UNFV/FIIS ANÁLISIS MICROBIOLOGICO HONGOS

PRACTICA Nº 6

ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE LOS HONGOS

I.- INTRODUCCIÓN

a) OBSERVACIÓN DE LOS HONGOS

Frecuentemente pueden observarse crecimiento de hongos sobre los alimentos

y otros materiales. Se examinan estos sustratos con un lente simple pueden
distinguirse el cuerpo vegetativo formado por una masa de filamentos
ramificados e interlazados denominada Micelio. Cada filamento de micelio
constituye una Hifa. En algunos hongos, el protoplasma recorre las hifas en
forma interrumpida, constituyendo hifas Aceptadas o Cenociticas. Las hifas de
otros hongos tienen paredes transversales llamadas septos con uno o varios
poros que permiten el paso del protoplasma. A este tipo de hifas se les
denomina Septadas. Los hongos se reproducen asexualmente a través de
esporas asexuales desarrolladas dentro de un esporangio, se denominan
Esporangiosporas. Si las esporas se reproducen libremente en el extremo o al
lado de las hifas, se denominan Conidiosporas.

Existen hongos unicelulares que no forman estructuras filamentosas, estos

reciben el nombre de levaduras y pueden distinguirse de las bacterias por su
mayor tamaño y por la presencia de un núcleo simple.

Ocasionalmente puede observarse el desarrollo de estructuras conspicuas

denominadas Cuerpos Fructíferos los cuales portan las esporas sexuales de
reproducción. Estas estructuras se utilizan como base de la clasificación natural
de los hongos. De esta manera se definen tres divisiones: Zygomicota,
Ascomicota y Basidiomycota.

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El micelio de los Zygomycota es aceptado excepto en las estructuras de

reproducción. Los miembros de esta división forman esporas asexuales de tipo
esporangiosporas. Las esporas sexuales son la denominadas Zigosporas que
desarrollan en ausencia de un cuerpo fructífera.

Los hongos al igual que la mayoría de las bacterias son heterótrofos, ningún
hongo es capaz de crecer bien en ausencia de sustancias alimenticias
orgánicas.
Ningún hongo posee pigmentos fotosintetizantes y ninguno es capaz de utilizar
el dióxido de carbono. Sin embargo, en presencia de un suministro exterior de
azucares de otro alimento orgánico, muchos hongos exhiben una sorprendente
capacidad de síntesis y produce una gran variedad de sustancias orgánicas
complejas.

La mayor parte de hongos son filamentosos. Los filamentos conocidos por hilos
están ordinariamente muy ramificados y forman colectivamente el talo
vegetativo o Micelo. En los hongos superiores las hifas pueden agregarse
para formar estructuras sólidas complejas que en algunas especies pueden
alcanzar un tamaño muy considerado.

Los Ascomycotas tienen micelio septado. La reproducción asexual es muy

variada involucrando procesos de fisión, gemación, fragmentación, formación
de Clamidiosporas o formación de conidias, dependiendo de las especies y de
las condiciones ambientales.
La fisión y la gemación son comunes en levaduras mientras que la mayoría de
ascomicetos forman uno o varios grupos de esporas terminales llamadas
Conidia que desarrollan a partir de hifas ramificadas llamadas Conidioforos y
Esterigmas.

Las esporas sexuales son llamadas Ascosporas desarrolladas dentro de sacos

y protegidos en cuerpos fructíferos denominados Ascoscarpos. Estas
estructuras pueden ser de tres tipos: CLEISTOTECIO, PERITECIO Y
APOTECIO, dependiendo de las características de cada grupo de Ascomycota.

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Los presentantes de los Basidiomycota incluyen especies filamentosas

levaduriforme. Entre las formas filamentosas y levaduriforme. Entre las formas
filamentosas puede encontrarse especies microscópicas y macroscópicas.
Estas últimas forman cuerpos fructíferos visibles que portan las Basidias y
estas a las Basidiosporas o esporas sexuales. Los basidiomicetos se
reproducen asexualmente a través de conidias, el micelio es septado y
mayormente constituido en porciones anastomosadas a manera de pseudo-
tejido, que forma los Cuerpos. Fructiferos.

b) HABITAD:

Los hongos ocupan una amplia variedad de ambientes. La mayoría ocupa los
lugares húmedos de la tierra, aunque algunos en particular las especies de
Aspergillus, Penicillum pueden resistir unas condiciones de mayor sequedad.

Muchos hongos son parientes activos de plantas, incluso de las más

importantes plantas cultivadas y algunas especies causan enfermedades en el
hombre y en los animales domésticos.

C) REPRODUCCIÓN:

La reproducción en los hongos se realiza habitualmente por esporas. Los más

frecuentes son unas células aisladas incoloras, pero pueden poseer gruesas
membranas esculpidas pueden llamar apéndices o pueden estar rodeadas de
una cubierta gelatinosa. La mayor parte de los hongos producen mas de una
especie de esporas, cuando las condiciones son favorables al crecimiento de
estas.

La mayoría de los hongos son muy variables, tanto en condiciones naturales

como en el cultivo de laboratorio. Algunas veces la variación esta inducida por
cambios en las condiciones ambientales y el hongo regresa a la forma manual
cuando revierten los cambios ambientales.

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También ocurren al tener una base genética de los cultivos de placas petri se
pueden producir sectores que difiere del resto del cultivo con algunas
características, como la forma, el color, la velocidad de crecimiento y la
intensidad de esporulación.

d) VARIACIÓN AMBIENTAL:

Los hongos son afectados por muchas influencias ambientales, como la

naturaleza y la concentración del suministro nutritivo, la humedad, la
temperatura, la luz y la concentración de hidrogeniones.
Los cambios de estos factores pueden inducirnos cambios tan grandes en la
morfología, que hace difícil el reconocimiento del hongo.

e) VARIACIÓN GENETICA:

Los estudios recientes sobre las bases genéticas de la variación en los hongos
han demostrado que son validos los mismos principios que para los
organismos superiores.

II.- OBJETIVOS:

 Observar el desarrollo de hongos miceliares y levaduriformes y

sustratos de diferentes orígenes e identificación de los géneros mas
frecuentes.
 Aislar en medio de cultivo los diferentes géneros de hongos que
frecuenta el medio ambiente y determine sus características.
 Determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a
través de un cultivo en cámara húmeda y mediante observaciones
periódicas al microscopio.

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III.- MATERIALES Y METODOS

 Material infectado
 Lamina porta y cubre objeto
 Solución colorante: azul de metileno
 Dispositivo para cultivo en cámara húmeda
 Asa de siembra con mango de kolle
 Tubos de ensayo con tapa estériles
 Placa petri Pyrex estériles
 Agua destilada estéril
 Gradilla de tubos
 Lunas de reloj, espátula y baguetas
 Vasos precipitados y Erlenmeyers
 Probetas y Pipetas estériles
 Goteros
 Varilla de Vidrio en *U*
 Gillette estéril
 Mechero Bunsen
 Incubadora
 Estufa
 Autoclave
 Balanza Analítica
 Microscopio
 Aceite de Inmersión.

Reactivos y medios de cultivo

- Agua destilada
- Agua Peptonada
- Agar Saboraud
- Agar Nutritivo
- Agar Plate Count
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IV.- PROCEDIMIENTOS
1.- OBSERVACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS

a).- OBSERVACIÓN MACROSCOPICA

 Observe cuidadosamente cada substrato infectado y determine el tipo de

colonia que desarrolla.
 Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.

b).- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

 Coloque una gota de azul de metileno en una porta objetos limpio y

drenado.
 Con ayuda del asa de kolle en forma de gancho o de un estilete,
extraiga una pequeña cantidad del micelio de una muestra y colóquelo
en la gota de colorante.
 Coloque sobre la preparación la lamina cubre objeto.
 Observe al microscopio bajo el objetivo de 10-40 de aumento.
 Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del
hongo.
 Con la ayuda de láminas referentes trate de identificar él o los géneros
que observe.

2.- AISLAMIENTO DE HONGOS DEL MEDIO AMBIENTE

 Elija un punto determinado del ambiente que quiera evaluar.

 Destape la placa petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume
que las esporas de hongo se encuentran suspendidas). El tiempo de
exposición puede ser de 5 a 10 minutos, vuelva a tapar la placa,
identifíquela con su nombre, grupo y el lugar de muestreo.
 Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.
 En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 ºC por 4 a 5 días.
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 Transcurrido el tiempo, examine las placas y realiza una descripción

detallada de las mismas.
2.1.- PREPARACIÓN DE MEDIOS

a).- Preparación del Agar Nutritivo.- Pesar 2 gr. de agar nutritivo y disolverlo
en 100 ml de agua destilada. Licuarlo y
luego colocar 9 ml de este en 3 tubos y luego esterilizar.

b).- Preparación de Agua Peptonada.- Pesar peptona al 0.1% para 120 ml

de agua destilada, es decir pesar
0.012 gr. de peptona. Luego colocar también 9 ml en 3 tubos y luego llevar a
esterilizar en la autoclave a temperatura de 121ºC por un espacio de 15
minutos.

2.2. - CONTEO EN PLACAS

En teoría, la enumeración de bacterias y hongos en muchos tipos de

especimenes, se basa en el supuesto de que cada microorganismo dará origen
a una colonia después de la incubación en medios adecuados.

Una cantidad medida del especimen o de una dilución de la misma mezcla en

una placa petri esterilizada que contiene agar derretido. Después de la
incubación se cuenta el número de colonias que están creciendo en el agar,
para obtener el cálculo de la población bacteriana del espécimen original.
Aunque existen diversos factores que limitan contra este como un método
inexacto, la técnica es sencilla y rinde resultados bastante satisfactorios para el
uso rutinario.
- Observe la placa contra el fondo iluminado y cuente él número de
colonias.
- Multiplique el número de colonias por la dilución de la muestra.
- Escoger la placa que contenga 30 – 300 colonias.

Para evitar una actitud física y sin embargo expresar los resultados numéricos
mediante un método conforme con la precisión de la técnica empleada, el
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número registrado de bacteria por ml no debe incluir más de 2 cifras

significativas. Por ejemplo un conteo de 142 se registra como 140 y un conteo
de 155 como 160 y mientras que un conteo de 35 se registra como 35.

3 .- CULTIVO EN CAMARA HUMEDA

Un dispositivo para cultivo en cámara húmeda es un sistema que consta de

una placa petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio de “U”
que soporta dos laminas porta y cubre objetos. Asépticamente se selecciona
una pequeña porción de medio de cultivo estéril (Agar Saboraud), y se coloca
sobre la lámina porta objetos. Realizada la siembra del hongo en estudio, la
preparación se cubre con la otra lamina y el papel filtro humedece conservando
la asepsia. La placa es incubada a temperatura ambiente (20 – 25º C) por 4 a 5
días.

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PROCEDIMIENTO

1. Utilizando aguja de kolle o estilete, pique una colonia y extraiga una

fracción mínima de esporas o micelio.
2. En forma aséptica deposite esta fracción sobre la porción de agar
dispuesta en el porta objeto de la cámara húmeda.
3. Con la ayuda de una pinza estéril cubra cuidadosamente la preparación
con la lamina cubre objetos.
4. Humedezca el papel filtro de la placa con agua destilada estéril.
5. Incube la placa a temperatura ambiente (20 – 25 º C).
6. Examine diariamente al microscopio la lámina sembrada hasta verificar
el completo desarrollo del hongo. Retire cada vez la lamina de cultivo de
la cámara húmeda y una vez realizada la observación vuélvala a su
lugar cuidando de mantener la humedad constante, si es necesario
añada mas agua al sistema.
7. Observa la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificación del
micelio, la aparición de hifas diferenciadas y el desarrollo de las
estructuras de reproducción.
8. Con la ayuda de un manual de identificación de hongos determine el
género correspondiente.
9. Elabore en detalle los esquemas de cada etapa de desarrollo.

VI- RESULTADO Y DISCUSION

VII.- RECOMENDACIONES

VIII.-CONCLUSIONES

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IX.- CUESTIONARIO:

1. Defina: Factores intrínsicos, Factores extrínsecos, microorganismos

endógenos, microorganismos exógenos.
2. ¿Qué consideraciones se deben tener para elegir la Temperatura de
incubación?
3. Explique los microorganismos como productores de almidón.
4. ¿Cuáles son los controles de calidad que se realizan durante la
elaboración de productos de confitería.
5. Explique sobre las levaduras.

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