Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
BIOLOGI MOLEKULER I
ISOLASI DNA
Oleh:
Annisa Nurul Chaerani
411109059
1
ISOLASI DNA
B. Tujuan
C. Prinsip
Sentrifugasi
DNA diikatkan dalam suatu fasa yaitu silica, setelah itu dilakukan
pencucian dengan buffer kemudian di elusi (dilarutkan).
D. Dasar Teori
2
berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki
protein histon
DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu
DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel
berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang
paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut
beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.
3
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per
mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara
2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel
darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih
dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel
rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih
rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya
tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan
dalam prosedur isolasi DNA ini.
4
E. Alat dan Bahan
1. Spektrofotometer (Gene Quant)
2. Mikrosentrifuge
3. Mikrotube
4. Mikropipet
5. Binding buffer
Komposisi : Guanidin 6 molar
Urea 10 molar
Tris HCl 10 mmol
Tripton x 20%, pH 4,4
6. Proteinase K
7. Isopropanol
8. Inhibitor removal buffer
Komposisi : Guanidin HCl 5 molar
Tris HCl 20 mmol, pH 6,6
9. Wash buffer
Komposisi : NaCl 20 mmol
Tris HCl 20 molar, pH 7,5
10. Elution buffer
11. Sampel darah
5
F. Cara Kerja
1. Sampel dipipet sebanyak 200 µL dimasukkan ke dalam mikroube dan
ditambahkan 200 µL binding buffer untuk mengikat DNA.
2. Ditambahkan 40 µL protease K (pelisis sel), homogenkan dengan
mixer (mix max plus) selama 5 detik. kemudian diinkubasi pada suhu
70oC selama 10 menit.
3. Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotube yang mengandung silica.
4. Ditambahkan 100 µl isopropanol untuk melarutkan DNA, disentrifuge
8000 g selama 1 menit.
5. Ditambahkan 500 µL inhibitor removal buffer untuk menghilangkan
pengotor-pengotor, disentrifuge 13.000 rpm selama 10 detik.
6. Ditambahkan 500 µL wash buffer, disentrifuge 13.000 rpm selama 10
detik. Wash buffer dilakukan 2x untuk meyakinkan proses
pembersihan. Buang supernatan.
7. Ditambahkan 200 µl elution buffer, disentrifuge 8000 g selama 1
menit. Pada saat penambahan elution buffer harus dipanaskan terlebih
dahulu agar DNA lebih mudah larut. Setelah itu pindahkan isolat DNA
ke dalam tube yang baru.
8. Selanjutnya pengukuran konsentrasi dan kemurnian dengan
spektrofotometer atau disimpan pada suhu -4oC untuk penundaan
identifikasi, pada suhu -200C (3 bulan) dan pada suhu -80oC (untuk
penyimpanan lebih lama).
9. Untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian, DNA harus diencerkan
terlebih dahulu. Dengan pengeceran 1/10 menggunakan larutan DD
H2O (Double Destilat H2O/aquabidest).
6
10. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dengan
spektrofotometer:
a. Kuvet dibilas dengan aquadest.
b. Kemudian dibilas dengan DD H2O.
c. Kuvet diisi DD H2O diset sebagai blanko, pada kuvet terdapat
huruf Q, harus menghadap ke depan. Saat pengujian blanko
absorbance harus = 0, kemudian tekan set ref.
d. Masukkan isolat DNA yang telah diencerkan, tekan enter.
e. Serapan DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm.
7
G. Hasil Pengamatan
8
H. Pembahasan
I. Kesimpulan
9
DAFTAR PUSTAKA
http://id.wikipedia.org/wiki/isolasi_dna.html
http://www.chem-is-try.org/author/Sinly_Evan_Putra/
http://www.rbcbioscience.com/index.php
http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/2010/01/isolasi-dna.html
10
A B
C D
Keterangan:
11