AVALIAÇÃO DA TERAPIA FOTODINÂMICA MEDIADA POR ROSA BENGALA SOB

AÇÃO DO DIODO EMISSOR DE LUZ EM STREPTOCOCCUS MUTANS

Costa ACBP1, Chibebe Jr. J1, Pereira CA1, Machado AKS1, Beltrame Jr M2, Junqueira
JC1, Jorge AOC1
1
Universidade Estadual Paulista (UNESP)/ Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, Av. Eng.
Francisco José Longo, 777 – Jd. São Dimas – São José dos Campos, SP – Brasil – e-mail:
carol_biolog@yahoo.om.br
2
Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP)/ Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), Av. Shishima
Hifumi, 2911- Urbanova – São José dos Campos, SP – Brasil – e-mail: beltrame@univap.br

Resumo- O objetivo do presente trabalho foi avaliar a fotossensibilização do corante rosa bengala por
Diodo Emissor de Luz (LED) sobre culturas planctônicas de Streptococcus mutans. Foram utilizadas 9
cepas clínicas isoladas da cavidade bucal e uma cepa padrão (ATCC 35699). Foi utilizado rosa bengala na
6
concentração de 2 µM e LED azul (440-460 nm). Suspensões microbianas na concentração de 10
células/mL foram submetidas a diferentes condições experimentais (n= 10): a) irradiação com LED na
presença do fotossensibilizador rosa bengala (F+L+); b) irradiação somente com LED (F-L+); c) tratamento
somente com o fotossensibilizador (F+L-); d) grupo controle, sem utilização de LED e fotossensibilizador (F-
L-). Após os ensaios, as amostras foram semeadas em ágar BHI para contagem de Unidades Formadoras
de Colônias (UFC/mL). O número de UFC/mL no grupo F+L+ foi inferior ao grupo controle (F-L-) com
diferença estatisticamente significante entre os grupos (Teste de Tukey: p ≤ 0,05), com redução de 6.86
log10 para o grupo F+L+. Conclui-se que a Terapia Fotodinâmica com rosa bengala apresentou efeito
antimicrobiano sobre todas as cepas de S. mutans estudadas.

Palavras-chave: Streptococcus mutans, Terapia Fotodinâmica, rosa bengala e Diodo Emissor de Luz (LED)
Área do Conhecimento:

Introdução mecanismo fotodinâmico consiste na formação de

Os estreptococos do grupo mutans despertam
grande interesse em razão do seu papel na
etiologia da cárie. As espécies Streptococcus
mutans e Streptococcus sobrinus são os agentes
mais importantes na formação do biofilme
dentário, responsável pelas lesões de cárie de
superfície lisa (GE et al., 2008). O biofilme
dentário é formado a partir da agregação
microbiana inserida em uma matriz polissacarídica
(AHN et al., 2008). S. mutans apresenta
capacidade de formação de biofilme devido à
secreção de polissacarídios a partir do
metabolismo da sacarose que confere
propriedades de adesão às superfícies duras
(ALMEIDA et al., 2002).
O controle da cárie baseia-se na boa higiene
bucal obtida pela remoção mecânica do biofilme,
associada ou não ao uso de substâncias químicas.
Novas estratégias, como a Terapia Fotodinâmica
(TFD), estão sendo desenvolvidas para somar ao
arsenal terapêutico com o objetivo de controlar a
população de microrganismos cariogênicos na
cavidade bucal (ZANIN et al., 2005); (GIUSTI et
al., 2008).
O corante rosa bengala é um haleto derivado
da fluoresceína, usado em oftalmologia para o
diagnóstico de doenças oftalmológicas. Seu
80% de oxigênio singleto e 20% de ânion
superóxido com absorção de luz na faixa de 450-
600 nm (PERUSSI, 2007); (PAULINO et al.,
2005a). O potencial fotodinâmico do rosa bengala
em bactérias Gram positivas e negativas já foi
demonstrado em alguns estudos (TEGOS et al.,
2008); (DECRAENE et al., 2008).
A TFD pode ser considerada uma excelente
alternativa, ou uma terapia coadjuvante, para
promover o controle da doença cárie. Desta
maneira, o objetivo do presente trabalho foi avaliar
a ação da TFD mediada por rosa bengala
associado ao Diodo Emissor de Luz (LED) sobre
culturas planctônicas de S. mutans.
Metodologia
Para o presente estudo foram utilizados 9
isolados da cavidade bucal de indivíduos
saudáveis e uma cepa padrão (ATCC 35688) de
S. mutans mantidas em nosso laboratório. O
projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo
Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos/ Universidade Estadual
Paulista (UNESP)
Foram preparadas suspensões padrão de cada
6
isolado contendo 10 células/mL, ajustadas em
espectrofotômetro (Micronal B582, São Paulo,

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Brasil) com comprimento de onda de 530 nm e
densidade ótica de 0,284. Para isto, os isolados
foram semeados em ágar Brain Heart Infusion
(BHI) (Difco, Detroit, USA) e incubados por 48
horas a 37 ºC em microaerofilia. Após o período
de incubação os microrganismos foram semeados
em caldo BHI (Difco, Detroit, USA) e incubados
por 18 horas a 37 ºC em microaerofilia. As
bactérias cultivadas foram então centrifugadas a
2000 rpm por 10 min e o sobrenadante
descartado. Este procedimento foi repetido e o
sedimento foi ressuspendido em 10 mL de solução
salina tampão fosfato (PBS, pH 7,4).
Usando a suspensão padrão, foram realizados
720 ensaios, 60 para cada cepa. Estes ensaios
foram divididos nas seguintes condições
experimentais (n= 10): a) sensibilização com rosa
bengala e irradiação com LED (F+L+); b) somente
sensibilizado com rosa bengala (F+L-); c) somente
irradiado com LED (F-L+); d) grupo controle, sem
utilização de LED e fotossensibilizador (F-L-)
O fotossensibilizador rosa bengala (Figura 1),
na concentração de 2 µM, foi usado para a
sensibilização dos isolados de S. mutans. A
solução do fotossensibilizador foi preparada por
dissolução do corante em solução de PBS e
esterilizada por filtração em membranas com
poros de diâmetro de 0,22 µm (São Paulo, Brasil).
Após a filtração, a solução de fotossensibilizador
foi mantida no escuro.
Figura 1- Estrutura do rosa bengala.
A fonte de luz usada foi o LED com
comprimento de onda de 440-460 nm (MMOptics,
São Carlos, Brasil), potência de 200 mW e área
2 -2
iluminada de 0,38 cm . Fluência de 95 J.cm
(Energia de 36 J e tempo de 180 s) e taxa de
-2
fluência de 526 mW.cm foi usada.
De acordo com as condições experimentais
descritas, 0,1 mL da supensão de S. mutans foi
adicionado em cada orifício de placas de
microtitulação de 96 poços de fundo plano,
esterilizadas e com tampa (Costar Corning, New
York, USA). Posteriormente, 0,1 mL do
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fotossensibilizador foi adicionado para os grupos
F+L+ e F+L- e 0,1 mL de solução PBS foi
adicionado para os grupos F-L+ e F-L-. As placas
foram agitadas por 5 min (tempo de pré-difusão)
por um agitador orbital (Solab, Piracicaba, Brazil).
Os poços contendo os grupos F+L+ e F-L+ foram
irradiados de acordo com o protocolo descrito.
A irradiação foi realizada em condições
assépticas, em câmara de fluxo laminar com a luz
apagada, onde foi utilizado um anteparo negro
fosco com orifício de diâmetro coincidente ao da
entrada do poço evitando-se assim o
espalhamento de luz.
Após a irradiação, de cada ensaio, foram
preparadas diluições seriadas e alíquotas de 0,1
mL de cada diluição foram semeadas em duplicata
em placas de ágar BHI e incubadas por 48 horas a
37 ºC em microaerofilia. Dado o período de
incubação, o número de Unidades Formadoras de
Colônias por mililitro (UFC/mL) foi determinado.
Os resultados foram transformados em
logaritimo (log10) e submetidos a análise de
Variância (ANOVA) e Teste de Tukey. O valor de p
≤ 0.05 foi considerado para indicar diferença
estatística significante.
Resultados
A Figura 2 revela os valores das médias e
desvios padrões em UFC/mL (log10) obtidas para
os grupos para todas as cepas testadas. Pode-se
observar que o grupo F+L+ foi efetivo na redução
dos microrganismos em relação aos demais (F+L-
e F-L+) que não apresentaram redução em
relação ao grupo controle (F-L-).
6
UFC/mL (Log10)
1
0
F-L- F-L+ F+L- F+L+
Grupos
Figura 2- Valores das médias e desvios padrões
em UFC/mL (log10) dos grupos para todas as
cepas de S. mutans estudadas.
Foi observada diferença estatística entre o
grupo TFD (F+L+) e os demais grupos,
demonstrando que o rosa bengala associado ao
LED apresentaram redução no número de
microrganismos (Tabela 1). Tanto o tratamento
2
 6
com somente corante ou irradiação não mutans na concentração de 10 células/ml. Paulino
apresentaram diferença estatística em relação ao et al. (2005a) avaliaram a toxicidade do corante
grupo controle (F-L-). rosa bengal nas concentrações de 0-10 µM em S.
3
mutans na densidade celular de 10 CFU/ml,
Tabela 1- Valores em logaritimo das UFC/mL para verificando que o rosa bengala não apresentou
todas as cepas estudadas. toxicidade nas concentrações abaixo de 5,0 µM.
Os mesmos autores em outro trabalho,
Cepas UFC/mL (log10) observaram que concentrações abaixo de 5,0 µM
F-L- F-L+ F+L- F+L+ do rosa bengal no escuro também não foram
A A A B tóxicas para fibroblastos (PAULINO et al., 2005b).
1 7,31 7,30 7,29 0,00
A A A B Em estudo sobre a segurança do uso tópico do
2 7,30 7,30 6,86 1,13
A A A B rosa bengala foi demonstrado que esse corante
3 7,16 7,15 7,00 1,00
A A A B
4 7,29 7,30 7,29 0,62 não apresentou capacidade de penetração além
A A A B
5 6,90 6,90 6,24 0,00 da epiderme. Assim, este estudo sugeriu o uso
A A A B tópico dermatológico do rosa bengal, uma vez que
6 7,22 7,24 7,27 0,40
A A A B o corante apresenta várias aplicações
7 7,31 7,28 7,15 0,00
A A A B diagnósticas, como o uso de solução de rosa
8 7,31 7,22 7,26 0,00
A A A B bengal para o diagnóstico de olho seco na
9 7,34 7,29 7,28 0,47
A A A B
ATCC 35688 7,04 6,95 7,00 0,00 concentração de 9,8 mM que é aproximadamente
A, B e C: representam diferença estatisticamente significante 5 000 vezes maior do que a concentração da
entre os grupos F-L-, F-L+, F+L- e F+L+. solução de rosa bengal usada no presente estudo
(WACHTER et al., 2003).
Em relação ao grupo controle (F-L-), foi Estudos mostraram que o uso isolado do LED
observada média de redução de UFC/mL de 6,86 apresenta pouca ou nenhuma atividade
log10 para o grupo TFD (F+L+) (Tabela 2). microbicida (ZANIN et al., 2005); (BEVILACQUA et
al., 2007); (GIUSTI et al., 2008). Esta fonte de luz
Tabela 2- Valores da redução em logaritimo do é utilizada para polimerização de resina, portanto
grupo F+L+ em relação ao grupo controle (F-L-). não é nociva para os tecidos bucais. Além disso,
em relação ao laser apresenta as seguintes
Cepas UFC/mL (log10) vantagens: constituem equipamentos menores e
Redução em log de F+L+ mais leves, apresentam baixo custo, possuem
1 7,31 maior flexibilidade no tempo de irradiação e
2 6,17 apresentam facilidade de operação (KONOPKA;
3 6,16 GOSLINSKI, 2007); (MEISEL; KOCHER, 2005).
4 6,67 O rosa bengal é um fotossensibilizador tipo II
5 6,90 que exibe fácil conversão fotocatalítica de oxigênio
6 6,82 triplete em oxigênio singleto. Esta espécie reativa
7 7,31 de oxigênio (ROS) pode danificar ácidos graxos
8 7,31 insaturados das membranas lipídicas passando
9 6,87 por reações de peroxidação, podem danificar
ATCC 35688 7,04 também enzimas por reações específicas com os
Média±DP 6,86±0,43 aminoácidos metionina, triptofano e tirosina e
DP: Desvio padrão. ácidos nucléicos por interação inicial com bases
guaninas (BANKS et al., 1985). Estes efeitos
Discussão resultam em morte da bactéria, pois enzimas
antioxidantes, como superóxido dismutase e
Os resultados obtidos demonstraram a eficácia catalase, protegem contra alguns radicais
antimicrobiana da TFD utilizando o corante rosa oxigenados, mas não contra oxigênio singleto
bengala para todos os microrganismos estudados. (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007).
O grupo tratado somente com o fotossensibilizador Demidova e Hamblin (2005) sugeriram que o
(F+L-) ou somente irradiado (F-L+) não corante rosa bengala se concentra no citoplasma
apresentaram redução de microrganismos. Estes da célula, isto foi demonstrado em células de
resultados estão de acordo com os princípios Staphylococcus aureus que foram inativadas por
básicos da TFD em que o uso isolado do corante TFD mediada por rosa bengala que apresentou-se
ou da fonte de luz não devem ter efeito ativada antes e após a lavagem das células.
antibacteriano (PLEATZER et al., 2008). A aplicação da Terapia Fotodinâmica
No presente trabalho foi utilizado o Antimicrobiana em células microbianas é
fotossensibilizador rosa bengala na concentração promissora, visto que é improvável o
de 2 µM para o tratamento de suspensões de S. desenvolvimento da resistência a esta terapia

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após múltiplos tratamentos devido a interação do
oxigênio singleto e os radicais livres com várias
estruturas celulares e diferentes vias metabólicas.
Além disso, a TFD é igualmente eficaz contra
bactérias resistentes e sensíveis aos antibióticos e
é não mutagênica (KONOPKA; GOSLINSKI,
2007); (MAISH, 2007).
As suspensões bacterianas tratadas com rosa
bengala e irradiadas por LED apresentaram média
de redução em log10 de 6,89 UFC/mL. Estudos
comprovam a atividade fotodinâmica deste corante
em células planctônicas de S. mutans com
redução de 3,00 log10 das células na concentração
de 0,5 µM do corante rosa bengala irradiado por
luz de fotopolimerizador (PAULINO et al., 2005a);
(PAULINO et al., 2005b).
O LED tem sido requerido para a TFD como
fonte alternativa aos lasers. Bevilacqua et al.
(2007) obtiveram eficácia de 7,91 log10 na redução
de culturas planctônicas de S. mutans irradiadas
pela luz LED com comprimento de onda de
640±20 nm na presença do fotossensibilizador
azul de toluidina.
A cavidade bucal constitui um sítio adequado
para a aplicação da TFD, pois é acessível a
iluminação (KONOPKA; GOSLINSKI, 2007). Em
adição, a TFD pode contribuir para a redução do
tempo de tratamento, redução da ocorrência de
efeitos colaterais frequentemente observados com
a administração sistêmica de antibióticos e menor
custo de tratamento (O´RIORDAN et al., 2005).
Conclusão
Os resultados demonstraram que a TFD
mediada por rosa bengala associada ao LED
apresentaram atividade antimicrobiana sobre
todas as cepas de S. mutans estudadas.
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