protelnas ... La mrersccion de los gene's con el medlo arnbiente deflne las caracterlsticas extsmas de un individuo (fenotipo).

'I';tbla 1. VadadoI1l de] tarnano del genoma para alguoo:) gen(l(m~ ve~~tales. (basado en Rennet y Leltch 2001}.

Trigo Thbam

O~fia de a2!uca![, Maiz

Cafe

Palma de .8Iceit(' Papa

Yuca

Fdjol

Arroz

Uva Ambl.d.opsis

Triticum aestirnm L. Nwotfuna mbacum L. Saccharum of{icimnrm L Z~may5l.

Correa ,lUaNga L

Elaeis gumeensts jacq, Sylamui'l tube,,'owlm L Manihvt esculenM Krantz Pl!aseoJrJsvu{garls L OryZI1 .sariva L

Vi:t1s vinifem .L A:rabidopsis thaliGm

42 48 SO 20 44 32 24 72 22 24 38 HJ

16.978.500 5.733.000 3.969.000 2.670.500 1.176.000

980.000 858.000 808.500 588.000 400.000 417.000 171.500

------- Ieoria y practica parala extraccien y purificaci6n del ADN de palma de aceite

fenotipo son transmitldos de padres a hi [os ylunto con Ia btologia molecular han desarrollado recnicas de anaIIsis de poblaciones y de Individuos que permlten ubicar, caractertzar y expllcar la beredabmdad, de genes II otros fragmentos de ADN (LeVITin 1995).

La linealidad de Ia molecula de ADN y laconsecuente dtsposicion de los genes en cromosomas haoen posible q1l1e. genes vecinos se hereden [untOS. Bste necho, ~lIlnto con las herramien tas expenmentales y de analisis, han permitido generar "mapas IJ, en loseuales cualquler fragmento de ADN (marcador molecular) puede ser utilizado OOmOUf!l3 via indirecta para seguir el patron de herencta de una earacterfstica. Los marcadores moleculares establecen relaciones de veclndad con genes de tnteres, determinando su lccahzacion den tro de] genoma del organismo estudiado. En Ambidopsis thalianal~a primera planta C1l1yo genoma fue secuenclado com pletamen tel existen alrededor de 25" 5 00 genes (The Ambidopsis Genome I:nitative 2000). Cada uno de ellos varia en Iongttud, tentendo la. mayoria. de enos. entre 500 hasta varlos miles de nucleotidos .. Sin embargo.con base en la informacion obtenida pan A, thaliana y las estimaciones palla otras plantas, se calcula que s610 dd 15 811 30% del ge:noma con tiene secuenctas codtficantes (genes) .. El restante 85a 70% se distribuye en secuencias reguladoras mdispensables par a la expreston de los genes y en secuencias repetidas que varian entre una y miles de coptas por celula (The Arahtdopsts Genome IrJitati~e 20(0). Estas secuencias repetidas Sf puedenencontrar agrupadas en regtones particulates del cromosoma (centromeros y telomeros) 0 dispersas a 10' largo del genoma (Flavell y Twell 1996) .. A lit determtnacion de la posicion de genes parnculares, secuencias reguladoras y repetidas dentro del ge:n.oma se ]e denomina mapeo genettco,

Para map' ear genes, es decir, 'p r- ara determinar la

. '!j.' . .

ubicacion de una. caracteristlca (gen) en el genoma,

se hace necesarlo realizar cruzamientos yanalizar sus progenies con procedtmtentos estadtsttcos telativamente senclllos (Fig. 2). Elzltomeioramiento tradlcional ha dado las herramientas conceptuales para analizar Iaherencla de caracteres fenotiplcos evldentes, tales como tamano, celor.prcductlvldad, forma de frutos, etc. (GriffUt5 et ai: 1993). Por su pane, el area de rnarcadores moleculares ha

permitldo general y analizar multiples puntos de mformacion independien ternen te de su funclonalldad. Y es [a integracion de las des dlsciplinas la que penmte acelerarel proceso de meioramtento genenco de poblaclones e indlvidues per correlacion entre la informacion fenotl plea y la molecular,

A con tin uaclon se describen algunas de las tecnicas empleadas para manipular el ADN de plantas, En la aetualidad, la aplieacien de esas 'l:knjcas es de especial in teres para. la exitosa ejecueion de programas de mejoramlento genetico,

Pro ge nitores

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'.' P!itrrtp flwfl~nna ~Ui o~~~a,~ di;lr .1 F'liwIte rr~M q~e e:l:fi4'~~! ~ol!!r

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Figura .:;t Esquema P<:l[a..~8uir elcomportermento de una caractertstjea (gen responseble del color) en una poblacion hlpotetlca. Una plants femenma que expresa el co]o~ (gen dOl!llinan.1te) se cru z a con una planta mascultna que no 10 exhibe (gen receslvo). EJ. resultado de] ouce es una descendencta en 101. que todas las p~,8Jnta~ deesa primers gen.end6n .filial (H) presenran 0010<. Si Sf crnzan dos mtembros de esta descendencla se genera una pobladon (FZ), en la 0:131 se puede aprectar que tres de b:s. cuatro Indtvlduos posee color y uno no. Este modele de herencta de genesha side ebseevado p,Ha muchas caracteristieas, Es eoneeido como la ley de segregation de caracteres y file propuesra de J. G. Mendel had a ]865. La "pli.ald.OIll de este concepto permite prededr las proponcones e:speI!l!d.as para algunas caractensttcas en cruzamientos partlculares, (Lewin [995).

PA_ILMAS • Vol. .23 No.3, 20®r:l: 1:1

P J. Rocha S.

AISLAMIENTO DEL ADN

El primer paso para desarrollarexperlmentos con marcadores moleculares es la extraccion del material genenco de plantas que, pm sus caracteristtcas fenotip].eas, poseen earacteres agronomtcos de mteres. Para la extraccion del ADN vegetal es necesarlo tener en cuenta tres factores:

I. El tipo de plant a y de tejido que se va a emplear como fuente. POol etemplo, 105 teiidos jovenes contienen mas ADN que los tejidos vtejos, Ademas, es necesartoconsiderar la compostcton bioquirnlca de 1'OS tejidos, POI e] ernplo, el metodo de extracclon del material genettco proventen te de te] tdos I] cos en compuestos fenolicos es diferente al metoda empleado con tejtdos rims en carbohidratos Q acettes.

2. El npo de ADN que Sf va a extraer, Las plantas, poseen tres tlpos de ADN: el nuclear, el mitocondrial y el cloropiastico, Reciben estes nombres dependtendo del ttpo de organelo celular en el que el ADN se encuentre, Los; distinros tipos de ADN tienen caractertsttcas bioquimlcas seme] antes, SIn embargo; el tlpo de inform acton biol6gica que codifican es com pletamen te dlferente.

3,,, .El tl po de analisis a realizar (RFLP/:RAPD r AFLP, secuenctacion, etc). Con base en la cantidad y la calidad del ADN se pueden desarrollar diversas tecntcas de analists, alglllnas de· las cuales seran explicadas con mayor detalleen proxtmos articulos,

.lEA objetivo principal en un experlmento de extraccion de ADN es obtener una preparacton de buena calidad y en gran cantidad, La calidad se reftere a la posiblhdad de almacenar el ADN por tiempo mdeftnido, manteniendo su estructura y propiedades yes, la calidad del ADN el factor responsable de la reproduciblldad en experimentos posteriores .. La cantldad, por su parte, es 111n concepto relative que depende, entre otros, del numero y estado de las celulas propias del te] ido a estudiar, POI 10 tanto, como regla general, un buen metodo de extraccion debe mantener Ia in tegridad flsica y bioquimica del ADNe Incrementar sus tangos de pureza y concentracion (Sambrook et at 20m).

En plantas existen multiples protocolos pam extraer y purificar el ADN. Sin. embargo, .,todos ellos incluyen cuatro pasos, indispensables:

L Ruptura de tejidos y parades celulares.Este paso consiste en pulvenzar el material vegeeal a ba] as remperaturas, generalmente empleando nitrogeno liquido 0 hielo seco (Rogers y Bendich 1988). Tambien exlste la pulvenzacien en seco, un proceso 'en el cual los tejidos se deshidratan pm secado en un homo 0 con silicagel, Sin embargo, €ste procedimiento no es de aplkacron general yen palma de aceite, pOl' ejemplo, el tratamtento de secado no permite re'cuperar ADN de buena. calidad, Para degrader paredes celulares se pueden u tillzar, ademas, enzimas tipo celulasas.

2. Ruptura de membranas, Una vez el tejido es disgregado en. celulas se hace necesano romper las membranas celulares para. liberal el ADN. Es to puede ser llevado a cabo qu,imicamente con' detergentes (SDS, Tri ton 0 detergentes comerciales). Tambten se emplean metodos tisfcos, como aquellos basados en ultrasomdo.

3.]nhIbi.tion de enzimas que destruyen al ADN.

Como un mecanlsmo de defensa natural, las celulas connenen enzlmas que destruyen al AnN (ADNasas). Estas enzimas deben ser tnacttvadas para garantizar la calldad de las preparaciones de ADN. La mhl blcion puede realtzarse mediante metodos fistccs, tales como desnaturaItzacton pOI calm (a. tern per aturas de 65 C) 0 con metodos qutmicos (rablas 2 y 3), Bstos uitimos Incluyen tratamiento 'con sclventes organicos (fenol y cloroformo), con antioxi, dantes (Ditiothreitol y ~~mer,captoetanolL con agentes quelantes (EDTA, EGTA) quecapturan los iones magriesio necesartos p,ala la funcionaltdad de las ADNas.as, 0 con agentes caotropicos que actuan removiendo el agua estructural de las protelnas (RoOgers y Bendich 1988), Por 10 general se urllzan mezclas de varios de estos reactivos para asegurar la inhibition de tales enzirnas.

4 .. Extraccion de contamtnantes. El objetivo de extraer ADN es obtener preparadones enrtqueddas en esta molecule. Sin embargo, el ADN esta asoctado con proteinas (histonas) e inmerso en

Ie orr a y pra,c t ica para la ,ext race ion y pu rifi G-aJci6 n de I ADN de pa I rna de a ceite

Tabla 2. Algunos agentes eontamtnantes en preparacsones de' ADN y altemativas para su extracdon (basado en Sambrook et al. 2001; Taytar.et al. 1993; Rogel's y Bendich 1988)_

Ltptdos Y graM!>

Proteinas

Plgmentos

ARN

Ak-oho]es

Compuestos fenolices

Detergentes

Sales

S6Hdos Jnsolubles

un medic que contiene estructuras de composfcien qul mica diversa, Ademas, los reacttvos empleados en los prooesos iniciales de puriffcaclon se convierten en agentes contamlnantes (Tabla 2). Las metcdologias para, retirar los contaminantes de unapreparacion de ADN incluyen: la centrtfugacton a altas velocidades, la electroforests, la separacion a traves de columnas e Incluso lao utilizacion de Imanes (btomagnettca) para obtener prepar aciones de alta pureza. Un contaminante generalmen t:e presente en preparadones de ADN es el ARN (actdo nbonucleico). Esta molecula se degrada par mcubacion con la enzima ARNasa.

Todos los pasos anteriorrnente mencionados se basan en las caractertsttcas f]si.coqulmic~s deli ADN. Pues aparte de ser una molecule de alto peso molecular, nmy larga y dellcada, es un ,ac~do capaz de formal sales can tones cargados positivamente (canones), Ademas,- es soluble en soluciones concentradas de sales (sal de cocina, por ejemplo), pew insoluble en alcoholes (tipu etanol 0 isopropanol). Ad]d,analmentel el ADN es destruldo (depurinado)

Incubaden enzimatica (con lipasas),

Uso de detergentes (SDS, Triton). 'Itatamlento ron cloJofmmo. alcohol isoamfheo,

lncuhadful enzlmatica (con proteasas), Bxrraccien con f~nol y cloroformo. Uso de detergentes,

Usa de alcoholes,

lnrubad6n enzimatica (con Amasa).

Electtofore:sis" .

Cambios en el pH-

Evaporad6n a temperatura ambiente,

'Iratamteneo ron dorofonno y alcoholes,

Uso de solventes organicos.

Uso de' etanol al 7006.

Uso de soJuctones acuosas con postenor ce.:nttifugad6:n.

at pH actdo (menor de 4,0)1 es insoluble a pH 5.6, pew es soluble a pH 8,0. Por 10 tanto, los procesos de extraccion, puriftcacton y alrnacenamiento del ADN deben mantener el pH optimq y brindar una alta coneentracion ionica (HoweU 1973),

Ya con el conocimiento de las caracteristtcas generales delos procedtmlentos deextraccion de AnN; a corrtmuaclon se presenta uno de los protocolos de extraccion de ADN de palma de acelteunlizado en Cenipalma (Vtllegas y Fuentes, datos sin publlcar), Dicho protocolo es una vartacton de la metodologla propuesta por Dellaporta et at (1983),

PROTOCOLO DE EXTRACCI6N BE ADN DE PALMA DE ACEITE (CENIPALMA)

1 Recolectar 8 g de tejldo foliar [oven y fresco.

Si debido at razones loglsttcas no se puede pmcesar el material el mismo dia de la recoleccion, ni tampoco se cuenta con mtregeno liquido 0 hielo seco para. almacenar 10, se puede

MlMAS • Vol. as N!O. 3, :2.0002 n

P.. J Rocha S.

mantener humedecido atemperatura ambtente por no mas de tres dias, Sin embargo, el te] ido foliar se puede almacenar a -80QC pOI

~ ttempo tndefmldo,

2. Pulverizer el tejtdo con nttrogeno liqutdo,

3, ' Afliadir 8 ml de solueton de extraccion, Dtcha sol udon con ttene 1 S I) mM de Tris-H C], pH 8,0; ]5 mM de EDTAJ pH 8,0;' 1 Mde cloruro de sodlo, 1 % (peso/volumen) de eTAB; 1% (peso/volumen) de. PVP-3600 y 5% (volnrnen/ volnmen) de ll-me:n::aptoetanoL Us funciones de cada reacttvo en la solucien se presentan en la Tabla S,

4. Incubar a 6SaC en bario Marta durante 30 rum.

Mezclar el tuba deltcadamente cada M I) minutes, Este paso permite desnaturalizar (destrutr) las enzimas y demas proteinas pre:sen res en el tejido foliar pulvenzado,

5. Centrlfugar a 2.000 x g~ durante 15 min . Este paso remueve todos los residues soltdes de la preparacien.

6. Transferlr La fase acuosa superior (sobrenadante) a un tube ltmpio y anadlr medic volurnen (4 ml) de fenol, AgUar suave-mente. En este paso Sf stguen destruyendo Ias proteinas (debido a la presencia del Ienol).

7. Centrifugal a. 2.000. x g, durante 20 min.

S. Transferir el sobrenadan te 8. un tuba Urn pic y anadtr medio volumen (4 ml) de: doroformo .octanol,

9 . lncubar la mezcla con agitacion, durante una hora, a temperatura am bien te,

10, Centrifugar a 2.000 x S, durante 20 min.

111.. 'Iransfenr el sobrenadante a untubo limpio y afiadir 1/ 10 del volumen (a pmx. 0,8 ml) de acetate de sodio 3Mj. pH 5j2, frlo (~.20PC) y 6/ 10 de] volurnen (aprox .. S ml) de isopropanol frio (-20°C) .•

12: .. Jncubar a ~ZOOC durante dos d]CLS.

13. Despues de la mcubacien, cen trnugar a 2.000 x lei durante 30. min a temperatura ambiente. l4!. Desecharel liquido teniendo cuidado de no perturbar el boton de ADN que se fonna. al fonde del tubo,

15. Afiadir 2 ml de etanol al 70%. Esto ayuda a rettrar las sales que se preclpitaron Junto con el ADN.

16, Centrlfugar a 2.000 x. It,. durante 3 min a ternperature amhtente ..

17,. De] ar secar e~ bot6n de ADN a tern peratura ambtente,

18 .. Anadtr 0,.5 ml de agua destilada estern y resuspender el boton de ADN agitando, suavemente,

19. AfiJ.~dh 0,1 ml de una soluoon de AlRNasa de '0,1 mg/ml. Ineubar duran te una. hora a 3 rc;

20. Alrnacenar el AON extraido a 4 DC s.i se va a. uttllzar en menos de tres dtas. Alternatlvamente, el almacenamiento por largos perlodes puede realizarse a _woe.

Conla aplicacien de este protocolo, se considera una. buena. extraccton aquella que presen fa ntveles muy bajos de agentes contaminantes y permite obtener alrededor de 80 mg de ADN porcada gramo de tejido foliar 111 tHizado. Una m uestra de AD N con estas caracteristicas puede almacenarse durante vanos anos a batas tern peraturas sin perder sus caracteristicas fisicoquimicas m btologtcas,

VERIFICACI6N DE LA CALInAD Y LA CANTIDt).n DE UNA PRE,PARACION DE ADN

El ADN qu.e ha side extraido de un tejtdo debe ser cuantificade y su cahdad veriflcada .. E1 metodomas em pleado para la. determlnacien slrnul tanea de estas caracterisncas es la electroforests engel de a.garosa. (Fig, 3). Esta tecnlca se fundamenta enla migracton de las moleculas de ADN r a traves de una, matrizgelatinosa, deb ida a 1.1 aplicacion de 1l1]) campo electrlco, La detecclon visual del ADN se neva a caboutillzando una sustancla sensible a la lua ultravioleta, el brornuro deetidio (Sarnbrook et al. 20(2), Este compuesto es un agente carctno:genko que actua intercalandose dentro de la Goble heltce dd ADN.

La cuanttficacion tambien se puede realizar em pleando unespectrofotnmetro, el cual detecta la radiaclon emitlda por las bases nitrogenadas presentes en el ADN luego de ser excttadas con luz de 260 nm. De igual manera se puede emplear un fhrorcmetro, el cual cuanrifica la emlsion de energia de los compuestos qulmlcos (fluolocromos) que se intercalan dentro del ADN.

CONSInERACIONESFINAl,lIES

E1 desarrollo de la genetica y la blotecnologia ha side vertiglnoso en los ultlmos anos y ha heche

Ieoria y practice para 1(1 extraccicn y punticacion del AON de palma de aceite

Tabla 3. Caractensncas y funciones de algunos de los reacnvos empleados en [a extraccton de ADN provenlente de diversas fuentes vegetales (Sambmok e. al., 2001).

-- ---_---

- -

Ttb (h.idroximeti~ amino metano)

1I:amp6n btolcgtco

EDTA (addo enlendtamnrtetracettco)

Agente quelante

norma de sodio,

Sal

Cloture de potasio

Sal

Acetato de sodio

Acetato die potaslo

Sal

Fencl

Sclvente organlco (fDXICO}

Cloroformo

Solvente org.inlm (TOXICO)

SDS (dod.edl suU~t() de sodlo)

Dete]'.genteani6mco rroxxx»

Sarkosyl (laurtl sarcoslna)

Detergente anionico

crAB (hexadectl tnmenl bromuro de amonio)

Dete:rg.ente cati6nim

Tnton X-lOO

D@wrgente

~- Mfrc1.Iproetanol

AD.1Itioxlid,mte

DTI (d1il'iotllllieitol)

Antioxidante

o ctanoh Isoamilalcohol

pvp (polrvmil ptrrolidonel

Detergente

Etanol

Alconot

tsopropancl -

}\.kohoI

Enzima

posible incrementa! la productrvidad y general nuevos cultivates. Diversas tecnologias y sistemas de analisis se han Intrnductdo como herramientas fundamentales para set aphcadas en programas de mejoramtento, Sin embargo, con base en todos

E.$talbi]iz.a el pH de 131 sojucton (entre 7,0 Y S,O)

Am.pa los Jones magnesio presentee en el medic Valia evitar la accten de enznnas que degradan OIl ADN.

A altas ooncentraeiones solubilize al ADN.

Equilibra fuerza i6rricas.

Preclpi ta proteinas,

Denatura proteinas,

Denatura proteinas, Remueve lipidos,

Snlubiliza 011 fenol y 10 dimina de La soJuci.6n.

Soluhlllaa proteinas y membranas,

Inhfbe hexoqulnasas,

So]uhlUza protefnas y membranes.

Solubiliza poltsacandos,

Solubiliza proteinas y rnem branas.

Inactive protetnaspor reduccinn de los puentes disulfuro,

Reduce los gropos sulfuro de las proteinas,

Ageme antloxtdante.

Disminuye la formaci6n de espumas e interfases. I1imina compuestos fenolieos que pueden Inhlbir Ia acnvidad de enztmas.

Preciplta acidD'S nucletcos,

Prectpita acidos nuclelcos,

Deg:r~daARN.

estes avances y descubrimlentos.el actor principal slgue siendo la Informacion gen.eUca.} especiftcamente el ADN. En esta revision se presentaron algunos conceptos bastcos para la extracdon del ADN. En proxtrnos articulos se descritnranalgunas

pAlMAS . V()I. 23 Nio. 3:, 2002' 1.5

P. J. Rocha S.

(A)

(C)

(D)

Figura .3. tlectroforegramas de, preparaciones de ADN provemente de dlversas palmas de aceite. Se muestran geles de agarosa al O,S%,te11idos con bromuro de etidio. (A) ADN de buena calidad. (B) AnN can impnrezas, (C) ADN con presencia de ARN contamlnante. (D) ADN degradado por acd6n mecanica 0 presencia de ADNasas. RegistlOs tornados del centro de documentaclon de geles del Iaboratorio de Marcadores Moleculares de Cenipalma.

de las tecntcas que permiten obtener la Informacion clfrada en esta molecule.

AGRADECIMIE~NTOS

El autor expresa sus agradecimientos a Coktencias por el apoyo bnndado durante su formacion doctoral. Adjcianal.mentel agradece a la Ora. Esperanza Tones (Centro In ternacional de Fistca, O.F) pOI SU opinion crittca sobre este texto y a 100 companeros de Centpalma por sus valiosos comentarios. Esta publicacion hace parte del proyecto ftnanciado por Centpalma y FONTAGRO, Convenio de Cooperacion Tecnica [J CA- HID- FTG- 5 81 ]_ 9 99 ,f:TG- 011 rsss Y FTG-2411999. La investtgacion de Centpalma es apoyada por el Fondo de Pomento Palmero de Fedepalma.~

BIBllOGRAFIA

HENNET~ M.D.; tE.J rCH, n 2001. Angtosperm DNA C"vlIlues database (release 3.[, Sept. 20(1). http:// www.roglkew.olg.1IJk/cva]/h.omepage.html

DELLAPORTA, S.L.; WOOD, §.; HICKS. j.a 1983. A plant DNA mmipseparation: Versten It Plant Molecular Bialogy Repoiter f&tados Umdos) v.l no.14, p.19.ZL

FLAVELL, R.B.; 'J"lIVELL, D. 1996. Plant genome constituents lind therr orgamsetion.Js; G.D. foster; 0.. TwelL (Eds.). P~1!Jn t Gene Isolation, John WHey & Sons, London.

GRIFFrTHS, A.J.f~; MlLLER,J,.H.; SUZUKI, D.T.; UEWONITN, R .. C., GF..LGAR'll, W.M. 1993. An Introduction to Genetic Analysis. 5t~ ed. W.H. Freeman and Company, New York

lEWfN, B .. 1995. Genes V. Oxfo:rd University Press, New Y01.!k. R:OGERS, S.O.; BENmCH. AJ. 1988. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6: 1- ]0. Kluwer Academic Publishers, Belgium.

SMfBROOK, §.; RUSSElL, D.W; SAMBROOK, J. z001. Mo· lecular Cloning .. 300 ed. Cold Spdng Harbor Laboratory, New York.

TAYlOR. B.H.; MANHART, §.R; AMASTNO, R.M. 1993 .. Isolation and cilaracreJiislItion of plant DNAs.lu: DR Glick; J.E. Thompson, (Eds.), Methods in PLant Molecular 13.]0- logy and Biotechnology. eRe Press. Florida. p.3 7 -47.

The Arabidopsis Genome Imtiattve. 2000_ Analysis of the genome sequence of the flowerlng plant A.mv!'dops's thaUana. Nature (Inglatierra) v .. 408, p.796.81S_

-------- Teori8 t crachca oara la extraccion y pu rificacion del ADN de pal rna de aceite

GLOSARIO

ADN:. (AcJdo desoxtrnbonucletco). Es la molecula responsable de almacenar todas las caracteristicas (genes) de unmdtvtduo y transmtttrlas a su descendencia, Oufmicamente es una estructura quimica compleia cuyos componentes (denomlnados nucleotidos) se organizan de manera lmeal, generando enormes secuencias de Informacion.

Cromosomae Es un "paquete" de genes y ADN presente en el micleo de una celula. Diferentes clases de organtsmos ttenen dtferentes numeros de cromosomas. El sell humane, por ejemplo, tlene 23 pares de cromosomas, mlentras la palma de acette tlene 32parfs., Cad-a mtembro del par de cromosomas es aportado por el padre y por Ia madre del individno.

F>enotipo: Es el resultado de la expresten del genonpo, es dectr, es la apartencta externa de unmdrviduo. Tambten se expres.a como el resultado de la Influencia del medio ambiente sobre el genotipo,

Gen: Es un fragmento de ADN que codtftca para una caracterlstica determinada .. En otros termmos, es la unidad fislca y fundonal de la herencia pasada directamenre de los padres at su descend end a .. POlL ejernplo, caractensticas tales como co lor, altura y forma estan codittcadas por uno 0 mas genes.

Genoma: Es Ia dotacton genettca completa de cada ser vivo. En otros terrrrinos, es la coleccion de informacion hereditana que un tndivlduo ha loci btdo de su-s progenttores,

Genotl po.: Represen ta los genes transportados por un tndtvlduo,

Ot1105.

Marcador Genettcc 0 Marcador Molecular: Es un segmento de ADN que puede ser idenuflcado y locallzado flsicamente sobre un cromosoma y cuya herencia puede set seguida, Un marcador puede ser un gen! 0 puede ser una secdon de ADN sin functon conoctda. Ejemplos de tecnicas que generan marcadores moleculares son los RFLP, RAPD Y AfLP •. entre

AFLP = Poltmorfismos en la Ioogttud de fragmentos amplicadns, RAPD = Pellmorfismos de ADN amplntcados aleatortarnente,

RfLP = Poltmorflsmos en lalongitud de fragmentos de restnecton.

Mapeo de genes: Es un metoda de anallsis que permite lla determinaclon de las poslciones relattvas de los genes en un cromosoma y las distancias entre ellos, La representacion graflca que muestra las Iocalizacienes Iislcas de los genes y marcadores en cada cromosoma se denomina mapa ffstco,

Nucle6tido: Es el componente estructural basico del -ADN. Quimi,camente es una. molecula eompuesta pOI una. base nttrogenada, un azticar de cinco carbonos y un grupo fosfato. Delndo ,a que el ADN es una doble bl::Hcel su longitud se mtde en pares de' nuelectidos (opares de bases),

Secuendad6n: lis una recnlca qllle permits oonocerel orden de los nueleottdos en una! molecula de ADN

PALJM.AS, • \llel. 29, No" 3, :200.2 17

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