UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

PROYECTO
DE
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

TEMA:

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS

SACHAROMYCCES CEREVISIAE TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A
ELEVADAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION DE
AGUARDIENTE

INTEGRANTES:

ALVEAR SANDRA

BASANTES FERNANDA

FIENCO ESTEFANÍA

GUEVARA DIANA

HERAS DIANA

ANTECEDENTES:
 1. TEMA: AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y CARACTERIZACION DE CEPAS
SACHAROMYCCES CEREVISIAE TERMOTOLERANTES Y RESISTENTES A
ELEVADAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL PARA LA PRODUCCION
DE AGUARDIENTE

2. OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GENERAL:

• Aislar, seleccionar y caracterizar cepas termotolerantes y resistentes

a altas concentraciones de alcohol de Saccharomyces cerevisiae para
el mejoramiento de la producción de aguardientes, teniendo como
materia prima melaza de caña de azúcar y residuos de la etapa de
fermentación de caña de azúcar.

2.2. OBEJTIVOS ESPECIFICOS:

• Obtener melaza de caña de azúcar mediante la preparación,

extracción del jugo, clarificación, evaporación, cristalización y
centrifugación

• Aislar las cepas de Saccharomyces cerevisiae fermentadoras y de

melaza de caña de azúcar en agar malta.

• Seleccionar las cepas de Saccharomyces cerevisiae termotolerantes y

resistentes a etanol del cultivo aislado de melaza de caña

• Obtener cultivos axénicos de Saccharomyces cerevisiae

• Caracterizar morfológicamente las cepas aisladas de Saccharomyces

cerevisiae

3. ANTECEDENTES

Para realizar el presente trabajo nos hemos basados en publicaciones

científicas y rendimientos actuales para tener una idea clara de los estudios
realizados y por ende poder mejorar la calidad del aguardiente.

Los fenómenos relacionados con la tolerancia térmica y la tolerancia a

etanol de los microorganismos han sido investigados exhaustivamente. La
temperatura optima de crecimiento especialmente de saccharomyces
cereviciae es de 30° a 35 °C, la temperatura afecta el crecimiento de
manera notable, principalmente porque los microorganismos de una especie
dada solo pueden crecer en un rango restringido de temperatura, según
estudios realizados se ha reportado que la tolerancia a el etanol y altas
temperaturas son interactivos, porque las concentraciones altas de alcohol
disminuyen la temperatura optima de crecimiento y el aumento de la
temperatura incrementa el efecto inhibitorio de etanol por lo tanto afecta
directamente al rendimiento.

Los efectos tóxicos de la temperatura y el etanol están relacionados con

alteraciones de la permeabilidad de las membranas celulares, la
desnaturalización de proteínas intracelulares, así como la inhibición del
transporte de nutrientes.
El mecanismo de respuesta celular al estrés por temperatura y por etanol
es esencialmente similar y consiste en cambios en la composición lipídica
de las membranas y en síntesis transitoria de proteínas. Entre las
estrategias para mejorar la tolerancia térmica se encuentran la selección de
cepas, adaptación de cepas mediante incubación a temperaturas
crecientes.

Las cepas nativas dan un rendimiento de 0.39 g de etanol por cada gramo
de azúcares a 35°C pero a 40°C (cepas termotolerantes) se obtiene0.41g de
etanol por cada gramo de azúcares, mejorando así su rendimiento y a la par
dando una disminución de tiempo de fermentación.

4. JUSTIFICACION

De acuerdo al reporte de consumo de bebidas alcoholicas Overview 2008,

elaborado por Ipsa Group, el 76% de los compradores prefieren consumir
agua ardiente sobre otro tipo de bebidas, Quito es la ciudad donde se
realiza el mayor número de adquisiciones de este producto, ya que el
estudio determina que el 56,9% de los capitalino consume este tipo de
bebidas frente al 43,1% de los guayaquileños.

En ecuador el uso de melaza como sustrato para la producción de

saccharomyces cerevisiae es utilizado para la obtención de aguardiente,
existe alrededor de 78 000 hectáreas cultivadas de caña destinadas a la
producción de azúcar. Unas 30 000 hectáreas de caña de azúcar están
destinadas a la producción de aguardiente y otros productos artesanales.

El rendimiento de una fermentación con la utilización de las cepas nativas

de saccharomyces cerevisiae se puede ver incrementado con la utilización
de cepas termotolerantes, ya que se logra producir mayor cantidad de
etanol con menor consumo de azucares, se economisa la materia prima por
lo tanto disminuyen costos de producción que generaran un incremento de
ingresos de una fabrica productora de agua ardiente.

Tomando en cuenta los datos citados anteriormente, se puede establecer

que la elaboración de aguardiente como bebida alcoholica es rentable en
nuestro país y aunque no se pretende competir con las grandes fábricas
productoras, se sugiere la optimización del proceso, con la utilización de
cepas termotolerantes que aumenta la resistencia al etanol, disminuyen el
tiempo de fermentación, y aumenta la producción.

5. MARCO TEORICO:

5.1 CAÑA DE AZÚCAR

La caña de azúcar es una gramínea tropical, en cuyo tallo se forma y

acumula un jugo rico en sacarosa, compuesto que al ser extraído y
cristalizado forma el azúcar.

5.2 MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

Las melazas, mieles finales o melazas “blackstrap”, suelen ser definidas, por
muchos autores como los residuos de la cristalización final del azúcar, de los
cuales no se puede obtener más azúcar por los medios físicos.
La melaza es una mezcla compleja que contiene sacarosa, azúcar invertido,
sales y otros compuestos solubles en álcali que normalmente están
presentes en el jugo de la caña localizado, así como los formados durante el
proceso de manufactura del azúcar. Además de la sacarosa, glucosa,
fructosa y rafinosa los cuales son fermentables, las melazas también
contienen sustancias reductoras no fermentables.
Estos compuestos no fermentables reductores del cobre, con principalmente
caramelos libres de nitrógeno producidos por el calentamiento requerido por
el proceso y las melaniodinas que si contienen nitrógeno derivadas a partir
de productos de condensación de azúcar y aminocompuestos.

5.2.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA (%) DE LA MELAZA DE LA

CAÑA DE AZÚCAR

COMPONENTES CONSTITUYENTES CONTENIDO (p/p)

Materia seca 78%
Proteínas 3%
sacarosa 60-63%
COMPONENTES Azúcares reductores 3-5%
MAYORES Sustancias disueltas 4-8%
(azúcares diferentes)
Agua 16%
grasas 0.40%
Cenizas 9%
Calcio 0.74%
CONTENIDO DE magnesio 0.35%
MINERALES fósforo 0.08%
potasio 3.67%
SALES Orgánicas 3.0-3.4%
inorgánicas 1.5-4.5%
Ácidos orgánicos 1-3%
COMPONENTES Aminoácidos 1.5-5.5%
MENORES Almidones 0.001-0.050%

Las melazas se obtienen como un subproducto final en la elaboración de la

caña de azúcar.

5.3 MICROORGANISMOS DE LA MELAZA

Mediante ensayos adecuados con soluciones diluidas de malazas, se ha

demostrado que estas, a pesar de su bajo contenido de fósforo, constituyen
un buen medio de cultivo para muchos microorganismos, tales como
levaduras hongos y bacterias.

Se considera importante la presencia de microorganismos mesófilos

termófilos dentro de la melaza. Los organismos mesófilos se desarrollan
bien durante la dilución de las melazas.
 5.3.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Es la especie de levaduras utilizada por excelencia para la obtención de

etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fácil
manipulación y recuperación, no es exigente en cuanto a su cultivo, no
presenta alto costo, tolera altas concentraciones de etanol, en la
fermentación produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante,
capaz de utilizar altas concentraciones de azucares.

Las levaduras, son organismos eucarióticos unicelulares, por lo tanto sus

estructuras se encuentran formadas por pared celular, núcleo diferenciado y
organelos con ribosomas y mitocondrias.

Saccharomyces Cerevisiae es una levadura cuya colonia es de color crema o

blanco, apariencia húmeda y brillante, de bordes irregulares.

La temperatura óptima de crecimiento es de 25 a 300C. Puede producir

ascosporas cuando hay requerimientos nutricionales adecuados

6. MARCO METODOLOGICO:

6.1 PROCESO DE OBTENCIÓN DE MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR

CAÑA DE AZÚCAR Almacenamiento Extracción del jugo

Extracción del azúcar Bagazo

Combustible de
Clarificación
Caldera

Residuo de espuma ,
Jugo Clarificado
barro y desperdicios

Cristalización

Producción de templa o
“mazacote”

Centrifugación

Azúcar MELAZA
 6.2 AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DE CEPAS DE
SACCHAROMYCES CEREVISIAE

6.2.1 AISLAMIENTO

FASE DE ENRIQUECIMIENTO

1. Inocular alícuotas de 1 ml de crema de levadura en un erlenmeyer de

150 ml contenidas en 50 ml de caldo de mata reforzado

2. Incubar a 45°C con agitación (120rpm) durante 15 a 20 horas hasta

que la turbidez indique evidencia de crecimiento celular

3. Tomar muestras de los matraces con resultados de crecimiento

positivo y realizar diluciones seriadas hasta 10-5 con suero fisiológico
(9 g/L de NaCl)

6.2.2 FASE DE SELECCION

1. A partir de los cultivos diluidos efectuar siembras por estriado sobre

agar malta.

2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas

6.2.3 FASE DE PURIFICACIÓN

1. Realizar una resiembra por estriado en agar malta enriquecido con

ampicilina (300mg/L) para inhibir la flora competitiva que aun puede
persistir.

2. Incubar las cajas a 35°C por 48 horas.

6.2.4 FASE DE CONSERVACIÓN

1. Del cultivo puro obtenido en la fase anterior seleccionar las mejores

colonias y aplicar el método de perlas para conservación

2. Colocar en los crioviales de 10 a 20 perlas las cuales serán

conservadas.

3. La temperatura adecuada para la conservación de la cepa es de 4°C

DIAGRAMA DE FLUJO DEL AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y

PRESERVACIÓN DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Figura N°1
 Crema de levaduras
residual

Incubación en caldo
malta reforzado a 45°C
de 15 a 20 horas

Crecimie NO
SI
nto

Diluciones

Siembra en
placa

Incubación a 35°C
por 48 horas

Colonias
aisladas

Colonias aisladas

Resiembra en
placas

Incubación a 35°C
por 48 horas

Cultivo puro

Método de perlas

Selección de perlas y
colocación en
crioviales

Crioconservación a
4°C (T sugerida)

7. HIPOTESIS NULA
Las cepas de saccharomyces cerevisiae aisladas e identificadas no son
tolerantes a estrés de la producción (T=40°C, altas concentraciones de
etanol)

7.1 HIPOTESIS ALTERNATIVA

Las cepas de saccharomyces cerevisiae aisladas e identificadas son

tolerantes a estrés de la producción (T=40°C, altas concentraciones de
etanol)

8. FACTIBILIDAD

Cantid
Cantidad de ad
Precio
Medios y Referencia Ncesa
Reactivos ria
Cantidad a
mL g mL 500g
utilizar
Agar 3
983 450 62 0.70
Maltosa 8
Caldo 3
1000 50 47 0.27
Maltosa 7
Suero 1000 9 50 12 0.06
Fisiológico
MATERIA CANT UNITARI TOTAL
L O
Tubos 5 5 0.10 0.50
Cajas 15 15 0.15 2.25
Crioviales 5 5 1.50 7.50
Pipetas LABORATORI
O
Biorreactor
TOTAL 11.28