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Bioquimica de Lehninger En Español

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libro de bioquimica en español a nivel universitario
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IDAV~I'.:! -I,.

N:- SOIN MIICHAEIL M~ C10X

INTRODUCCION

LA LOGICA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIVOS

INTRODUCCI6N

La logica molecular

de los organismos vivos

Los seres vivos estan integrados por moleculas inanimadas. Cuando se examinan individualmente, estas moleculas aisladas se ajustan a todas las leyes fisicas y quimicas que rigen el comportamiento de la materia inerte. Sin embargo, los orqanismos vivos poseen, ademas, unos atributos extraordinarios que no exhiben cumulos de materia inanimada. Si examinamos algunas de estas propiedades especiales, podremos acercarnos al estudio de la bioquimica con una mejor comprensi6n de los problemas fundamentales que trata de explicar.

Caracteristicas que identifican a la materia viva

El atributo mas sobresaliente de los seres vivos es, quiza, su complejidad y su alto grado de organizaci6n. Poseen estructuras internas intrincadas que contienen muchas c1ases de moleculas complejas. Se presentan, ademas, en una variedad asombrosa de especies diferentes. Por contraste, la materia inanimada de su entorno, representada por el suelo, el agua y las rocas, esta constituida habitualmente por mezc1as fortuitas de compuestos quimicos sencillos, de organizaci6n estructural mas bien escasa.

En segundo lugar, cada una de las tres partes componentes de la materia viva cum ple un prop6sito 0 funci6n especificos. Ello es cierto no solamente en 10 referente a estructuras visibles como alas, ojos, flores u hojas, sino tam bien a estructuras intracelulares tales como el nucleo y la membrana. Ademas los compuestos quimicos individuales de la celula, tales como los lipidos, las proteinas y los acidos nucleicos, poseen tambien funciones especlficas.

En los organismos vivos es completamente Ieqitimo prequntarse cual es la funci6n de una molecule determinada. En cambio, carece de sentido plantear dicha pregunta con relacion a la materia inerte.

En tercer luqar, los organismos vivos presentan la capacidad de extraer y transformar la energia de su entorno a partir de materias primas sencillas, y de emplearla para edificar y mantener sus propias e intrincadas estructuras. Pueden realizar, ademas, otras formas de trabajo util, como, por ejemplo, el esfuerzo mecanico de la locomoci6n. La materia inanimada no posee esta capacidad de emplear la energia externa para

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INTRODUCCI6N LA LOGICA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIWS

mantener su propia orqanizacion estructura!' De hecho, habitualmente se degrada a un estado mas des orden ado cuando absorbe energia externa, ya sea en forma de calor 0 de luz.

Pero el atributo mas extraordinario de los organismos viVos consiste en su capacidad de produdr una replica exacta de si mismos, propiedad que puede considerarse la verdadera quintaesencia de la vida. El con junto de la materia inanimada que nos es familiar no muestra la capacidad de reproducirse de «generacion» en «generadon» en form as identicas en masa, forma y estructura interna.

Bioquimica del est ado vital

Podemos preguntarnos ahora: si los organismos vivos est an compuestos por molecules intrinsecamente inanimadas, icomo es que la materia viva se diferencia de modo tan radical de la inerte, que tarnbien esta constituida por la misma clase de moleculas inanimadas? iPor que los organism os vivos son algo mas que la sum a de sus partes inanimadas? Los Hlosofos medievales habrian contestado que los organismos vivos estan dotados de una fuerza vital misteriosa y divina. Pero esta doctrina, que recibe el nombre de «vitalismo», es una supersticion y ha sido descartada por la ciencia moderna. La meta basica actual de la bioquimica es determinar de que modo el conjunto de moleculas inanimadas que constituyen los orqanismos vivos se influyen mutuamente para constituir, mantener y perpetuar el estado de vida.

La bioquimica es una ciencia muy joven. Hasta hace unas pocas decadas solamente un reducido numero de universidades la reconocian como una ciencia por su propio derecho. En la genealogia de la bioquimica actual existen dos lineas matrices. Una de ellas procede de la medicina y de la Iisiologia, como subproducto de las primeras investigaciones acerca de la composicion quimica de la sangre, la orina y los tejidos, y sus variaciones con los estados de salud y de enfermedad. La otra linea deriva de la quimica orqanica, desde los estudios iniciales acerca de la estructura de los compuestos orqanicos que existen en la naturaleza. Durante mucho tiernpo, la bioquimica fue considerada simplemente como una rama de la fisiologia 0 de la quimica. Realmente no surge como ciencia adulta por derecho propio con poderosos rnetodos experimentales y vision de prediccion de los Ienomenos bioloqicos hasta el ultimo cuarto de siglo. Son dos los hechos principales que 10 han ocasionado. Uno de ellos es el reconocimiento de los sistemas multienzirnaticos como unidades cataliticas en las rutas metabolicas principales, y el desarrollo de una hipotesis unitaria para la transferencia de energia en las celulas vivas. El otro, que ha ejercido una profunda y muy penetrante influencia, fue el reconocimiento de que la herencia. uno de los aspectos mas fundamentales de la biologia, descansa sobre una base molecular raciona!. En la actualidad, la bioquimica esta realizando interesantes pruebas en cierto numero de areas fundamentales de la biologia -la diferenciacion de las celulas y de los organismos, el origen de la vida y la evolucion, el comportamiento y la memoria y las enfermedades humanaspruebas que han demostrado que estos problemas basicos pueden ser abordados con provecho mediante los metodos bioquimicos.

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lntroduccion La loqic« molecular de los organismos vivos

Realmente, el exito de la bioquimica en la explicacion de muchos Ienomenos celulares ha sido tan grande. que muchos cientlficos han lIegado a la conclusion de que la biologia es quimica. Algunos bioloqos no com parten este punto de vista; mantienen que la esencia de los organismos vivos complejos no puede reducirse, ni ahora ni nunca, al nivel de moleculas y de interacciones moleculares. Pero este es un punto de vista minoritario. En la actualidad es quizas mas loqico admitir, como Iilosofta de trabajo, que todos los Ienomenos bioloqicos descansan, en ultimo terrnino, sobre una base molecular y abandonar este punto de vista solamente cuando no se muestre uti! para plantear experimentos criticos 0 para explicar los datos experimentales. Esto no quiere decir que la biologia sea simplemente otro campo de la quimica, comparable a la quimica orqanica, la qui mica fisica 0 la qui mica inorqanica. Si la biologia es qui mica. es una especie de superquimica que comprende, pero al mismo tiernpo trasciende, los campos tradicionales de la qui mica. Y ello se debe a que las moleculas que inteqran los organismos vivos no solamente se rigen por todos los principios Iisicos y quimicos que gobiernan el comportamiento de todas las moleculas, sino que. ademas, ejercen acciones mutuas de acuerdo con otro con junto de principios a los cuales nos referiremos de modo colectivo como la loqice molecular de la vida. Estos principios no incluyen necesariamente ninguna ley 0 fuerza fisica nueva 0 todavia por descubrir. Deben considerarse mas bien un con junto unico de «reg las fundamentales» que gobiernan la naturaleza, la funcion y las interacciones de los tipos especificos de moleculas presentes en los organismos vivos. y les dotan de la capacidad de organizarse y replicarse por si mismos. No se han identificado todavia todos los principios que comprende la lcqica molecular de la vida. y algunos de ell os solo se perciben debilmente. En realidad, resulta quiza mas apropiado hablar de estos principios como axiomas. puesto que varios de ellos son intuitivos y aun no comprobables.

Veamos ahora si podemos identificar alguno de los axiomas import antes de la loqica molecular de la vida. Comenzaremos con una breve vision de la estructura y Iuncion de las moleculas halladas en la materia viva. a las que denominaremos biomolecules.

Biomoleculas

La composicion quimica de los seres vivos es, cualitativamenteo muy diferente de la del entorno Iisico en que viven. La mayor parte de los componentes quimicos de los organismos son compuestos orqanicos de carbono en los que el elemento se halla relativamente reducido 0 hidroqenado.. Muchas biomoleculas orqanicas conti en en tambien nitroqeno. Por el contrario, los elementos nitroqeno y carbono no son abundantes en la materia inerte y se encuentran en la atmosfera y en la corteza terrestre en formas inorqanicas sencillas, tales como dioxide de carbono, nitrogeno molecular. carbonatos y nitratos.

Los compuestos orqanicos presentes en la materia viva muestran enorme variedad, y la mayor parte de ellos son extraordinariamente complejos. Aun las mas sencillas de las celulas, las bacterias, contienen gran numero de distintas mo-

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INTRODUCCION LA LOGICA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIVOS

leculas orqanicas. Se calcula que la bacteria Escherichia coli contiene alrededor de 5000 compuestos orqanicos diferentes, entre ellos unas 3000 clases diferentes de proteinas y 1000 tipos distintos de acidos nucleicos. Ademas, la mayor parte de la materia orqanica en las celulas vivas esta constituida por macromolecules, de pesos moleculares muy grandes. que incluyen no sola mente a las proteinas y a los acidos nucleicos sino tambien a sustancias po lim eras tales como el almidon y la celulosa.

Si consideramos ahora organismos mayores y mas complejos, como son los ani males y las plantas superiores, hallarem os que tambien conti en en proteinas y acidos nucleicos, en mayor variedad. En el organismo humane, por ejemplo, puede haber hasta 100 000 clases de proteinas diferentes. en compa~ racion con las 3000 distintas de E. coli. Aunque algunas de las proteinas de las celulas de E. coli actuan de modo muy semejante al que 10 hacen determinadas proteinas de las celulas humanas, ninguna de las moleculas proteicas de E. coli es identica a cualquiera de las proteinas encontradas en el hombre. De hecho, cada especie de organismo posee su propio conjunto de moleculas proteicas y de acidos nucleicos quimicamente diferentes. Puesto que es probable que existan alrededor de 1.5 millones de especies de organismos vivientes, puede calcularse que el con junto de las especies vivientes debe de contener entre 1010 y 1012 tipos distintos de moleculas proteicas y unas 1010 clases diferentes de acidos nucleicos. Si comparamos estas cifras con la totalidad de compuestos orqanicos cuya estructura sea conocida por los quimicos orqanicos actuales. y que alcanza solamente un millen, 0 106• aparece claro que nada mas conocemos la estructura precis a de una Iraccion trivial mente pequefia del conjunto total de moleculas orqanicas que se cree existen en la materia viva. Por to do ello, pareceria una empresa sin esperanza que los bioquimicos intentaran aislar, identificar y sintetizar todas las diferentes moleculas orqanicas presentes en la materia viva.

Constituye una paradoja, sin embargo. que la inmensa diversidad de moleculas orqanicas de los organismos vivos SCI pueda reducir, en ultimo termino, a una casi absurda simplicidad. Sabemos ahora que las macromoleculas de la celula se hallan formadas por much as moleculas sencillas, pequefias unidades estructurales que se hallan ligadas constituyendo largas cadenas. EI almidon y la celulosa estan constituidos por hebras muy largas de moleculas de glucosa unidas covalentemente. Los diferentes tipos de proteinas estan formados por largas cadenas de aminoacidos, pequefios compuestos orqanicos de estructura conocida, unidos covalentemente. En las proteinas solo se encuentran 20 tipos de aminoacidos diferentes, pero estan ordenados en muchas secuencias distintas, de modo que forman numerosos tipos de proteinas. Asi, las 3000 proteinas 0 mas que existen en la celula de E. coli estan integradas tan solo por 20 pequefias moleculas diferentes, Analoqamente, los 1000 0 mas acidos nucleicos de la celula de E. coli, de los que existen dos clases, acido desoxirribonucleico (D N A) y acido ribonucleico (RNA). estan constituidos a partir de un total de ocho sillares diferentes, los nucleotidos, cuatro de los cuales son los constituyentes del DNA y los restantes del RNA. Ademas, los 20 aminoacidos distintos, constituyentes de las proteinas, y los ocho nucleotidos dife-

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Introducci6n La l6gica molecular de los organismos vivos

rentes que integran los acidos nuc1eicos son identicos en todas las especies vivientes. Aunque en la actualidad solamente poseemos un conocimiento precise de la estructura covalente de unas 100 proteinas, las tecnicas de la quimica de las proteinas se han desarrollado 10 suficientemente bien para que. por 10 menos en principio, se halle dentro de las posibilidades de la bioquimica ac1arar la estructura de cualquier proteina de todo tipo de organismo.

El reducido numero de moleculas sencillas, sillares estructurales con que estan construidas todas las macromoleculas, poseen otra sorprendente caracteristica: cada una de elIas desempeiia mas de una Funcion en las celulas vivientes, y algunas son tan extremadamente versatiles que realizan buen numero de funciones. Los aminoacidos no solo actuan como sillares de construccion de las moleculas proteicas, sino tarnbien como precursores de las hormonas, los alcaloides, las porfirinas, los pigmentos y otras much as biomoleculas. Diverscs mononucleotidos no solo constituyen las unidades Iundamentales de los acidos nucleicos, sino que actuan tambien como coenzimas y moleculas transportadoras de energia. Por to do ello, parece probable que las biomoleculas fundamentales de las estructuras complejas fuesen seleccionadas en e1 curso de la evolucion bioloqica, precisamente por su capacidad de desempeiiar diversas funciones. Por 10 que sabemos hasta ahora, los organismos vivos no contienen normalmente compuestos sin una fun cion definida, aunque exist en algunas biomoleculas las funciones de las cuales aun no se comprenden.

Ahora se pueden deducir algunos de los axiomas de la logica molecular de la vida. Ya que los millares de macromoleculas presentes en las celulas estan construidas con solo unas pocas moleculas sencillas, que son los sillares de su estructura, puede formularse el primer axioma: En la orqenizaci6n molecular de la celule existe una simplicided [undemental. Puesto que estas biomoleculas sencillas son identicas en todas las especies conocidas, podemos deducir que todos 100s organismos vivos proceden de un antepasado comiin, Debido a que cada organismo posee su propio con junto distintivo de acidos nuc1eicos y de proteinas surge otro axioma: La identided de cada una de las especies de organismos este preservada pO'r su posesion de un conjunto distintivo de ecidos nucleicos y de proteines. En la versatilidad funcional de esas biomoleculas basicas podemos percibir, ademas, la existencie de un principia fundamental de economic molecular. Quiza las celulas vivas solo contienen las moleculas mas sencillas posibles en el minimo numero de tipos diferentes, nada mas las indispensables para dotarlas del atributo de la vida y de la identidad de especie en las condiciones ambientales en que viven.

Transformaciones enerqeticas en las celulas vivas

La complejidad molecular y la ordenacion estructural de los organismos vivos. en contraposicion al azar que reina en la materia inerte, tienen unas implicaciones profundas para el cientifico Fisico. La segunda ley de la termodinamica, rama de la fisica que trata de la energia y sus trans formaciones, establece que los procesos fisicos y quimicos tienden a aumentar e1 desorden, 0 e1 caos, en el mundo; es decir, su entropia.

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INTRODUCCION LA LOGlCA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIVOS

l,Por que, entonces, los organismos vivos pueden crear y mantener su complicada ordenacion en un entorno que esta relativamente desordenado, y que 10 esta cada vez mas con e1 transcurso del tiempo?

Los organismos vivos no constituyen excepciones de las leyes de la terrnodinamica. A su elevado grado de ordenacion molecular debe contribuirse de alguna manera, puesto que no puede surgir del desorden espontanearnente. La primera ley de la termodinamica establece que la energia no puede crearse ni destruirse. Por tanto, los organismos vivos no pueden consumir 0 crear energia; solamente pueden transformar una forrna de energia en otra. De su entorno absorb en una forma de energia que les es util en las condiciones especiales de temperatura y presion en que viven, y entonces devuelven al ambiente una cantidad equivalente de energia, en alguna otra forma menos utilizable. La forma util de energia que las celulas toman se denomina energia libre, y puede definirse simplemente como el tipo de energia capaz de realizar trabajo a temperatura y presion constantes. El tipo de energia menos util que las celulas devuelven a su entorno consiste en calor y otras formas que rapidamente se distribuyen al azar en el entorno, de modo que aumenta su des orden 0 entropia. Podemos establecer ahora un axioma ext rem ada mente importante en la Ioqica molecular de la vida: los organismos vivos cteen y mentienen su ordenecicn esenciel a expensas de su entorno, el que transforman heciendolo cada oez mas desordenedo y ca6tico.

El entorno de los organismos vivos resulta para ellos absolutamente esencial, no solo como Fuente de energia libre sino tambien de materias primas. Utilizando ellenguaje termodinamico, los organismos vivos son sistemas abiertos porque intercambian materia y energia con su entorno y, al hacerlo, 10 transforman. La caracteristica de los sistemas abiertos es que no se hallan en equilibrio con su entorno. Aunque puede pa~ recer que los organismos vivos se hallan en equilibrio, ya que no cambian visiblemente al observarlos durante un periodo dado de tiernpo, 10 cierto es que se hallan en 10 que se denomina estado estecionerio, condicion que cum pIe un sistema abierto cuando la velocidad de transferencia de materia y de energia desde el entorno al sistema se halla compensada exactamente por la velocidad de transferencia de materia y energia hacia el exterior del sistema. Constituye, por tanto, una parte de la loqica molecular de la vida que la celule es un sistema abierto que no este en equilibria, es una maquina de extraer energia libre del medio, en el cual origina un aumento de entropia. Ademas, y este es otro reflejo del principio de maxima econcrnia, las celules vioes son muy eficaces en le. manipulaci6n de la enerqie y de la materia. La eficacia con que convierten la energia absorbida en trabajo efectuado es muy superior a la de las maquinas construidas por el hombre.

La maquinaria de transforrnacion de energia de las ce1ul~s vivas esta construida por entero con moleculas orqanicas relativamente fragiles e inestables, inca paces de resistir temperaturas elevadas, corrientes electricas intensas 0 concentraciones ext rem as de acidos 0 de bases. La celula viva es, por tanto, esencialmente isoterrnica: en un instante determinado todas sus partes tienen practicarnente la misma temperatura. Ademas, no existen diferencias importantes de presion de una

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lnitoduccion La l6gica molecular de los organismos vivos

parte a otra de la celula. Por estas razones las celulas son incapaces de utilizar el calor como Iuente de enerqia, ya que aquel s610 puede transformarse en trabajo a presion constante si se transfiere desde una zona de temperatura superior a otra de menor temperartura. Las celulas no se parecen, por tanto, a las maquinas termicas 0 electricas, que son los tipos de maquinaria con que estamos mas familiarizados. Por el contrario, y esto constituye otro axioma importante de la loqica molecular de la vida, La celule viva es una mequina quimica isotetmice. La energia que las celulas absorben de su entorno se recupera en forma de energia quimica, la cual se transforma despues para realizar el trabajo quimico implicito en la biosintesis de los componentes celulares, e1 trabajo osmotico necesario para el transporte de los materiales al interior de la celula, 0 e1 trabajo mecanico de la contraccion 0 la locomocion: todas estas trans formaciones suceden, esencialmente, a ternperatura constante.

Entre las maquinas construidas por e1 hombre existen muy pocas que sean cap aces de utilizar la energia qui mica para realizar trabajo a temperatura constante. En la actualidad, la ingenieria tecnoloqica atin tiene que producir una rna quina utilizable que pueda convertir isoterrnicamente la energia quimica en mecanica, tipo de conversion que, por otra parte, nos es familiar a todos en la contraccion muscular.

Reacciones quimicas en las celulas vivas

Las celulas pueden actuar como maquinas quirmcas porque poseen etuimas. catalizadores cap aces de aumentar mucho la velocidad de reacciones quimicas especificas. Los enzimas son moleculas proteicas muy especializadas, elaboradas por las celulas a partir de aminoacidos sencillos. Cada enzima solamente puede catalizar un tipo especifico de reaccion quimica, Se conocen en la actualidad casi 2000 enzimas diferentes. Los enzimas superan notablemente a los catalizadores confeccionados por el hombre en su especificidad reactiva, su eficacia catalitica y su capacidad de actuacion en condiciones suaves de temperatura y de concentracion de iones hidroqeno. En unos sequndos pueden catalizar secuencias de reacciones muy complejas, las cuales requeririan dias, semanas 0 meses de trabajo en el laboratorio quimico.

Existe, sin embargo, una propiedad especialmente notable de las reacciones quimicas en las celulas vivas, que en ultimo termino es la que hace posible y eficaz su actuacion como maquinas terrnicas: las reacciones catalizadas enzimaticamente tienen lugar con un rendimiento del 100 %, y no hay subproductos. En cambio. las reacciones de la quimica orqanica realizadas en el laboratorio mediante catalizadores pro~ ducidos por el hombre van, casi siernpre, acompafiadas por la Iormacion de uno 0 mas subproductos; por ello los rendimientos suelen ser inferiores al 100 %, y es precisa una puriIicacion intensiva del producto en cada etapa. Debido a que los enzimas pueden acelerar una sola transformacion de una molecula determinada, sin inducir ninguna otra de sus posibles reacciones, los organismos vivos pueden llevar a cabo, de modo simultaneo, much as reacciones individuales diferentes sin perderse en un mar de subproductos inutiles. Este elevado grado de especificidad de los enzimas es consecuencia del

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INTRODUCCION LA LOGICA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIVOS

funcionamiento de otro axioma fundamental de la 16gica molecular de la vida, a saber: La especificidad de las interscciones moleculeres en las celules es el resultado de la complementaridad estructurel de las celules interectioes. Las moleculas enzirnaticas se combinan con sus sustratos durante el cielo catalitico, de tal modo que el centro activo de la molecula del enzima se adaptara al substrato con una complementaridad casi perfecta, como la de una Have y su cerradura. Veremos que sobre el principio de complementaridad estructural descansa la especificidad de muchos de los diferentes tip os de interacciones moleculares en las celulas.

Los centenares de reacciones quimicas, catalizadas enzimaticamente, que tienen lugar en la celula no se realizan de modo independiente unas de otras, sino que, por el contrario, estan relacionadas entre si y constituyen muchas secuencias diferentes de reacciones consecutivas que poseen intermediarios cornunes, de modo que el producto de la prim era reacci6n se convierte en el sustrato 0 reactante de la segunda, y asi sucesivamente. Tales secuencias, que pueden poseer de 2 a 20 6 mas etapas de reaccion, se hallan ligadas a su vez forman do reticulos de esquemas convergentes 0 divergentes. Esta ordenaci6n determina diversas consecuencias bioloqicas importan .. tes. Una de ellas consiste en que tales sistemas de reacciones consecutivas determinan que las reacciones quimicas se canalicen por rutas especificas. La otra es que las reacciones secuenciales hacen posible la transferencia de energia quimica. La transferencia de enerqia entre dos reacciones en condiciones de presion y temperatura constantes no puede tener lugar, a menos que ambas reacciones posean un intermediario com un, Si dos reacciones independientes, tales como

A-->B

C-->D

se producen en un mismo recipiente a presion y temperatura constantes, cada una transcurrira con identica disminucion de enerqia libre, independientemente de la presencia de la otra. Por el contrario, en dos reacciones consecutivas tales como

A-->B

B-->C

cierta cantidad de energia quirmca de A puede transferirse hasta C a traves del intermediario comun B.

Las celulas vivas pueden dividirse en dos grandes elases sequn el tipo de energia que obtienen de su entorno. Las celulas fotosinteticas utili zan la luz solar como principal fuente de energia: la energia radiante es absorbida por el pigmento clorofila y transformada en energia quimica. Las ceIulas hete~ rotroficas aprovechan la energia de moleculas orqanicas muy reducidas, ricas en enerqia, como la glucosa y que obtienen de su entorno. La mayor parte de las celulas del reino animal son heterotroficas: en elIas la glucosa es oxidada a anhidrido carbonico y agua, proceso en que se conserva algo de la energia libre de la molecula de qlucosa, la cual se emplea pesteriormente para realizar diversos tipos de trabajo celular.

Aunque ambas elases de organismos vivientes obtienen energia de su entorno en formas distintas, las dos la recuperan

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Introducci6n La loqice molecular de los organismos vivos

y la utilizan ampliamente en forma del compuesto llama do trifosfato de adenosine, (A TP). Este actua como el transportador de energia quimica mas importante en las celulas de todas las especies vivientes. A medida que el ATP transfiere su energia a otras moleculas, pierde su grupo fosfato terminal y se transforma en difos/ato de edenosine, (ADP). que es la forma descargada 0 pobre de energia. es decir, la contrapartida del ATP. Por su parte. el ADP puede, a su vez, aceptar energia qui mica y recuperar un grupo fosfato para transfermarse de nuevo en A TP. ya sea a expensas de la energia solar (en las celulas fotosinteticas ) 0 de energia quimica (en las celulas heterotr6ficas). El A TP actua como un intermediario com un 0 nexo de uni6n entre dos grandes redes de reacciones catalizadas enzirnaticamente en la celula. Una de dichas redes conserva la energia quimica obtenida del entorno al producir la fosforilaci6n del ADP pobre en energia y transformarIo en A TP de elevado contenido enerqetico. La otra red utiliza la energia del A TP para realizar la biosintesis de componentes celulares a partir de precursores sencillos, con la degradaci6n simultanea del ATP. que se transforma en ADP. Podemos establecer ahora otro axioma en la 16gica molecular de las celulas: Las secuencias consecutivamente ligadas de las reacciones catalizadas enzimeticemente proporcionen los medios para transferir la energia quimica desde los procesos que la liberen, hasta los que la requieien.

Autorrequlacion de las reacciones celulares

Del hecho de que todas las reacciones quimicas de la celula se hallan catalizadas por enzimas y conectadas por intermediarios comunes se deduce otro resultado importante. Una celula bacteriana sencilla, tal como la de E. coli, sintetiza simultaneamente sus miles de componentes moleculares complejos a partir de solo tres precursores sencillos: glucosa. amoniaco y agua. Esta celula emplea una clase de 16gica quimica que trasciende los conocimientos actuales de la quimica sintetica en el laboratorio. Si un quimico se enfrentase con el problema de sintetizar dos productos, tales como un aminoacido y un lipido, no sofiaria nunca en sintetizarIos a partir de unos mismos precursores, simultaneamente y en un mismo recipiente de reacci6n. Iniciaria cada una de las sintesis partiendo de precursores diferentes y utilizaria distintas secuencias reaccionales. Llevaria a cabo ambas sintesis por separado, en recipientes distintos. y. probablemente, en momentos diferentes. Pero en las celulas vivas la sintesis de centenares 0 milia res de moleculas muy distintas se realiza de modo simultaneo, literalmente en un mismo recipiente, y partiendo de unos pocos precursores comunes. La conexi6n de reacciones catalizadas por enzimas, en secuencias de reacciones consecutivas, hace posible canalizar ordenadamente los millares de reacciones quimicas que se suceden en las celulas, de modo que todas las biomoleculas especificas necesarias para la estructura y Iuncion celulares se produzcan en cantidades y velocidades adecuadas.

Una celula bacteriana sintetiza simultaneamente 3000 0 mas clases de moleculas proteicas en relaciones molares especificas entre si. Cada una de estas moleculas contiene un minimo de 100 unidades de aminoacidos por cadena; la mayoria contie-

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INTRODUCCION LA LOGICA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIVOS

nen muchas mas. Y, sin embargo, a 37°C la celula bacteriana solo necesita unos pocos segundos para completar la sintesis de cualquier molecula proteica sencilla. En cambio, la sintesis de una proteina por el hombre en el laboratorio, hecho que solo se ha conseguido por vez prirnera en 1969 requiere el trabajo de quimicos altamente especializados, much os reactivos caros, centenares de operaciones separadas, un equipo autornatico complejo y un periodo de meses para su preparacion y ejecucion. Las celulas bacterianas no solo pueden pro~ ducir moleculas de proteinas individuales con rapidez, sino que son capaces de construir 3000 0 mas clases de proteinas simultanearnente, y en la relacion molar precisa para constituir una celula viva y que funcione.

La conexion en secuencias consecutivas de las reacciones enzimaticas perrnite la requlacion del metabolismo y le dota de capacidad para auto-ajustarse. En el caso mas sencillo, la acumulacion de un producto final del metabolismo, tal como un aminoacido, puede inhibir la etapa determinante de la velocidad en la secuencia de reacciones mediante las cuales se forme, tipo de control conocido como inhibicion «[eed-beck», Las celulas vivas poseen, ademas, la capacidad de regular la sintesis de sus propios catalizadores. Asi, la celula puede «interrumpir» la sintesis de los enzirnas necesarios para la produccion de un producto deterrninado a partir de sus precurs ores cuando tal producto puede obtenerlo, ya fabricado, del entorno. Surge entonces otro principio importante: Las celules son capaces de regular sus reecciones metebolices y las biosintesis de sus enzimes para obtener el maxima de efi~ cacia y de economie.

Autorreplica de los organismos vivos

La propiedad mas notable de las celulas vivas es su capacidad de reproducirse con fidelidad casi perfecta, no solamente una ados veces, 10 que ya seria bastante notable, sino por centenares y millares de generaciones. Tres caracteristicas resaltan mmediatamente. En primer lugar, algunos organismos vivos son tan complejos que la cantidad de informacion gene~ tica que se transmite parece desproporcionada al pequefio tamafio de las celulas que la deben transportar, concretamente, la celula espermatica y el huevo. Sabemos hoy dia que virtualmente toda la informacion qenetica se haIIa presente en los cromosomas, codificada en forma de secuencia especifica de los nucleotidos constituyentes de una pequefia cantidad de DNA, la cual, en el esperma humano 0 en el ovule, pesa no mas que unos 6 picogramos (1 pg = 1 X 10-12 g). La investigacion moderna de los aspectos bioquimicos de la genetica ha conducido, de este modo, a otro axioma de la loqica molecular del estado vital: Los simbolos en las que se halla codificada la iniormecion genetica en el DNA, son de dimensiones sub-moleculeres.

La segunda caracteristica notable de la propiedad de autorreplicacion de los organismos vivos, consiste en la extraordinaria estabilidad de la informacion genetica almacenada en el DNA. Muy pocas de las primitivas inscripciones historicas realizadas por el hombre han sobrevivido tanto tiempo, a pesar de que fueron labradas en piedra 0 en cobre y preservadas de la acci6n de los elementos. Los manuscritos del Mar

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lntroduccion La loqicejnoleculer de los organismos vivos

Muerto y la piedra de Rosetta. por ejemplo, tienen solo unos pocos miles de afios. Pero existen buenas razones para creer que las bacterias actuales poseen, aproximadamente, una misrna forma, tarnafio y estructura interna, y contienen identica cIase de moleculas estructurales, asi como unos mismos tipos de enzimas. que las que vivieron hace cientos de millones de afios, a pesar de que las bacterias, como todos los organismos, han experimentado una evoluci6n constante. La informaci6n genetica no se conserva en planchas de cobre 0 grabada en piedra, sino en forma de DNA, una molecula orqanica tan fraqil que cuando se aisla en disoluci6n se escinde en muchos fragmentos con solo agitar la disoluci6n 0 pipeteandola.

La capacidad de las celulas vivas para preservar su infermaci6n genetica es eI resultado de la complementaridad es~ ttucturel. Una hebra de DNA actua como patr6n para la replica enzimatica de otra hebra de DNA estructuralmente complementaria. En realidad, los enzimas de la celula que sintetizan el DNA no pueden confeccionarse sin el concurso de un patr6n. Se tiene ahora la certidumbre de que, incluso en la celula intacta, la molecula de DNA puede escindirse con frecuencia, pero es reparada con rapidez y automaticamente por enzimas especificos. No es frecuente que se prcduzcan errores 0 mutaciones, pero incluso estes no siempre son perjudiciales, y pueden resultar ventajosos al permitir a una especie determinada de organismo modificar gradualmente su identidad con objeto de adaptarse mejor a los cambios de su entorno durante el curso de la evoluci6n.

Existe atin una tercera caracteristica digna de menci6n en la transferencia de la informaci6n genetica en los organism os vivos. Tal informaci6n esta codificada en forma de una secuencia especifica de cuatro mononucIe6tidos basicos, sillares estructurales de la molecula lineal del DNA. Pero las celulas vivas poseen una estructura tridimensional y cons tan de partes o componentes tambien tridimensionales. Se lIega, con ello, a un axioma muy crucial en la l6gica molecular de la vida, el que proporciona el nexo de uni6n entre la sencilIa qui mica lineal del DNA y todos los atributos tridimensionales de la gran variedad de organismos multicelulares: La informacion unidimensional del DNA es trsnsjetide a la informacion ttidimensional inherenie a los componentes mecromoleculeres y supramacromoleculares de los orqenismos, gracias a la treslecion de fa estructure del DNA a la esttucture proteica. La secuencia lineal de bases especifica del DNA se transcribe a la correspondiente secuencia lineal de aminoacidos de una cadena polipeptidica durante el proceso de sintesis de las pro~ teinas. Sin embargo, a diferencia de la molecula de DNA, una cadena polipeptidica no es estable en forma lineal extendida. Espontaneamente se enrosca y se pliega en una estructura tridimensional estable, especifica, cuya precisa geometria esta determinada por la secuencia aminoacida en su cadena polipeptidica. Cada tipo de cadena polipeptidica adoptara su propia conformaci6n especifica tridimensional, la cual le conHere, a su vez, un tipo especifico de actividad biol6gica. Ademas, las muy diversas cIases de rnoleculas proteicas, que son componentes de bioestructuras tales como las membranas, los ribosomas y los orqanulos, se agrupan entre si de manera automatica originando conjuntos tridimensionales, reproducibles con precisi6n porque solo se adaptan entre ellas de una

13

INTRODUCCION LA LOGICA MOLECULAR DE LOS ORGANISMOS VIVOS

manera determinada, de acuerdo tarnbien con el principio de la complementariedad estructural.

Acabamos de describir cierto numero de interacciones e interrelaciones caracteristicas de las biornoleculas que constituyen. en conjunto, la l6gica molecular de la vida. Podemos resumir estos principios mediante la siguiente aseveraci6n:

Una celule viva es un sistema ebierto isotettnico de molecules orqtuiices que se ensemble, ajusta y perpetue por si mismo y opera sequn el principio de maxima economie de partes y procesos : promueve muches reecciones organicas ligadas consecutioemente, destinedes a la trensjerencie de enerqie y a fa sintesis de sus ptopios componentes por medic de cetelizedores orqsnicos que ella misma produce. En ninqun momenta de nuestro examen de la l6gica molecular de las celulas vivas hemos encontrado violaci6n alguna de las leyes Iisicas conocidas, ni hemos necesitado definir ninguna ley nueva. La maquinaria de las celulas vivas actua dentro del mismo conjunto de leyes que rigen la actuaci6n de las maquinas construidas por el hombre. pero las reacciones quimicas y los procesos de las celulas se han perfeccionado mucho mas de las posibilidades presentes de la ingenieria quimica.

En esta revisi6n orientadora hemos esbozado el objetivo central y mas fundamental de la bioquimica actual, a saber, el determinar detalladarnente la l6gica molecular de la celula viva. No es este, sin embargo. el unico objetivo de la bioqui mica ni tan siquiera el ultimo. La bioquimica de la celula, tema de este Iibro, no constituye sino el punto de partida para el estudio molecular de otros muchos problemas de la biologia. Lo mas fundamental es quiza deducir c6mo en la oscura historia inicial de la Tierra ciertos compuestos inorqanicos inanimados «se encontraron» primero y «aprendieron» despues a establecer interacciones mutuas, orqanizandose por ultimo y dan do lugar a las primeras estructuras «vivas». Otro de los objetivos es llegar a saber c6mo las primeras celulas experimentaron un desarrollo evolutivo que condujo a la notable diversidad de especies animales y vegetales que contemplamos en nuestro entorno en la actualidad. Un objetivo ulterior 10 constituye la descripci6n molecular de las interacciones de las celulas con los tejidos y de funciones especializadas tales como la contracci6n muscular. Otro nuevo objetivo es el analisis bioquimico de la neurofunci6n, desde el nivel de la comunicaci6n intermolecular simple hasta la integraci6n, la memoria, el comportamiento y. finalmente, el pensamiento; es decir, todas las profundas preguntas Iormuladas por la inquietud del hombre para la comprensi6n de su naturaleza. Conjuntamente con estas cuestiones Iundamentales, la bicquimica esta desarrollando un mas profundo conecimiento de las enfermedades human as y de su alivio, de la vida vegetal y la agricultura, y del balance ecol6gico de la biosfera.

Al comenzar el estudio de la bioquimica, los principios de organizaci6n que constituyen la l6gica molecular de las celulas serviran de marco de referencia. Comienza este libro con una descripcion de las diversas clases de biomoleculas (parte 1). Continua despues con el analisis de las reacciones enzimaticas, isotermicas, autoajustadas y consecutivamente enlazadas, las cuales constituyen el sistema abierto a traves del cual fluyen materia y energia, es decir. el proceso del

14

lntroduccion La 16gica molecular de los organismos vivos

metabolismo. Este, como hemos podido ver, consiste en dos redes de reacciones: la red productora de energia en forma de ATP sera objetivo de estudio en la parte 2, y el otro gran reticulo, que examinaremos en la parte 3, emplea el ATP para la sintesis y el cumplimiento de la fun cion celular, Finalmente, en la parte 4 consideraremos la base molecular de la autorreplica de las celulas y el ensamblaje de los componentes celulares. Termina el libro retornando al origen de la vida y a su logica molecular.

15

PARTE 1

COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Cristales de tripsine bovina

M. Kunit=

CAPITULO 1

TABLA 1-1. Los bioelementos

Los siguientes elementos son esenciales en la nutrici6n de una 0 mas especies, pero no todos son esenciales para cada especie

Rastros de elementos Mn

Fe

Co

Cu

Zn

B

Al

V Mo I

lones monoat6micos Si

Elementos de la materia orqanica o

C

N

H

p

S

Na+ K+ Mg2+ Ca2+

CI-

Sn Ni Cr F Se

TABLA 1-2. Abundancia relativa de los elementos quimicos principales en la corteza terrestre y en el cuerpo humano, en porcentajes del mimero total de atomos.

Corteza terrestre

Cuerpo humane

o 47

Si 28

Al 7.9

Fe 4.5

Ca 3.5

Na 2.5

K 2.5

Mg 2.2

Ti 0.46

H 0,22

C 0.19

H 63

o 25.5

C 9.5

N 1.4

Ca 0.31

P 0.22

CI 0.08

K 0.06

S 0.05

Na 0,03

Mg 0.0]

Blomoleculas y celulas

En este capitulo. el primero de una serie dedicada a las estructuras y propiedades de las principales clases de biornoleculas, desarrollaremos la idea de que las biomoleculas deben estudiarse desde dos puntos de vista. Por supuesto, tenemos que examinar su estructura y propiedades tal como hariamos con las moleculas no bioloqicas, mediante los principios y enfoques empleados en la quimica clasica. Pero tambien debemos examinarlas a la luz de la hip6tesis de que las biomoleculas son productos de la seleccion evolutiva, que pueden ser las moleculas mas idoneas para desempefiar su funci6n bioloqica, y que ejercen sus mutuas interacciones dentro del con junto de relaciones, muy especificas, que hemos llama do la 16gica molecular de la vida. En particular. debemos examinar muy detenidamente el tamaiio y la forma de las biomoleculas, puesto que estos no s610 determinan la especificidad bioloqica, sino tambien las dimensiones y las ultraestructuras de las celulas vivas y de sus orqanulos componentes.

Adecuacion bloloqica de los compuestos orqanicos

Algunos elementos quimicos son mas «adecuados» que otros para la construcci6n de las moleculas de los organismos vivos. Solamente 22 de los 100 elementos quimicos hall ados en la corteza terrestre son componentes esenciales de los orqanismos vivos (tabla 1 ~ 1 ). Ademas, la distribuci6n de estos elementos quimicos en los organismos vivos no est a en la misma proporcion con que existen en la corteza terrestre (tabla 1 ~2). Los cuatroelementos mas abundantes en la corteza terrestre son el oxiqeno, el silicic, el aluminio y el hierro. En contraste, los cuatro elementos mas abundantes en los organismos vivos son eloxiqeno, el carbono, e1 hidroqeno y el nitroqeno: constituyen alrededor del 99% de la masa de muchas celulas. Podemos, por tanto. dar por sentado que los compuestos de estos elementos poseen una adecuacion molecular (mica para los procesos que constituyen colectivamente el estado vivo.

El carbono, el hidroqeno, el nitroqeno y el oxigeno poseen una propiedad comun: forman con facilidad enlaces covalentes mediante reparto de pares de electrones. Para com pletar sus capas electronicas externas y formar, de este modo, enlaces covalentes estables, el hidr6geno necesita solamente

19

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

un electron, dos el oxigeno, tres el nitroqeno y cuatro el carbono. Los cuatro elementos pueden reaccionar unos con otros para formar un gran numero de compuestos covalentes diIerentes.

Ademas, tres de estos elementos (C, N yO) pueden cornpartir uno 0 dos pares de electrones para originar enlaces sencillos 0 dobles, capacidad que les dota de considerable versatilidad para el enlace quimico. El carbone, el nitroqeno, el hidroqeno y el oxigeno, se muestran todavia sinqularmente idoneos en otro aspecto: son los elementos mas ligeros capaces de formar enlaces covalentes. Puesto que la estabilidad de un enlace covalente se halla inversarnente relacionada con los pesos atomicos de los atomos unidos, estos cuatro elementos son capaces de formar enlaces covalentes muy fuertes.

Particularmente significativa es la capacidad de los atemos de carbono para ejercer interacciones mutuas y formar enlaces covalentes estables carbono-carbono. Puesto que los atomos de carbono pueden aceptar 0 ceder cuatro electrones para completar el octeto externo, cada atomo de carbono puede formar cuatro enlaces covalentes con otros cuatro atomos de carbono. De este modo los atomos de carbono unidos covalentemente pueden constituir esqueletos lineales 0 ciclicos para una inmensa variedad de molecules orqanicas diferentes. Por otra parte, puesto que los atomos de carbono establecen con facilidad enlaces' covalentes con el oxigeno, el hidroqeno y el nitroqeno, asi como con el azufre, se pueden introducir gran mimero de clases de grupos funcionales en la estructura de las moleculas orqanicas.

Los compuestos orqanicos del carbono poseen todavia otra caracteristica distintiva. A causa de la confiquracion tetraedrica de los pares electronicos compartidos alrededor de cada atomo de carbono, se pueden conseguir muchas estructuras tridimensionales diferentes mediante enlaces carbono-carbono. Ninqun otro elernento quimico puede formar moleculas estables de tamafios y formas tan diferentes, ni con tal variedad de grupos funcionales.

[erarquia de la organizaci6n molecular de las celulas

Las biomoleculas de los organismos se hallan ordenadas en una jerarquia de complejidad molecular creciente, tal como aparece en la figura 1 ~ 1. Todas las biomoleculas orqanicas derivan en ultimo termino de preCl1rsores muy sencillos, de bajo peso molecular, obtenidos de su entorno, a saber: el dioxide de carbone, el agua y el nitroqeno atrnosferico. Estos precursores se convierten por la materia viviente, a traves de secuencias de intermediarios metabolicos de tamafio molecular creciente, en las biomoleculas smares estructureles, compuestos orqanicos de peso molecular intermedio. Estas unidades estructurales se unen unas a otras, covalentemente, para formar las macromoleculas de la celula, que poseen pesos moleculares relativamente e1evados. ASi, los aminoacidos son las unidades estructurales de las proteinas; los mononucleotidos son las unidades estructurales de los acidos nucleicos: los monosacaridos son los sillares constitutivos de los polisacaridos y los acidos grasos 10 son de la mayor parte de los lipidos. [Aunque los pesos moleculares de los lipidos individuales son bajos (Pm 750 a 1500) comparados con los de

20

FIGURA 1-1

[ererquie de la orqenizecion molecular en las celules.

TABLA 1-3. Componentes moleculares de una celula de E. coli.

Componente

Porcentaje del peso total

Niim-eprox. de especies moleculeres

Agua 70
Proteinas 15 3000
Acidos nucleicos
DNA 1 1
RNA 6 1000
Hldratos de carbono 3 50
Lipidos 2 40
Molecules sillares
estructurales e in-
termediarios 2 500
Iones Inorqanlcos 1 12 Capitulo 1 Biomoleculas y celules

Orqanulos

Gelula

Nucleo Mitocondria Cloroplastos Cuerpos de golgi

Rtbosomas

Complejos enzlmaticos Sistemas contractiles Microtubulos

Acidos nucleicos Proteinas Polisacaridos

Lipidos

Nucleottdos Aminoacidos Monosacaridos

Actdos grasos Glicerina

Piruvato

Citrate

Malato

Gliceraldehido 3-fosfato

Dloxido de carbono Agua

Amoniaco

Nitroqeno

Asociaciones supramoleculares. Peso de particula 10'_10'

Macromolecules. Peso molecular 103_10'

Un ida des 0 sillares estructurales. Peso molecular

100-350

Intermediarios. Peso molecular 50-250

Precursores del entorno. Peso molecular 18-44

las proteinas, los acidos nucleicos y los polisacaridos, los lipidos se asocian de manera espontanea para formar estructuras de peso molecular alto y habitualmente actuan como sistemas macromoleculares. Para nuestro gobierno, podemos incluirlos, arbitrariamente, entre las macrornoleculas.]

En el nive1 de organizaci6n inmediatamente superior, macromoleculas de diferentes clases se asocian unas con otras para forrnar sistemas suoremecromoleculeres, tales como lipoproteinas, que son complejos form ados por lipidos y proteinas, y ribosomes, que, a su vez, son complejos de acidos nucleicos y proteinas. Por ejemplo, cada ribosoma de una celula bacteriana contiene 3 moleculas ,. diferentes de acido ribonuc1eico y alrededor de 50 diferentes moleculas de proteina. Sin embargo, existe una diferencia distintiva en e1 modo de uni6n de los componentes. En los complejos supramoleculares, las macrornoleculas componentes no se hallan unidas covalentemente unas a otras. El acido nuc1eico y la proteina componentes de los ribosornas no se hallan unidos entre si covalentemente; se mantienen unidos por la acci6n de fuerzas no covalentes, relativamente debiles, tales como los enlaces de hidr6geno, las interacciones hidrofobas y las interacciones de van der Waals. Sin embargo, debido a que se mantienen unidos mediante un gran numero de tales asociaciones debiles, los complejos supramoleculares como los ribosomas son sorprendentemente estables bajo condiciones bioloqicas. Por otra parte, la asociacion no covalente de rnacromoleculas para constituir complejos. supramoleculares es muy especifica: es e1 resultado de un precise acoplamiento qeometrico, 0 complementaridad, entre las partes componentes. Por ejemplo, como veremos mas adelante (cap. 33), la estructura tridimensional de los ribosomas muestra un elevado grado de ordenacion y es muy especifica, de acuerdo con su compleja Iuncion

21

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

en la traduccion de la informacion genetica hasta la estructura proteica.

En el nivel de orqanizacion mas elevado de la jerarquia de la estructura celular, diversos complejos supramoleculares se ensamblan ulteriormente para constituir organulos, tales como nucleos, mitocondrios y cloroplastos, e inclusiones, tales como lisosomas, microcuerpos y vacuolas. De acuerdo con los conocimientos actuales, tambien aqui los diversos componentes estan asociados mediante interacciones no covalentes.

Las cantidades relativas de las cIases principales de biomoIeculas en la bacteria comun Escherichia coli, aparecen en la tabla 1~3. Las proteinas (del griego proteios, «el primero») son las macromoleculas mas importantes de la celula, constituyen alrededor del 50% del peso seco de las celulas. La celula de E. coli puede contener alrededor de 3000 cIases diferentes de moleculas de proteina. El segundo conjunto de macromolecules que sigue en abundancia, en E. coli, son los acidos nucleicos, seguidos de los hidratos de carbono y de los lipidos. En realidad, todas las celulas vivas contienen aproximadamente las mismas proporciones de las cIases principales de biomoleculas tal como se puede ver en la celula de E. coli si dejamos de considerar partes relativamente inertes de los organismos vivos tales como el exoesqueleto, la porcion mineral del hueso, materiales extracelulares tales como el pelo 0 las plumas, y materiales de reserva intracelular como el almidon y la grasa, cuyo contenido varia ampliamente de una celula u organismo a otro. Asi la porcion «viva» de todos los tipos de celulas posee casi la misma composicion molecular.

Los tipos principales de biornoleculas ejercen identicas funclones en todas las especies de celulas. Los acidos nucleicos actuan universal mente almacenando y transmitiendo la infermacion genetica. Las proteinas son los productos directos y los efectores de la accion de los genes. Algunas protein as poseen actividad catalitica especifica y actuan como enzimas: otras desempefian el papel de elementos estructurales. Las proteinas son las mas versatiles de todas las biomoleculas, razon por la cual constituyen el tema de siete de los trece. capitulos dedicados en este libro a la estructura y las propiedades de las biomoleculas, Los polisacaridos desempefian dos funciones principales en todas las celulas. Algunos, como el almidon, sirven a modo de almacenes de combustibles que proporcionan energia para la actividad celular, y otros, como la celulosa, sirven de elementos estructurales extracelulares. Los Iipidos, a su vez, tambien desempefian el mismo papel en todas las celulas, bien como componentes estructurales principales de las membranas 0 como forma de almacenar combustible rico en energia.

Es necesario comentar otro punto. Existe una diferencia import ante y fundamental entre los acidos nucleicos y las pro~ teinas, por una parte, y los polisacaridos y los lipidos por otra (fig. 1 ~2). Los acidos nucleicos y las proteinas son mecromoleculas informativas. Cada molecula de acido nucleico contiene cuatro 0 mas tipos de nucleotidos dispuestos en una secuencia especifica rica en informacion. Del mismo modo, cad a molecula proteica contiene una secuencia especifica. rica en informacion, de cerca de 20 aminoacidos diferentes. Por otra parte, los polisacaridos y Iipidos no desempefian la funcion de transportar la informacion. Por ejemplo, los sillares

22

FIGURA 1-2

Mecromoleculas iniormetives de la celule. Las letras A, T, G y C simbolizan las cuatro bases de los mononucleosidos, silleres estructureles del DNA. Los eminoecidos, unidedes esttuctureles de

las proteines, se simbolizan mediante sus abreviaturas de tres letras, Arg, Ala, Trp, etc.

I I
A Arg
I I
T Ala
I I
G Trp
I I
A Met
I I
c Asn
I I
G Glu
I I
A Tyr
I I
C Phe
I I
G lie
I I
G lie
I I
A Tyr
I I
T Ala
I I
T Lys
I I
G Lys
I I
Secuencia Secuencia
nucleosidica arninoacida
de una en una
molecula proteina
de DNA FIGURA 1-3

Biomoleculss primordieles (Izquierda}. Aunque se han escogido algo erbitrerinmente, los compuestos mostrados pueden set consideredos los antecesores mas sencillos, de los que derivan todas las biomolecules orqenices durante

el curse de la evoluciori bioquimica.

Se hallan agrupadas de ecuerdo con sus estructures quimicas y aparecen en forma no ionizada. Los eminoticidos

son los silleres de las proteinas; las purines, las pirimidinas y la ti-ribose son los precutsores de los ecidos nucleicos: la »-alucoea es el precursor de muchos poliseceridos y le qlicerins, la coline y el ecido palmitico son los silleres de los lipidos.

Biomoleculas Primordiales

Aminoacldos (en forma no

ionizada) OH I

CH3CHCHCOOH

I

NH2

Treonin<1

HCHCOOH I

NH2

Glicocola

CH~JCHCOOH .J I

NH2 Alanina

~. CH2CHCOOH

I t-::

NH2 Fenilalanina

CHa

, .

CH3CHCHCOOH

,

NH2 Valina

HO

Tirosina

CHaCHCH2GHCOOH

I i

CHa NH2

Leucina

~-C-CH2CHCOOH

IJ r

/CH NH

N 2

H

,. Tript6fano

CHa

,

CHaCH2CHCHCOOH

i .

. NfI~

Isoleucina

HS-CH2CHCOOH

J

. NH2

Cistelna

HOCH2CHCOOH I

NH2

Serina.

CH~-S-CH2CH21HCOOH NH2 Metionina

Prolina

Pirimidinas

EI azucar

_ .. 0

II .

c HN/ 'CH

I "

O=C, /CH

N

H

Uracilo

o If C

HN/ 'C-CH

I II 3

O=c, /CH

N

H

Timina

H OH

a-o-Glucosa

H

OH OH a .... D-Ribosa

.

Citosina

Purinas

NH2

I

C N

N-:? 'C/ \

I II CH

HC~ /C, /

N N

H

Adenina

Guanina

Capitulo 1 Biomoleculas y celules

HOOCCH2CHCOOH ..

,

NH2 Acido aspartico

H2N-CCH2CHCOOH

ttl

o NH2

Asparagina

HOOCCH2CH2CHCOOH

I

NH2

Acido glutamico

H2N-CCH2CH2CHCOOH

t I I'

a NH2

Glutamina

HC=C-CH2CHCOOH

/ \ ,

N, /NH NH2 CH

Histidina

H2N -C-NH-CH2CH2CH2CHCOOH

If ,

,NH NH2 .

Arginina

Lisina

Un azucar alcohol CH20H

t CHOH

I

CH20H

Glicerina

Un alcohol nitroqenado CH3

+1 CHa-N-CH2CH20H

,

CH3 Colina

23

PARTE

COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

sucesivos de los polisacaridos 0 bien son todos identicos, como ocurre en el caso del almidon, un polimero de la n-glucosa, o bien estan constituidos s610 por dos tipos de unidades estructurales de azucar, las cuales meramente se alternan.

Las biomoleculas primordiales

La tabla 1~3 muestra que en una celula de E. coli, existen quiza 3000 tipos diferentes de proteinas y 1000 tipos de acidos nucleicos. Todas las diferentes proteinas estan constituidas solamente por 20 aminoacidos distintos y los acidos nucleicos 10 estan, en su mayor parte, por 8 nucle6tidos diferentes. De manera semejante, los polisacaridos de E. coli estan integrados solamente por unas pocas moleculas de azucares Simples. Puesto que las macrornoleculas de todos los organismos estan constituidas s610 por relativamente pocas y simples moleculas-sillar, se ha sugerido que las primeras celulas que surgieron sobre la tierra, pudieron haberse construido a partir unicamente de dos 0 tres docenas de moleculas orqanicas diferentes (fig. 1~3). Este conjunto de biomoleculas primordiales puede haber incluido 20 aminoacidos, 5 bases nitrogenadas y 1 6 mas acidos grasos, 2 azucares, el alcohol glicerina y una amina, la colina. Cualquiera que sea su numero preciso y su identidad, este con junto de biomoleculas primordiales puede ser considerado como el antecesor de todas las dernas biomoleculas: constituye el primer alfabeto de la materia viviente. Deberiamos considerar a este grupo de sustancias orqanicas sencillas con cierto respeto y admiraci6n y preguntarnos cual es la extraordinaria y singular relacion que existe entre ellas.

Especializacion y diferenciacion de las biomoleculas

A medida que los organismos vivos evolucionaban hacia formas mas complejas y altamente diferenciadas, se desarrollaban nuevas biomoleculas, de mayor complejidad y variedad. Por ejernplo, hasta ahora se han encontrado en el mundo bio- 16gico alrededor de 150 aminoacidos diferentes. Casi todos ellos derivan de los 20 aminoacidos fundamentales utilizados en la construcci6n de proteinas. De modo analoqo, se conocen docenas de nuc1e6tidos diferentes y de derivados de nucleotidos, conteniendo todos descendientes de las cinco bases nitrogenadas principales. Derivan bio16gicamente de la glu~ cosa unos 70 azucares sencillos, a partir de los cuales se forma gran variedad de polisacaridos en diferentes orqanismos. Existen muchos acidos grasos diferentes. todos ellos descendientes de uno 0 de unos pocos acidos grasos primerdiales. En la tabla lA aparecen algunos ejemplos de descendientes especializados de las biornoleculas.

Muchas de las biomoleculas especializadas son extremadamente complejas y a primera vista parecen conservar poca semejanza con las 30 biornoleculas primordiales. Entre ellas se encuentran pigmentos, aceites esenciales arornaticos, hormonas, antibi6ticos, a1caloides y divers as moleculas estructurales tales como la lignina de la madera. La investigaci6n reciente sobre la biogenesis de tales sustancias complejas muestra, no obstante, que tambien derivan, en ultimo termino, de alguna de las biomoleculas primordiales. Por ejemplo, los

24

TABLA 1~4. Algunos derivados especializados de las biomoleculas primordiales.

Arginina

Ornitina

Citrulina

Prolina 3-Hidroxiprolina 4-Hidroxiprolina 4-Hidroximetilprolina 4-Metilenprolina 4-Cetoprolina

Leucina /3-Hidroxileucina 8-Hidroxileucina

y.8 - Dihidroxtleucina y-Hidroxtleuclna N-Metilleucina

Guanina l-Metilquantna 2-Metilguanil1a 2-Dimetilguanina 2-0-Metilguan'!l.,a

7 -Metilguanina

n-Glucosa n-Manosa n-Fructosa n-Galactosa

N -Acetilq I ucosamina Acldo n-qlucuronico o-Glucosa-ti-fosfato Acido asc6rbico Inositol

Sacarosa

Maltosa

Lactosa

Acido palmitico Acido oleico

Acido estearico Acido laurico Acido palmitoleico Aldehido palrnitico Aldehido estearico

TABLA 1-5. Algunos

compuestos orqanicos producidos mediante descargas electric as

en las condieiones de la atmosfera primitiva. *

Glicocola Alanina Sarcosina f:1-Alanina

Acido o-amlnobutirtco N-Metilalanina

Acido aspartico

Acido qlutamico

Acido iminodiacetico

Acido irninoacetopropionico Acido forrnico

Acido acetico

Acido qllcolico

Acido lactico

Actdo a-hidroxibutirico Acido succinico

Urea

Metilurea

* Se han encontrado otros muchos; vease capitulo 37.

Capitulo 1 Biomolecules y celules

terpenos, una amplia clase de biomoleculas, que comprenden algunas de las vitaminas, muchos aceites esenciales, piqmentos vegetales y productos complejos naturales tales como el caucho, proceden, en ultimo terrnino, del acido acetico, producto principal de la deqradacion de la glucosa y de los acidos grasos. Se conocen centenares de alcaloides diferentes, la mayor parte de los cuales derivan de los aminoacidos, De este modo, las biornoleculas son los antepasados bioloqicos de un vasto mimero de compuestos orqanicos diferentes que se haHan en las divers as especies de organismos vivos actuales.

Origen de las biomoleculas

Aparte de su existencia en la materia viva, unicamente en la corteza terrestre se encuentran vestigios de compuestos orqanicos. L Como adquirieron, pues, los primeros organismos vivos sus siflares orqanicos caracteristicos?

Investigaciones recientes sugieren que en epoca temprana de la historia de la Tierra muchos compuestos orqanicos diferentes aparecieron en concentraciones relativamente altas, en las aguas superficiales del oceano. De esta «sopa» caliente de compuestos orqanicos surqio, de alqun modo, la primera celula viva (vease cap. 37). Se acepta en la actualidad la creencia de que la edad de la Tierra es aproximadamente de 4800 millones de afios (4,8 X 109). Los organismos vivientes pueden haber aparecido quiza 4000 millones de afios atras. Los restos fosiles de bacterias semejantes a las que hoy se conocen han sido fechados con cierta seguridad y cuentan al menos con 3300 millones de afios de edad.

Al final de la decada de los afios 20, el bioquimico SD~ vietico A. I. Oparin suqiric que los procesos quimicos y Iislcos que tuvieron lugar en la atmosfera primitiva pudieron haber conducido a la formacion espontanea de compuestos orqanicos simples (tales CDmD aminoacidos y azucares ) a partir de amoniaco, metano y vapor de agua, que el suponia que se haIIaban presentes en la atmosfera primitiva. De acuerdo con esta teoria. dichos gases fueron activados por la energia radiante de la luz solar 0 por descargas electricas y reaccionaron entre si. Los compuestos orqanicos simples form ados de esta manera se condensaban y disolvian en el oceano primitive, que se enriquecio gradualmente con gran variedad de compuestos. Oparin suqirio que la primera celula viva surqio de modo espontaneo de esta disolucion concentrada y caliente de compuestos orqanicos, pun to de vista que fue tambien enunciado, independientemente, por J. B. S. Haldane en Inglaterra. Estes puntos de vista fueron muy controvertidos y permanecieron como una especulaci6n sin confirmar durante 20 afios.

Recientes estudios de laboratorio han confirmado que IDS componentes gaseosos que se cree que formaban parte de la atmosfera primitiva pueden ser los precursores de los cornpuestos orqanicos. Entre los experimentos iniciales sobre el origen abiotico de las moleculas orqanicas figuran IDS realizados en 1953 por Stanley Miller. Sometio mezclas gaseo~ sas de metano, amoniaco, agua e hidroqeno, considerados entonces como IDS componentes predominantes en la atmosfera primitiva, en un recipiente cerrado y a 80oC, a la accion de chis pas electricas entre dos electrodes, para simular un relampagueo durante periodos de una semana e incluso mas

25

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

prolongados (fig. lA). A continuacion recoqio y analizo el contenido del sistema. Se hallo que la fase gaseosa contenia monoxide de carbone, dioxide de carbono y nitroqeno, los cuales se formaron, evidentemente, a partir de los gases introducidos en un principio. En el condensado obtenido por enfriamiento se hallaron cantidades significativamente grandes de compuestos orqanicos solubles en aqua, que fueron separados por metodos cromatograficos. Entre los compuestos que Miller identifico se hallaban cierto numero de a~aminoacidos, incluyendo algunos de los presentes en las proteinas, tales como la glicocola, la alanina y los acidos aspartico y gluta~ mico. Encontro tambien diversos acidos orqanicos sencillos que se sabe que se hallan en los organismos vivos, tales como los acidos Iormico. propionico, lactico y succinico (tabla 1 ~5).

Miller suponia que los diversos compuestos orqanicos formados en estos experimentos se originaban en la secuencia de reacciones que muestra la tabla 1~6. Presento la teoria de que se formaba acido cianhldrico a partir del metano y del amoniaco. El metano se transformaba tambien, mediante las descargas electric as , en etileno y otros hidrocarburos. £1 cianuro de hidrogeno reaccionaba con el etileno para formar un nitrile (reaccion 2), que por hidrolisis se transformaba en acido pro~ pionico (reaccion 3). De modo analoqo, los a~hidroxinitrilos reaccionaban con el amoniaco forman do a~aminonitrilos (reaccion 4), los cuales por hidrolisis posterior conducian a la formacion de la~aminoacidos, tales como la alanina (reaccion 5).

Los experimentos de Miller .Iueron llevados a cabo en un sistema rico en compuestos reducidos: metano y amoniaco, pero en experimentos mas recientes, en los que se sometieron a la accion de la energia radiante mezclas que contenian nitrcqeno, hidroqeno, monoxide y dioxide de carbone, pero con ausencia de metano 0 de amoniaco, se produjeron tarnbien aminoacidos t otras rnoleculas orqanicas, con 10 que se demostro que la presencia de precursores muy reducidos como amoniaco 0 el metano no es esencial para la Iormacion abiotica de moleculas orqanicas.

Muchas formas diferentes de irradiacion han dado lugar .. a la Iormacion de compuestos orqanicos a partir de mezclas gaseosas tales como las descritas anteriormente, incluyendo la luz visible, la radiacion ultravioleta, los rayos X, la radiacion gamma, las descargas electricas luminosas y silentes, las vibraciones ultrasonicas y las particulas a~ y f3~ de elevada energia. En tales experimentos se han formado varios centenares de compuestos orqanicos, incluyendo representantes de todos los tipos de moleculas importantes encontrados en las celulas, asi como de muchos que no se encuentran en elIas.

TABLA 1-6. Reacciones quimicas en descargas electricas.

CH. + NH3 ~ HCN + 3H2 CzH. + HCN ~ CH3CH2CN

Un nitrilo

CHsCH2CN + 2H20 ~ CHaCH2COOH + NHs Acido propi6nico CHaCHOHCN + NHs ~ CHaCHNH2CN + H20

Un aminonitrilo

CHsCHNH2CN + 2H20 ~ CH.,CHNH2COOH + NHs AJanina

26

FIGURA 1~4

Aparato de descargas electrices para mostrer la [ormecion ebiotice de compuestos orgimicos en las condiciones de la atmosfera primitive.

Mezcla de NH,. CH •• H, y H,O a 80"C

10 em

(1) (2)

(3)

(4)

(5)

Capitulo 1 Biomolecules y celules

Todos los aminoacidos corrientes presentes en las proteinas, las bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina, uracilo y timina, que son las unidades estructurales de los acidos nucleicos, y muchos acidos orqanicos de siqnificacion bioloqica, asi como tambien azucares, se han detectado entre los productos de las experiencias de simulacion de la tierra primitiva. Parece razonable suponer que el oceano primitive fue rico en compuestos orqanicos disueltos y que estes podian incluir, si no todas, la mayor parte de las moleculas sillares estructurales basicas que reconocemos en las celulas en la actualidad.

Idoneidad de las biomoleculas

iPor que seleccionaron los organismos vivos los tipos especiIicos de moleculas orqanicas que actualmente poseen? iPor que deben ser 20 a~aminoacidos los sillares estructurales de las proteinas? LPor que no son unicamente 10? iPor que no son 40? iPor que son todos a~aminoacidos? iNo podriamos igualmente construir gran des moleculas de «proteina» a partir de aminoacidos que tuviesen sus grupos amino en posicion f3? iPor que fueron seleccionadas las purinas adenina y guanina y las pirimidinas citosina y timina, entre las docenas de derivados purinicos y pirimidinicos , conocidos, como sillares de construccion del DNA de todas las especies? La evidencia experimental corriente sostiene el concepto de que las biomoleculas que conocemos en la actualidad se seleccionaron entre un numero mucho mayor de compuestos orqanicos asequibles, a causa de su especial idoneidad para conferir a las celulas que los contienen una capacidad de supervivencia superior. En realidad se han aislado varios centenares de compuestos orqanicos a 10 largo de los experirnentos de simulacion de las condiciones primitivas de la tierra sobre el origen abiotico de las moleculas orqanicas, y ya que sola mente pueden haberse necesitado un pequefio mimero de compuestos orqanicos diferentes para formar las primeras bioestructuras, parece muy probable que tuvo lugar un proceso de seleccion.

Otro argumento a favor del concepto de idoneidad puede derivarse del hecho de que, a pesar de la existencia bioloqica de 150 aminoacidos, las proteinas de todas las especies se hallan construidas por el mismo con junto de 20 aminoacidos primordiales. Si cualquiera de los otros aminoacidos hubiera demostrado ser mas «adecuado» como componente de las moleculas proteicas que los aminoacidos primordiales, ha transcurrido un amplio tiempo de evolucion disponible para que los organismos hubieran adquirido la capacidad de utilizarlo.

Dimensiones y formas de las biomoleculas

En la Parte 1 examinarernos las estructuras y propiedades de las principales clases de biomoleculas. Trataremos en especial sobre los tarnafios y las formas de las biomoleculas, puesto que estos atributos son muy siqnificativos en bioquimica y en biologia molecular. Ya hemos visto (en la Introduccion] que el encaje complementario entre el sustrato y el centro activo de un enzima es tan grande que hace posible la selectividad de la catalisis enzimatica y la ausencia de subproductos. Tan solo con que se produzca un pequefio cambio en alguna dimension critica de una molecula de sustrato, puede ocurrir que esta

27

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

pueda no acoplarse al centro activo y no resultar ya posible el ser alterada por el enzima. Ademas, la gran exactitud con la - que se replica la informacion genetica del DNA, depende tambien de la precision delacoplamiento mutuo de biomoleculas especificas. Por ello, resulta esencial familiarizarse con las dimensiones y la forma de las biomoleculas, y como se relacionan con las dimensiones de las diversas estructuras intracelulares. La tabla 1~7 muestra las unidades de masa y de longitud utilizadas corrientemente en relacion con las dimensiones moleculares y de la celula.

Las dimensiones moleculares se dieron, en un principio, en unidades angstrom, las dimensiones celulares en micras y las longitudes de onda en milimicras siendo 1 micra = 10-3 mm. Sin embargo, debido a un acuerdo internacional, se recomiendan ahora las unidades metricas: nanometros, micrometros y milimetros. De acuerdo con ello, en. este libra daremos las longitudes de onda y las dimensiones moleculares en nanornetros (nm) y las dimensiones de la celula en nanometros (nm) 0 en micrometros (.um).

La tabla 1~8 muestra los prefijos estandar ernpleados para indicar las potencias de 10 en el sistema metrico. En el apendice se repiten los prefijos, por conveniencia, ya que se alistan otras abreviaturas del SI (Sistema Internacional de Unidades).

Las proyecciones planas bidimensionales, en las que necesariamente aparecen las estructuras de las moleculas orqanicas en las paqinas impresas, son insuficientes para describir la verdadera confiquracion tridimensional de las biomoleculas. Por dicha razon los bioquimicos construyen con frecuencia modelos tridimensionales de las biomoleculas cuando se enfrentan con problemas de especificidad molecular. Existen dos cIases de modelos moleculares (fig. 1 ~5). Los modelos crista~ lograficos muestran el esqueleto covalente, los anqulos de las valencias y las longitudes, pero no indican el espacio real ocupado por la molecula. {.os modelos espaciales compactos, (figs. 1 ~5 y 1 ~6) por otra (Jarte, proporcionan poco detalle con respecto a los anqulos de los enlaces y las distancias en eJ. esqueleto, pero muestran el contorno de van der Waals 0 superficie de la molecula. Aunque ambos tipos de modelos son utiles para el estudio de la estructura de las biomoleculas, eI modele espacial es el que representa la molecula tal como es, «vista» por la celula 0 por uno de sus componentes especificos, por ejemplo un enzima. Pero un enzima «ve» mucho mas que la mera forma tridimensional de su sustrato. Vela, localizacion y el signo de sus cargas electricas y la distancia precis a entre los grupos con carga. Ve las posiciones de los grupos polares sin carga, tales como los grupos hidroxilo, carbonilo y amida que pueden intervenir potencialmente en la formacion de enlaces de hidroqeno, Percibe los tamaiios y las form as de las zonas hidrocarbonadas no polares de la super~ ficie de la biornolecula que pueden proporcionar zonas de contacto importantes con otras moleculas.

La forma tridimensional y la topografia superficial son muy importantes en el caso de las macromoleculas. Las moleculas de proteina solo poseen habitualmente una conformacion tridimensional especifica en las condiciones norm ales intracelulares, denominada conformaci6n netioe, la cual es indispensable para su actividad bioloqica. Por ejemplo, solamente Ia conformacion nat iva de una molecula enzimatica posee acti-

28

TABLA 1-7. Algunas unidades de mas a y de longitud.

Masa

1 dalton

= masa de un atomo de hidr6geno = 1.68 X 10-24 g = I X 10-12 9

picogramo Longitud

1 nan6metro (nm)

= 10-" m

= 10 angstroms (A) =lO-'m'

= 1000 nm

= 10000 angstroms

(A)

1 micr6metro (/Lm)

TABLA 1-8. Prefijos para las
potencias de 10, para uso con las
unidades SI *
Valor Prefijo Abreviatura
10' mega M
1()3 kilo k
10-1 deci d
10-2 centi c
10-3 mill m
10-' micro p,
10-" nano n
10-12 pico p
10-1S femto f
10-18 atto a * Las combinaciones de prefijos ya no se perrniten, de modo que se emplea n- en lugar de mp, y P: en lugar de /LW.

Capitulo 1 Biomolecules y celules

FIGURA 1-5

Diferentes represenieciones de la estructure de la elenine, en ~orma no ionizada.

FIGURA 1-6

Mode/os espaciales de atomos (a escala) de algunos etomos biol6gicamente importantes.

Formula empiric a

0,1 nm r-----l

Formula estructural

H I

CH -C-COOH 3 I

NH2

Modelos cristalograficos

Carbono

Hidr6geno

Bolas y varillas

o

Oxigeno

Nitr6geno

Modele espacial cornpacto

Azufre

N

F6sforo

29

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

vidad catalitica. La conforrnacion tridimensional de una gran biomolecula no puede extrapolarse de la estructura hidimensional de una paqina impresa, ni tam poco puede llegarse a ella Iacilmente mediante modelos espaciales ordinarios. Es necesario un rnetodo Iisico muy complejo, el analisis par di~ [racci6n de ragas X, para establecer la conformacion precisa de las macromoleculas bioloqicas, Realmente, el lograr el diagrama tridimensional de la estructura de las macrornoleculas mediante analisis por rayos X y el establecer la correlacion entre su estructura y su actividad bioloqica constituyen los principales objetivos de la bioquimica y de la biologia molecular.

Biomoleculas, estructuras supramoleculares y orqanulos celulares

El tamafio y la forma de las biornoleculas son de crucial importancia en otro aspecto. Hemos visto que en las celulas hay una jerarquia de orqanizacion molecular (fig. l~l); las biornoleculas sencillas son los sillares de las macrornoleculas y estas son los componentes de los complejos supramacrornoleculares; a su vez, estos ultimos se ensamblan para constituir los orqanulos de la celula. Los orqanulos y otras estructuras se organizan en celulas. Esta claro que las dimensiones, forma y propiedades fisicas de las biornoleculas siIlares sencillas, deben determinar las dimensiones y las propiedades de las macromoleculas, cuya forma y topografia superficial debe, a su vez, determinar como se adaptan conjuntamente para formar estructuras supramoleculares; estas ultimas determinan la estructura de los orqanulos celulares y por ultimo, la de la propia celula.

'Un ejemplo espectacular de como el tamafio, la forma y las propiedades de una biomolecula sillar, relativamente pequefia, pueden influir en el tamafio, la forma Y: el comportamiento bioloqico de una celula entera, 10 proporciona la enfermedad .. genetica humana, llamada anemia [aId[arme. Las celulas rojas de la sangre de lo~ pacientes que sufren de esta enfermedad poseen una composicion bioquimica normal, excepto en la hemoglobina, proteiha transportadora del oxigeno. La proteina esta constituida por, aproximadamente, 600 restos aminoacidos unidos en cuatro cadenas polipeptidicas. Las moleculas de hemoglobina de estos pacientes difieren muy liqeramente en su composicion de la hemoglobina normal, como resultado de una mutacion qenetica: en la hemoglobina Ialciforme, dos moleculas de acido glutamico de la hemoglobina normal se hallan substituidas por dos moleculas del aminoacido valina. Este ligero cambio, que afecta solamente ados de los casi 600 restos aminoacidos, altera la estructura de la molecula de hemoglobina Falciforme, de modo que se «apila» de una manera inadecuada con las moleculas vecinas. El defecto provoca, a su vez, un cambio profundo en la forma de, todo el globulo rojo sanguineo, el cual adopta la forma de una hoz 0 media luna, mientras que los eritrocitos normales son discos pIanos. Como consecuencia, las celulas rojas Ialciformes tienden a agregarse en los vasos sanguineos pequefios, bloqueando la circulacion y provocando otras serias alteraciones. Asi, solamente una diferencia muy pequefia en la estructura de una pequefia y simple molecula de un amino-

30

Capitulo 1 Biomolecules y celules

TABLA 1-9. Dimensiones y pesos aproximados de algunas biomoleculas y eomponentes eelulares.

Peso
Longitud, nm Daltones Picoqtemos
Alanina 0,5 89
Glueosa 0.7 180
Fosfolipido 3.5 750
Mioglobina (una proteina pequefia ) 3,6 16900
Hemoglobina (una proteina de ta-
mafio medic] 6,8 65000
Miosina (una proteina grande en
forma de bast6n) 160 470000
Ribosoma de E. coli 18 2800000
Baeteri6fago </>X174 de E. coli 25 6200000
Virus del mosaico del tabaeo
(un bast6n) 300 40000000 6,68 X 10-'
Mitocondria (celula hepatica) 1500 1.5
Celula de E. coli 2000 2
Cloroplasto (hoja de espinaca} 8000 60
Celula hepatica 20000 8000 acido (cuyo peso es de alrededor de 100 daltones y cuya 10l}~

.gitud es de unos 0,7 nm ) puede dar por resultado un cambio profundo no solamente en la molecula de hemoglobina de la cual es un componente, sino tambien en la estructura, mucho mayor, de toda la celula roja sanguinea (peso de aproximadamente 1 X 1014 daltones; diametro 7000 nm).

Para aportar alguna orientacion con respecto al tamafio relativo de varias bioestructuras, la tabla 1~9 ofrece algunos datos sobre el peso y las dimensiones de las moleculas sillares representativas, de las rnacromoleculas celulares, de los conjuntos supramoleculares, y de los orqanulos. virus y celulas.

. .

Orqanizacion estructural de las celulas

A 10 largo del libro relacionaremos la estructura y fun cion dinamica de cada tipo de biomolecula con la estructura y papel bioloqico de los diversos componentes celulares, por ejemplo, paredes celulares, membranas, ribosomas, cloroplastos. sistemas contractiles, reticule endoplasmatico y nucleo ce1ular. Por ello, antes de que comencemos el estudio detallado de las biomoleculas, es importante revisar los rasgos estructurales principales de los diferentes tipos de celulas, las dimensiones y composicion molecular de sus orqanulos internos y la compartimentacion y division de las funciones celulares vitales entre dichas estructuras internas. Esta vision panorarnica se presenta esquematicamente en las figuras 1~7 a 1-9. que representan tres tipos de celulas. La primera, la bacteria Escherichia coli, el miembro mejor conocido, bioquimica y geneticamente hablando, de la gran clase de celulas proceriotices, (fig. 1~7). La segunda es el hepatocito, 0 celula hepatica, de la rata, ejemplo bien estudiado de la otra gran c1ase de celulas. las euceriotices (fig. 1-8). Tanto la celula de E. coli como el hepatocito obtienen su energia de la oxidacion de las moleculas orqanicas nutrientes adquiridas del entorno. La figu~ ra 1-9 muestra un ejernplo de u~a celula Iotosintetica que obtiene energia de la luz solar.' La celula escogida procede de la hoja verde de una planta superior y es tambien una celula eucariotica,

31

PARTE 1

I

COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

.

FIGURA 1,-7

Organizaci6n estructural de las ceIulas procari6ticas.

Las celules proceriotices son celules sencilles y mug pequeiias; poseen una membrana tinice, le membrana celuler,

la cual se halla rodeede, hebituelmente por una pared celular riqida. Puesto que no poseen otres membranes no coniienen nticleo ni otros organulos membrenosos tales como mitocondrias 0 reticula endoplesmetico. Los proceriotes comprenden las eubacterias, las algas cianoficeas, las espiroquetas, las rickettsias y el micoplasma u organismos similpleuroneumoniales. Solamente contienen un cromosoms, formada pot' una molecule de DNA de doble helice y densemente errolledo para [ormer la zona nuclear. Los procariotas se teproducen en gran parte por division esexuede, Fueron las ptimeres celules que surqieron de fa evolucion bioloqica.

J

Celules en division' de E. coli, teiiides, mostrendo la pared celuler y fa membrane, esi como el DNA [llementoso en la zona

nuclear. (G. Decker.)

1 .. 0 J.Lm

.. Superlicie de una celule en division' de

E. coli, teiiide, para mostrer los numerosos . pili. (A. Riter.)

I u

.l1li'

I

1.0 }.LID

J

Celule de E. coli, teiiide, mostrando los ribosomes. (L. D. Simon.)

0 .. 5 J.Lm

Micrografias electr6nicas de fa bacteria E. coli. .

Este organismo· aerobio es un miembto del grupo colt[orme de becteries, que se encuentre tipicemenie en el fracto intestinal del hombre. La celule madura es una verille cilindrice de 2 /lm de longitud y 1 JLm de diemetro, y su peso es de alrededor de 2 pg. Las celules de E. coli se desarrollan con repidez en un media sencillo que contenga solamente glucosa como [uente de carbona e iones amonio como Fuente nitroqeneda. El tiempo de division puede ebercer s610 20 minutos a 37°C. La mayor parte de nuestro conocimiento sabre La base molecular de fa qenetice precede del estudio de diversns razes y mutantes de E. coli y becterioleqos de E. coli. Aunque se conoce mas de la bioquimice y de, fa genetica de E. coli que de cuelquiet otra celule, nos hallamos todevie mug lejos de una descripcion tnoleculat complete.

32,

Capitulo 1 Biomolecules y celules

Dibujo esquematlco

Propiedades y funciones

Pared celular y membrana

Membrana Pared

celular celular

~

==

Ii

e:=-==e

MOleCUla~ proteica ./

Bicapa L____J~ ~

lipidic a 9 nm 20 nm

Composicion molecular

La pared celular contiene una armadura rigida constituida par cadenas polisacaridas entrecruzadas con cadenas peptidicas cortas. Su superficie exterior esta recubierta con lipopoltsacaridos. Los pili, que no se encuentran en todas las bacterias, son extensiones de la pared celular,

.

La membrana celular contiene aproximadamente un 45 % de lipido y un 55 % de proteina; los lipidos formari una fase no polar continua. Los repliegues de la membrana celular se llaman mesosomas.

La pared celular protege a la bacteria contra el hinchamiento en medios hipotonicos. Es porosa y permite el paso de la mayoria de moleculas pequefias. Algunos de los pili son huecos y pueden servir para transferir el DNA durante la conjuqacion sexual.

La membrana es una zona selectivamente permeable que permite que la atraviesen libremente el agua, ciertos nutrientes e iones metalicos. Los enzimas responsables de la conversion de la energia de los alimentos en ATP, se hallan localizados en la membrana.

Zona nuclear

El material genetico es un cromosoma unico, constituido por un DNA duplo-helicoidal de 2 nm de diametro y 1,2 mm de long itud, con enrollamiento compacto.

El DNA es el portador de la informacion genetica. Durante la division cada hebra se replica originando dos moleculas hijas duplo-heltcoidales.

Ribosomas

18 nm

50S

30S

Cada celula de E. coli contiene 'cerca de 15000 ribosomas; cada uno de ellos posee una subunidad principal y otra menor. Cada subunidad contiene cerca del 65. % de RNA y un 35 % de proteina,

Los ribosomas son los centros de sintesis proteica. El "RNA mensajero se une a las ranuras en~ las subunidades y especiftca la secuencia de los aminoacidos en las cadenas polipeptidicas en erecimiento.

Granules de reserva

00

o

El E. coli y otras muchas bacterias contienen granulos de reserva que son polimeros de azucares, Algunas bacterias contienen granulos de acido poli-jl-hidroxibutirico.

Cuando se necesitan combustibles, estos polimeros se degradan enzimaticamente produciendo glucosa o acido ,8-hidroxibutirico libre.

Citosol

La porclon soluble' del citoplasma es muy viscosa; la' concentraclon de proteina es muy elevada, superando el 20 %.

La mayor parte de las proteinas del citosol son enzimas que se precis an en el metabolismo. El ci~ tosol contiene tambien interrnediarios metabolicos y sales inorqanicas.

33

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 1-8

Organizacion estructural de las cetulas eucarlotlcas,

Las celules euceriotices son mueho mayores y mucho mas complejas de las celulas proceriotices, Bl volumen celular de la mayor parte de las euceriotices es de 1000 a 10 000 veces mayor que el de las tipicas procariotas. Casi todas las celulas de los organismos superiores, tanto del mundo animal como del vegetal, son eucari6ticas, y tam bien 10 son

las de los honqos, los protozoos y la mayor parte de las algas. Las euceriotes coniienen una membrana que rodea el nticleo, Bl material genetico se helle dioidido entre verios 0 muchos cromosomes, los cueles sulren. la mitosis durante la division de le celule. Las euceriotes tembien contienen orqhnulos membrenosos tales como las mitocondrias y los cuerpos de Golgi, asi como un reticule endoplasmtitico. Muchas de sus reecciones metebolices se hallan separadas en compartimientos esttuctureles, Las eucariotas son de origen evoluiiuo mas reciente que las proceriotes: presumiblemente, derionn de estes tiltimss.

O,5/.LID

Micrografia electrdnica de una seccion delgada de una celu1a aislada de higado de rata (hepatocito) fijada con retroxido de osmio,

Los hepetocitos de hiqedo de ret« son poliedricos y poseen un diemetro de alrededor de 20 11m. Son celules metsbolicemenie versa tiles, cuya [uncion mas importante es la trensiormeciori bioquimica y la distribucion de las moieculas de los alimentos que llegan al higado procedentes del tracto intestinal. Almacenan glucosa en forma de gluc6geno, preperen los residues nitrogenados para la excreciori y sintetizen las proteines del plasma sanguineo

y los lipidos. Los hepetocitos son capaces de teelizer todas las principeles «rutas esencieles» representativas de las ectividedes metebolices de las celules. Son quizes las celulas enimeles mejot estudiadas a causa de su facil esequibilided en cantidad y de que pueden [reccionsrse con [ecilided, despues de homoqeneizecion para dar nticleos, mitocorulries, reticula endoplesmetico (la [eeccion microsomal) y otras fracciones subceluletes mediante centrifugaci6n diferencial.

34

Capitulo 1 Biomolecules y celules

Dihujo esquematico

Propiededes, funciones

Membrana celularMembrana ce1ular ~

Envoltura perinuclear

Mitocondria

Crestas

Complejo de Golgi

e Vacuola~::, G

o I) L't/J)o'"

.~.

Composlclon molecular

La pared celular de los hepatocitos es flexible y pegajosa. Esta formada por mucopolisacaridos acidos, glucolipidos y glucoproteinas.

EI espesor de la membrana plasmatica es de unos 9 nm y contiene apro,ximadamente las mismas cantidades de Iipidos y proteinas. Los Iipidos van dispuestos en bicapa. Contiene una mayor variedad de lipidos que las membran as I1acterianas.

EI micleo, de unos 4-6 nm de diametro, esta rode ado de una envoltura perinuclear. EI DNA del in~ terior esta combinado con histonas y org anizado en cromosomas. El nucleolo es rico en RNA.

En cada hepatocito hay unas 800 mitocondrias. Son de forma globular y poseen un diametro algo superior a I pm, y ocupan cerca del 20 % del volumen citoplasmatico. Sus membranas externa e interna difieren en composicion Iipidica. La matriz es rica en enzimas,

Complejo de GoIgi: consta de vesiculas aplanadas con una sola membrana, a veces apiladas, que por estrangulamiento producen otras menores. Algunas se convierten en vacuolas que. concentran productos de secreci6n.

Las propiedades adhesivas de las cubiertas celulares son especificas y desempefian un papel importante en el reconocimiento celulacelula y, por tanto, en la orqanlzacion gel tejido.

La membrana plasmatic a es selectivamente permeable. Contiene sistemas de transporte activo para Na+ y K+, glucosa, aminoacidos y otros nutrientes, asi como cierto mimero de enzimas importantes.

Durante la mitosis los cromosomas experimentan replicacion de su DNA y separacion en cromosomas hijos.

Las mitocondrias son las fabrlcas de energia en la celula, donde los ghicidos, los lipidos y los aminoacidos se oxidan a CO2 y H20 por el oxigeno molecular, y la energia liberada se transforma en energia del ATP. Los enzimas del transporte electronico y de Ia conversion de energia estan localizados en la membrana interna.

EI aparato de Golgi actua en la secrecion de los productos de la celula tales como las proteinas, hacia el exterior. Tambien colabora a formar la membrana del plasma y las membranas de los lisosomas.

Microcuerpos (peroxisomas)

Lisosomas

Los microcuerpos son vesiculas con membrana sencilla, de unos 0,5 pm de diametro, Contienen catalasa, n-aminoacido-oxidasa urato-oxidasa y otros enzimas de oxidaclon frecuentemente presentes en ordenaclon cristalina.

Los lisosomas son vesiculas de membrana sencilla (de 0,25 aD,S pm de diametro] que contienen enzimas hidroliticos como ribonucleasa y fosfatasa.

Los microcuerpos participan en la oxidacion de algunos nutrientes. EI peroxldo de hldroqeno, producto de reduccion del oxigeno en estos orqanulos, se 'descompone y forma agua y oxigeno.

Los lisosomas actuan en la digestion de materiales introducidos en la celula por fagocitosis 0 pinocitosis. Sirven tambien para diqerir los componentes celulares despues de la muerte de las celulas,

Reticulo endoplasmatico y ribosomas

EI reticule endoplasmatico esta constituido por vesiculas aplanadas de una sola membrana, cuyos compartimientos internos, lIamados cisternes, se interconectan formando canales a traves del citoplasma. La superficie rugosa del reticulo endoplasmatico esta tachonada con los ribosomas, que son mayores que en los procariotas.

Las proteinas sintetizadas por los ribosomas adheridos atravlesan la membrana y aparecen en el espacio intracisternal, que forma un canal muy ramiftcado para el trans porte intracelular hacia la periferia de Ia celula. La sintesis proteica por ribosomas no ligados sft produce tambien, igual que en los procariotas.

35

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 1-9

Organizacion estructural de una ceIula fotosinb~tica de una hoja de planta superior.

Las celules perenquimetices del ·mesofilo de hojas de plantas supetiotes son fotosinteticamente ectives. Contienen

la mayor parte de los orqtutulos distintivos y de las esttuctures observadas en las celules eucari6ticas de los enimsles, tales como el ruicleo, las mitocondrias, el aparato de Golgi, el reticulo endoplasmfltico y los ribosomes, Las celules de las hojas contienen, adem as, otras ires esttuctures principeles, que esten ausentes habitualmente en las celules animales: plestidios (incluyendo a los cloroplastos), vacuolas de gran tamano y paredes celuleres gruesas

y rigidas. Las celules de las hojas verdes son ricas en el pigmento clorofila, localizooo en los cloroplastos.

Las actividades bioquimices ptincipeles de las celulas parenquimales son la formaci6n [otosintetice de la glucosa a partir del CO2 y del H20, y el almacenamiento de la glucosa en forma de almid6n. En la oscuridad las celules totosinteticas oxidan a la glucosa y a oitos combustibles a expenses del oxiqeno etmosierico.

M. C. Ledbetter

10,0 p.m

Micrografia electr6nica de la secci6n transversal de una celule parenquimal de hoja de Phleum pratense {alfalfa}.

36

Capitulo 1 Biomoleculas y celulas

Dibujo esquematico

Propiedades y funciones

Pared celular y membrana Membrana Pared

celular celular

Proteina Blcapa lipidica

gnm

20nm

I Nucleo

CJoroplasto

Tilacoides

Mitocondria

Composicion molecular

La pared de las celulas vegetales es gruesa. rigida y a modo de caja. Esta constituida par fibrillas de ceJuJosa unidas por un cemento formado por polis acaridos y proteinas,

La membrana celular de los vegetales es, en general. semejante en espesor, estructura y compostcion a las membranas celulares animales, aunque dlftere algo en Jos componentes lipidicos.

EI micleo, el nucleolo y Ja membrana perinuclear de las celulas vegetales son semejantes, en Iineas generales de estructura y composicion, a los de las celulas animales.

s -caractertstico de las celulas de las plantas superiores su contenido en plastidios, orqanulos rodeados de membrana. algunos de los cuales, poseen un DNA caracteristico. Los que contienen clorofila se Ilaman cloropJastos.

Los c1oroplastos son de tamafio relativamente grande comparados con las mitocondrias. Puede haber uno. varios 0 muchos c1oroplastos por celula, sequn las especies, y tener formas diversas.

Las mitocondrias se encuentran en todas las celulas veqetales, incJuidas las fotoslnteticas. Su orqanizaclon estructural es semejante a la de las mitocondrias de las celulas animales, tanto en su composlcion molecular como enzimatica, Contienen tambien un tipo especifico de DNA.

La pared celular, que es mas bien porosa, protege a la membrana ceJuJar de la ruptura mecanica u osmotica, fija firmemente la posicion de la celula y Ie confiere forma fisica y fortaleza en el tejido vegetal.

La membrana celular de las celulas vegetaJes posee permeabilidad selectiva, contiene sistemas de trans porte activo para nutrientes especlficos e Iones inorqanicos. y para ciertos enzimas.

Los cromosomas en las celulas vegetales experimentan replicacion de su DNA. al igual que en las celulas animales,

Los c1oroplastos son receptores de la energia luminosa, que convierten en energia quimica del ATP para la biosintesis de la qlucosa y otras biomoleculas orqanicas a partir del dicxido de carbo no. agua y otros precursores. El oxigeno se genera en las plantas durante la fotosintesis. Los c1oroplastos son la principal Fuente de energia de las celulas fotosinteticas expuestas a la luz.

Las mitocondrias en las celulas vegetales y animales provocan la oxidacion de los nutrientes y la conversion de energia en ATP. en las celulas de los vegetales no fotosinteticos, son la principal Fuente de enerqia a traves de la respiracion, En las celulas fotosinteticas la respiracion mitocondrial es la principal Fuente de energia en la oscuridad.

Vacuola

Acidos orqanicos,

azucares, sales. proteinas, 0,. CO2• y pigmentos

Reticulo

Las vacuolas son caracteristlcas de las celulas vegetales. Son pequefias en las celulas [ovenes y aumentan mucho de tamafio con la edad, 10 que provoca que el citoplasma se com prima contra la pared celular, Contienen azucares disueltos, sales de acidos orqanicos. protelna, sales minerales, pigmentos, oxiqeno y dioxide de car ono.

EI reticule endoplasmatico de las celulas vegetales es de estructura semejante al de las celulas animales. pero los ribosomas de las celulas vegetales son ligeramente diferentes en tamafio y compostcion quimica de los de las celulas animales,

Las vacuolas segregan productos de desecho de las celulas veqetales y eliminan sales y otros solutos cuya concentracion aumenta gradualmente durante el tiempo de vida de la celula, A veces algunos solutos cristalizan en el interior de las vacuolas.

Los. ribosomas son el lugar en que se sintetizan las proteinas en las celulas vegetales. EI reticule endoplasmatico canaliza los productos proteicos a traves del citoplasma,

37

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS.CELULAS

La bioquimica actual se halla cada vez mas relacionada con la estructura de las celulas y sus orqanulos, Algunos de los avances recientes mas esclarecedores proceden de estudios bioquimicos y morfoloqicos de los procesos celulares combinados. Como veremos, es proposito fundamental de la bioquimica moderna identificar no solo la naturaleza y el mecanisme de las reacciones enzimaticas del metabolismo intermediario y la replicacion y transferencia de la informacion genetica, sino tambien determinar donde tienen lugar dichos acontecimientos en la celula y como los sucesos bioquimicos que se realizan en partes diferentes de la celula se hallan coordinados tanto espacial como temporalmente. Las lineas divisorias entre la bioquimica y la biologia celular son cada vez mas dificiles de identificar, ya que estes campos de la ciencia celular forman, verdaderamente, un conjunto loqico. Asi, la aplicacion de metodos exactos, fisicos y quimicos, al analisis de la estructura de los componentes celulares esta proporcionando una nueva y significativa vision de las funciones de las biornoleculas y de sus interacciones dinamicas mutuas en las celulas vivas.

Resumen

La materia viva necesita solamente 22 de los 100 elementos quimicos encontrados en la cortez a terrestre: los cuatro elementos carbono, hidroqeno, nitroqeno y oxigeno constituyen el 99 % de la masa total de la mayor parte de los organismos. Casi toda la porcion no acuosa de las celulas vivas esta constituida por compuestos orqanicos de carbone, que son muy escasos en la corteza terrestre. El carbono parece el unico elemento «idoneo» para constituir la estructura del esqueleto de las biomoleculas por su capacidad para f~rmar enlaces covalentes est abies con el hidroqeno, oxigeno y nitroqeno y, sobre todo, con "otros atomos de carbono.

Exlste una jerarquia en la orqanizacion molecular de las celulas.

Precursores simples obtenidos del entorno tales como dioxide de carbono. agua y amoniaco. se emplean para formar rnoleculas sill ares tales como los aminoacldos, los nucleotidos, los azucares y los acidos grasos. Estes, a su vez, se unen covalentemente para formar diversas macromolecules, las proteinas, los acidos nucleicos, los polisacaridos y los Iipidos. Las rnacromoleculas se unen entre si no covalentemente en complejos supramoleculares, los cuales en ultimo termino se ensamblan para formar orqanulos celulares.

Las primeras celulas pueden haber sido formadas a partir de un numero relativamente pequefio de biornoleculas primordiales, que incluyen probablemente entre elias 20 a-aminoacidos diferentes cinco bases puricas y pirimidinicas, dos azucares, un acido qraso, la glicerina y la colina. De estas biomoleculas primordiales descienden centenares de otras biomoleculas. que desernpefian funciones mas especializadas y diferenciadas en diversos organismos. Las biornoleculas primordiales pueden haber tenido origen abiotico, que surge de la interacclon de los componentes de la atmosfera primitiva por influencia de la energia radiante 0 de descargas luminosas. Se cree que el mar primitivo contenia gran numero de compuestos orqanicos sencillos. De esta «sopa» primitiva fueron seleccionadas las moleculas mas convenientes para la supervivencia de los primeros orqanismos vivos. Puede suponerse que las biomoleculas sean las moleculas mas sencillas, mas versatiles y mas idoneas que pueden desempefiar sus fpnciones en las celulas. Los tarnafios, formas y caracteristicas superficiales de las biornoleculas son muy import antes en la especlftcidad de sus interacciones bioloqicas y en su papel como unidades estructurales de las macromolecules.

Bibliografia Libras

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Capitulo 1 Biomolecules y celules

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39

CAPiTULO

TABLA 2-1. Calores de vaporizaci6n de algunos liquidos corrientes en sus puntos de ebullici6n (1.0 atm}.

Liquido sn.;
cal 9-1
Agua 540
Metanol 263
Etanol 204
n-Propanol 164
Acetona 125
Benceno 94
Cloroformo 59 2

EI agua

El agua no solamente constituye del 70 al 90 por ciento del peso de la mayor parte de las formas vivas, sino que repre~ senta la fase continua de los organismos. A causa de su abundancia y ubicuidad el agua es considerada, con Irecuencia, UI]. liquido inerte. meramente destinado a Ilenar espacios en los organism os vivos. Pero, en realidad, el agua es una sustancia de gran reaccionabilidad. con propiedades poco Irecuentes, que la diferencian mucho, tanto Iisica como quimicamente, de la mayoria de los liquidos corrientes. Sabemos ahora que el agua y los productos de su ionizacion, los iones hidrogeno e hidroxilo, son factores iraportantes en la determinacion de la estructura y las propiedades bioloqicas de las proteinas, de los acidos nucleicos, asi como de las membranas, de los ribosomas y de otros muchos componentes celulares.

Propiedades fisicas y enlace de hidroqeno en el agua

El agua posee un punto de fusion, un punto de ebullicion, el calor de vaporizacion y el de fusion y la tension superficial. mas elevados que otros hidruros comparables, tales como el H2S 0 el NH3, 0 para el caso, que la mayor parte de los liquidos corrientes. Todas estas propiedades indican que en el agua las Iuerzas de atraccion entre las moleculas y, por tanto, su cohesion interna, son relativamente elevadas. Por ejemplo, la tabla 2~1 muestra que e1 calor de vaporizacion del agua es considerablemente mayor que el de cualquier otro de los liquidos corrientes de la lista. El calor de vaporizacion

. es una medida directa de la cantidad de energia necesaria para superar las Iuerzas de atraccion entre las moleculas adyacentes en un liquido, de modo que las moleculas individuales puedan separarse unas de otras y pasar al estado gaseoso.

Las potentes fuerzas intermoleculares en el agua Iiquida estan originadas por la distribucion especifica de los electrones en la molecula de agua (fig. 2~1). El atomo de oxigeno com parte un par de electrones con cada uno de los atomos de hidroqeno, por superposicion de los orbitales Is de los atomos de hidroqeno con los orbitales hibridos Sp3 del atomo de oxigeno. Mediante analisis espectroscopico y de rayos X se ha determinado el anqulo de enlace H~O-H, que es de 104,50 y la distancia interatomica media H~O que es

41

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

0.0965 nm (fig. 2~1). Esta disposicion de electrones en la molecula del agua le comunica asimetria electrica, El atomo de oxiqeno, mas electronegative. tiende a atraer los electrones no compartidos del atomo de hidroqeno, y deja desnudos los nucleos de hidroqeno. El resultado es que cada uno de los dos atomos de hidrogeno posee una carga local parcial positiva (designada por 8+). El atomo de oxiqeno, a su vez, posee una carga local parcial negativa (designada por 8-). situada en la zona de los orbitales no compartidos. Asi. aunque la molecula de agua no posee una carga neta, es un dipolo electrico.

Cuando dos moleculas de agua se aproximan mucho, se establece una atraccion electrostatica entre la carga parcial negativa situ ada sobre e1 atomo de oxigeno de la molecula de agua y la carga parcial positiva situada sobre un atomo de hidroqeno de una molecule de agua adyacente. Ello va acompafiado por una redlstribucion de las cargas electronicas en ambas moleculas, 10 cual exalta en gran medida su interaccion. Una union electrostatica compleja de esta clase se llama enlace de hidroqeno, Debido a la ordenacion casi tetraedrica de los electrones alrededor del atomo de oxiqeno, cada molecula de agua es potencialmente capaz de unirse mediante enlaces de hidroqeno con cuatro moleculas de agua vecinas (fig. 2~2). Esta propiedad es la responsable de la elevada cohesion interna del agua liquida.

Los enlaces de hidroqeno son relativamente debiles comparados con los enlaces covalentes. Se calcula que los enlaces de hidroqeno en el agua liquida poseen solamente una energia de enlace de unas 4.5 kcal mol:', en comparacion con las' 110 kcal mol! de los enlacesjcovalentes H-O de la molecula de agua (tenqase en cuenta que la energia de enlace es la energia necesaria para rom per un enlace). Otra propiedad importante de los enlaces de hidroqeno es que su fortaleza

FIGURA 2-2

(Abajo) Enlace tetreedrico de hidroqeno elrededor de una molecule de agua en

el hielo. Las molecules 1 y 2 y la molecule central se hallan en el plano del papel; la molecule 3 se halla

pot encima de el, y la molecule 4, detres del plano. (Derecha) Dteqreme esquemetico del teticulo de molecules de agua en el hielo,

42

FIGURA 2-1

Molecula de agua. El bosquejo del modelo espacial represenie el confin en

el que las etrecciones de van del' Waals esten equilibredes pot las [uerzes de repulsion. Se muestra mas abajo

un modelo cristalografico, 0 de bolas

y verilles, de la molecule de agua con el angulo de valencia y le longitud.

Radio de van der

Waals del atomo de hidroqeno = 0.12 nm -Longitud del enlace

covalente = 0.0965 nm

Radio de van der . Waals del atomo de oxigeno = 0.14 nm

Dlreccion del momenta dipolar

FIGURA 2-3

Caracrer direccionel de. los enlaces de hidroqeno, (Arriba) Cuando el enlace O-H es lineal respecto al Momo eceptor, el enlace de hidroqeno [ormedo tendre

la maxima estabilidad. (Abajo) Cuando

el oxigeno aceptor no se halla sobre el vector electrico del enlace O-H, se forma uri enlace de hidtoqeno mas debil.

H" ° I

!

/0"

° 7/ "H

/0"

Capitulo 2 EI agua

es maxima cuando los dos grupos que interaccionan se hallan orientados de modo que proporcionen el maximo de atraccion electrostatica (fig. 2~3). Tambien los enlaces de hidroqeno poseen una longitud de enlace caracteristica, la cual difiere de un tipo de enlace de hidroqeno a otro, que depende de la geometria estructural y de la distribucion electronica en las moleculas unidas. En el hielo, por ejemplo, todas las moleculas de agua se hallan unidas mediante enlaces de hidroqeno: la longitud del mencionado enlace es de 0,177 nm (fig. 2~2).

Estructura del agua liquida

El establecimiento de puentes de hidroqeno entre las moleculas de agua no sucede solamente en estado liquido, sino tarnbien en el hielo y en la fase de vapor. En la forma cristalina mas corriente del hielo, conocida como hielo I, cada molecula de agua se halla unida mediante enlaces de hidroqeno a exactamente las cuatro moleculas de agua mas proximas, constituyendo una red regular, y la distancia media oxiqeno-oxiqeno es de 0,276 nm. En el agua liquida cada molecula de agua a 0 °C se halla unida en cualquier momento dado, por termine medic, a otras 3,6 moleculas de agua; la distancia media oxiqeno-oxiqeno es solo ligeramente mayor que en el hielo, cerca de 0,29 nm a 15°C y 0,305 nm a 83°C. Se ha calculado, a partir del calor de fusion del hielo, que cuando este se funde para producir agua a 0 °C solamente se rompen el 10;% de los enlaces de hidroqeno del hielo. Asi el agua uquida presenta una ordenacion considerable en un radio pe~ queiio aunque esta estructuracion no se extiende a gran distancia. El agua liquida esta aun altamente ligada por puentes de hidroqeno a 100 "C, como se desprende de sus altos calor de vaporizacion y constante dielectrica.

La pequefia diferencia que existe entre el agua liquida y el hielo en cuanto a la proporcion de enlaces de hidroqeno puede parecer sorprendente si se considera la rigidez del hielo y la fluidez del agua. Parte de la explicacion reside en la muy elevada velocidad con que se forman y se escinden los enlaces de hidroqeno en el agua liquida. Aunque en un instante dado la mayor parte de las moleculas del agua liquida se hallan unidas mediante enlaces de hidroqeno, la vida media de cada uno de los enlaces de hidroqeno es solamente de 10-11 S. La estructura de corto radio del agua liquida es, por tanto, estadistica, ya que es promediada tanto en el espacio como en el tiempo. Por consiguiente el agua liquida, a la vez que es fluida, se halla tambien altamente dotada de enlaces de hidroqeno.

Se han propuesto muchos modelos para la estructura del agua liquida, aunque ninguno de ellos ha sido comprobado experimentalmente. Los modelos mas sencillos sugieren que el agua liquida esta constituida por agrupaciones de moleculas de agua semejantes al hielo, en equilibrio labil con moleculas de agua libres. Otros modelos proponen que el agua liquida contiene tres 0 mas tipos de componentes unidos por enlaces de hidroqeno. Un nuevo tipo, el modelo continuo, suqiere que aunque la gran mayoria de los enlaces de hidroqeno existentes entre las moleculas de aguaen el hielo a 0 °C permanecen sin romperse cuando se funde el hielo, experimentan, sin embargo, distorsiones; es decir, propenden a diferentes anqulos desde la confiquracion lineal mas estable mostrada en la fi-

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

gura 2~3. Cuanto mayor es la temperatura del agua Iiquida, mayor es la dis torsion y la inestabilidad. En este modele, las propiedades individuales de vida corta de las moleculas de agua, aunque poseen estas gran proporcion de enlaces de hidroqeno, se desvian siqnificativamente de la estructura reticular cristalina del hielo. Esta claro que la prosecucion de las investigaciones acerca de la estructura del agua liquida sera del mayor Significado para la bioquimica y la biologia molecular.

Otras propiedades de los enlaces de hidroqeno

Los enlaces de hidroqeno no se presentan solamente en el agua. Tienden a formarse entre cualquier atomo electronegativo como el oxigeno, el nitroqeno 0 el fluor, y un atomo de hidroqeno unido covalentemente a otro atomo electroneqativo. Los enlaces de hidroqeno pueden formarse entre dos moleculas 0 entre dos partes de una misma molecula. En la figura 2A aparecen algunos ejemplos de enlaces de hidroqeno biologicamente importantes.

Cuando dos moleculas estan unidas por un solo enlace de hidroqeno, el enlace sera muy debil en un sistema acuoso porque las moleculas de agua circundantes competiran para formar enlaces de hidroqeno con las moleculas de soluto. No obstante, cuando resulta posible el establecimiento de dos 0 mas enlaces de hidroqeno entre dos moleculas de soluto, por razones geometricas el establecimiento del primer enlace de hidroqeno incrementa grandemente la posibilidad de que se forme el segundo. Una vez se ha establecido este, se incre-menta la probabilidad de que se forme un tercero, y asi sucesivamente, conduciendo a una" asociacion muy fuerte entre las dos moleculas de soluto, las cuales pueden superar los efectos de competencia de las moleculas del agua. La intensificacion de la Iuerza de at rae cion entre dos moleculas por la cooperacion de muchos enlaces debiles se llama cooperetioided.

El enlace de hidroqeno cooperative es una caracteristica exhibida tanto por las proteinas (pag. 132) como por los acidos nucleicos (pag. 877), cuyas moleculas pueden contener docenas, centenares y aun millares de enlaces de hidrogeno cooperativos. La cooperatividad del enlace de hidroqeno en las macromolecules bioloqicas depende de las posiciones relativas de los grupos funcionales capaces de Iormar enlaces de hidrogeno. Es algo parecido a la construccion de una escalera. Una vez se han colocado uno 0 dos travesaiios en su lugar, de modo que las guias laterales se hallen alineadas, el resto de los travesaiios puede fijarse rapidamente.

Los enlaces de hidroqeno se forman y se rompen mucho mas rapidamente en los sistemas acuosos que la mayor parte de los enlaces covalentes. Este hecho, junto con su especificidad geometrica y su caracter direccional, proporciona a los enlaces de hidroqeno una gran ventaja bioloqica sobre los enlaces covalentes en los Ienomenos biomoleculares que deben producirse a velocidades muy elevadas, tales como el pleqamiento de las proteinas en sus con formaciones nativas (paginas 146 y 147).

Propiedades disolventes del agua

El agua es un disolvente mucho mejor que la mayor parte de los Iiquidos corrientes. Muchas sales cristalizadas y otros

FIGURA 2-4

Algunos enlaces de hidr6geno de importancia biol6gica.

Entre un grupo hldroxilo y H20

Entre un grupo carbonilo y H20

Entre dos cadenas peptidicas

R" /R' C

II

o

Ii

I

0"

H

R R

I I

~CH" /C~ C H

II

o

I'I

I

»<. H /N" »<.

C C

I II

R 0

Entre pares

de bases H

compiementarias I

en el DNA <, /C"'" /CH.

N C

I I

C C

0-:::" 'N./ ""0

I H

Timina

H

: I

H" ./N"" ./N-H C """c

II I

N" -:::"C,

C N

\ 1/

N-CH

/

Adenina

TABLA 2-2. Constantes dlelectricas de algunos liquidos a 20°C.

Liquido D
Agua 80
Metanol 33
Etanol 24
Acetona 21.4
Benceno 2.3
Hexano 1.9 FIGURA 2-5

Formecion de una micela de jab6n en agua. Las cadenas no poleres del oleato sodico se oculten al agua, mienires que los grupos cerboxilo, cerqedos neqetivemente, se hal/an expuestos.

Cabeza [-0 0

polar "C-f'

/ CH,

"CH / ' CH,

"CH / '

C~,

/CH2 CH, "CH II /CH CH, "CH / 2

CH,

"CH / ' CH,

-,

/CH,

CH2

"CH3

no polar

Simbolismo

r Cabeza

Cadena

Cadena

Oleato sodico

Micela de oleato sodico

Capitulo 2 El agua

compuestos ionicos se disuelven con facilidad en el agua, mientras son casi insolubles en los liquidos no polares, tales como el cloroformo 0 el benceno. Puesto que la red cristalina de las sales, por ejemplo el cloruro sodico, se mantiene unida mediante fuertes atracciones electrostaticas entre iones positivos e iones negativos alternantes, se necesita de una energia considerable para separar a estos iones unos de otros. El agua disuelve, no obstante, el cloruro sodico cristalizado, gracias a las fuertes atracciones electrostaticas entre los dipolos del agua y los iones Na' y Cl, que forman los iones hidratados correspondientes, muy estables, y superan con ello la tendencia de los iones Nat y Cl- a atraerse mutuamente.

El agua tiende tambien a oponerse a la atraccion electrostatica entre los iones positivos y negativos. Esta tendencia. viene expresada por la constante dielectrice, D, definida por la relacion

en laque F es la fuerza de atraccion entre dos iones de carga opuesta, el Y ~ son las cargas de los iones y t es la distancia entre ellos. Como puede verse en la tabla 2~2. el agua posee una con stante dielectrica relativamente alta y la correspondiente al benceno es muy pequefia. Las fuerzas de atraccion en el agua entre los iones Nat y Cl': a una determinada distan cia, son solamente un catorceavo de las que mostrarian en el benceno; es un factor que favorece mucho la disolucion de la red cristalina por el agua.

Una amplia segunda clase d,,:! sustancias que se disuelven en el agua con Iacilidad, comprende compuestos no ionicos pero de caracter polar, tales como los azucares, los alcoholes sencillos, los aldehidos y las cetonas. Su solubilidad se debe a la tendencia de las moleculas de agua a establecer enlaces de hidrogeno con grupos funcionales polares, tales como los grupos hidroxilo de los azucares y de los alcoholes y el atomo de oxigeno del grupo carbonilo de los aldehidos y de las cetonas (fig. 2~4).

Interacciones hidrof6bicas

El agua tambien dispersa 0 solubiliza forman do micelas a muchos compuestos que contienen grupos simultaneos, Iuertemente no polares y grupos fuertemente polares. Tales moleculas reciben eI nombre de an[ipitticas.

Un ejemplo sencillo de biomolecula anfipatica que tiende a formar micelas es la sal sodica del itcido oleico, acido graso de cadena larga. Esta molecula posee un solo grupo carboxilo, que es polar y tiende por ello a hidratarse con Iacilidad, y una larga cola hidrocarbonada, que es no polar e intrinsecamente insoluble en el agua. Debido a su larga cola hidrofobica. el oleato sodico (un jabon ) tiene muy poca tendencia a disolverse en eI agua en forma de una disolucion molecular verdadera. Se dispersa en ella con facilidad, sin embargo, con formacion de micelas en las que los grupos carboxilo neqativamente cargados se haIIan expuestos a la fase acuosa y los grupos no polares permanecen ocultos dentro de la estructura micelar (fig. 2~5). Las micelas de jabon poseen una carga negativa neta y permanecen en suspension debido a sus mu-

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

tuas repulsiones de naturaleza electrostatica. Tales micelas, que pueden contener centenares y aun millares de moleculas de jabon, se forman espontaneamente ya que el agua «pre~ Here» al agua (y tamhien a los grupos carboxilo) mas que a las estructuras no polares. En el interior de las micelas las interacciones de Van der Waals' aport an fuerzas de atraccion adicionales entre las estructuras hidrocarbonadas adyacentes.

Debe resaltarse que no existe un enlace estequiometrico verdadero entre los grupos hidrocarbonados de una micela. Por dicha razon resulta mas apropiado emplear el termino interaccion hidrofobica que el de «enlace hidrojobico», para reterlrse a Ia asociacion de las porciones hidrofobicas de las moleculas anfipaticas. En comparaci6n con los enlaces de hidr6geno, las interacciones hidrofobicas poseen poco caracter direccional, pero tienden a producir sistemas de e1evada estabilidad.

Como veremos mas adelante, otros muchos componentes celulares son tambien anfipaticos y tienden a Iormar estructuras en las que las partes no polares, hidrofobicas, se hallan ocultas al agua, especialmente en las proteinas y en los acidos nucleicos (pag. 145) y en los lipidos polares (pag. 294).

Efecto de los solutos sobre las propiedades del agua

La presencia de solutos disue1tos provoca cambios en la estructura y en las propiedades del agua liquida. Por ejemplo, cuando una sal tal como NaCl se disuelve en el agua, los iones Na+ y Cl, se hallan redeados de una cap a de dipolo del agua. Estos iones hidratados poseen una geometria algo diferente de las agrupaciones de moleculas de agua unidas mediante enlaces de hidr6geno; su ordenacion superior y de estructura es mas regular. La tabla 2~3 muestra las distancias interi6nicas medias en disoluciones acuosas de NaCl en funci6n de la concentracion de la sal. Observamos que cuando la concentraci6n de NaCl es 0,15 M, que es la concentraci6n aproximada del NaCI en el plasma sanguineo (y la de sales de K+ en el citoplasma celular ) los iones Nat y CI- tienen por termino medio una separaci6n de 1,9 nm solamente. Puesto que cada ion Na" y Cl hidratado posee un diametro de 0,5 a 0,7 nm y un agrupamiento tetraedrico de cinco moleculas de agua tiene un diametro de aproximadamente 0,5 nm, esta claro que debe haber un cambio considerable en la estructura tridimensional y en las propiedades del agua liquida cuando se disuelve NaCI en ella a la con centra cion aproximada con que se encuentra en los fluidos biol6gicos. Las sales disueltas tienden, por tanto, a «romper» la estructura normal del agua liquida.

EI efecto de un soluto sobre el disolvente se maniflesta en otro conjunto de propiedades, a saber, las propiedades coli~ gativas de las disoluciones, las cuales dependen del numero de particulas del soluto por unidad de volumen del disolvente. Los solutos producen efectos caracteristicos en el disolvente tales como el descenso del punto de conqelacion, la elevaci6n del punto de ebullici6n y la disminuci6n de la presi6n de vapor. Confieren tarnbien a la disoluci6n la propiedad de la presion osmotica. EI peso molecular gramo de un soluto ideal, no asociado ni disociado, no volatil disuelto en 1000 9 de

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TABLA 2-3. Distancias interi6nicas medias en disoluciones de NaCI.

Concenirecion, M Distencie, nm

0.001 9,4

0.010 4.4

0.10 2,0

0.150 1,9

1.00 0,94

FIGURA 2-6

Forma hidratada del ion hidronio (H,O.+). La capa de hidretecion es estable a 100°C.

Tj\BLA 2-4. Movilidad electrica de algunos cationes a diluci6n infinita (25°C).

Ion Movilidad. em' V-I S-I

H+ Na+ K+ NH.+ Mg'+ Li+

36,3 X 10-' 5,2 X 10-4 7,6 X 10-' 7,6 X 10-4 5,4 X 10-4 4,0 X 10-'

FIGURA 2-7

Saltos ptotonicos. Las [leches curvadas muestran el camino seguido por los protones en saltos sucesivos desde un ion hidronio a una molecule de agua.

En el agua liquide los saltos se producen al azar en el espacio; en el hielo se producen junto a los enlaces de hidroqeno, La ultima molecule H20 (en color) se transform a en lin ion hidronio al final

de la serie de saltos.

Capitulo 2 El agua

agua a la presion de 760 mm de mercurio, provoca un descenso del punto de conqelacion de 1,86 °C y eleva el punto de ebullicion en 0,543 °C. Tal disolucion muestra tambien una presion osmotica de 22,4 atmosferas en un aparato apropiado (cap. 7). Puesto que las disoluciones acuosas se desvian habitualmente de modo considerable del comportamiento ideal, las relaciones mencionadas solo son cuantitativas a dilucion infinita; es decir, por extrapolacion a con centra cion cero del soluto.

Ionizaci6n del agua

A causa de la pequefia masa del atomo de hidroqeno, y dado que su iinico electron se halla fuertemente retenido por el atomo de oxigeno, hay una tendencia limitada del ion de hidroqeno a disociarse del atomo de oxigeno al que se halla unido covalentemente en una molecula de agua y a «saltar» al atomo de oxigeno de la molecula de agua adyacente a la cual se halla unido por enlace de hidroqeno, supuesto que la energia interna de cada molecula sea favorable

En esta reaccion se producen el ion hidronio (H30+) y el ion hidroxilo (OH-). En un litro de agua pura, a 25oC, en un momenta dado existen solamente 1,0 X 10-7 mol de iones H30+ y una cantidad igual de iones OH-, sequn muestran las medidas de conductividad electrica.

Aunque par convene ion , se emplea el simbolo H+, con objeto de abreviar, debe recalcarse que en el agua no existen protones «desnudos» 0 iones hidroqeno, en cantidad siqnificativa; se hallan solamente en forma hidratada. El propio ion hidronio, H30+, se hidrata posteriormente, por Iormacion de enlaces de hidroqeno adicionales con e1 agua para formar H904+, asi como formasde hidratacion mas elevada (fig. 2~6). El ion hidroxilo se halla tambien hidratado en el agua liquida.

Vemos en la tabla 2A que la velocidad de emiqracion aparente de los iones H30+ en un campo electrico es muchas veces superior a la de los cationes univalentes Na+ 0 K+. Esta anomalia es debida a que un proton puede saltar muy rapidamente desde un ion hidronio hasta una molecula de agua vecina, a la que se une par enlace de hidr6geno. Asi, una carga electrica positiva puede desplazarse una determinada distancia desde una molecula de agua a otra con poco movimiento de las propias moleculas de agua. Una serie de tales saltos protonicos tiene el efecto de translocalizar los protones a una velocidad que es mucho mayor que la velocidad de difusi6n, a movimiento global de los iones H30+ por si mismos (fig. 2~7). Los saltos protonicos a 10 largo de las moleculas de agua inmovilizadas en la red cristalina del hielo son los responsables de que el hielo, a pesar de su rigida estructura, posea casi la misma conductividad electrica que el agua liquida. La conducci6n de protones a traves de las moleculas de agua unidas por enlace de hidroqeno, llamada efecta timet puede ser un Ienomeno importante en los sistemas bioloqicos.

47

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Producto i6nico del agua: escala de pH

La disolucion ionic a del agua es un proceso de equilibrio:

para el cual podemos escribir la constante de equilibrio

en las que los corchetes indican las concentraciones en moles por litro. La magnitud de esta constante de equilibrio, a cualquier temperatura dada, puede calcularse a partir de las medidas de conductividad del agua destilada. Puesto que la concentracion del agua, en el agua pura, es muy elevada (es igual al mimero de gram os de agua en un litro divididos por el peso molecular gramo, 0 sea 1000/18 = 55,5 M) y la concentra cion de iones H+ y OH- es muy pequefia (1 X 10-7 M a 25°C) la concentracion molar del agua no cambia siqnificativamente por su ligerisima ionizacion. La constante de equilibro puede simplificarse a la ex presion siguiente:

y el termino 55,5 X Keq puede sustituirse por una constante «global» Kw, Hamada producto i6nico del agua,

El valor de K; a 15°C es de 1,0 X 10-14• En una disolucion acida ila con centra cion H+ es relativamente elevada y la de OH- correspondiente baja; en una disolucion basica la situacion se invierte.

El producto ionico del agua, Kw, constituye la base para la escala de pH (tabla 2~5), que es un medio de designar la concentracion real de iones H+ (y por tanto de iones OH-) en cualquier disolucion acuosa en el intervalo de acidez entre las concentraciones 1,0 M de H+ y 1,0 M de OH-. La escala de pH fue ideada por el bioquimico danes S. P. L. Serensen como medio de evitar mimeros engorrosos tales como 0,0000001 0 1.0 X 10-7 para expresar las bajas concentraciones de ion hidroqeno de los fluidos bioloqicos. Definio el termino pH como

En una disolucion neutra a 25°C

[W] = [OH-] = 1,0 X 10-7 M

El pH de tal disolucion es

1

pH= log 1 X 10-7 = 7,0

El valor de 7,0 para el pH de una disolucion exactamente neutra no es, por tanto, una cifra escogida de manera arbitraria; deriva del valor absoluto del producto ionico del agua a 25°C. Resulta muy importante observar que la escala de

48

TABLA 2-5. Escala de pH.
[H+] [OH-]
(M) pH (M)
1.0 0 10-14
0,1 I 10-13
0,01 2 10-12
0,001 3 10-11
0,0001 4 10-1•
0,00001 5 10-'
10-' 6 10-'
10-7 7 10-7
10-' 8 10'"
10-' 9 10-'
10-1• 10 10""
10-11 II 0,001
10-12 12 0,01
10-13 13 0,1
10-14 14 1.0 TABLA 2-6. pH de algunos Iluidos.

Fluido

pH

Agua de mar (dlversas] Plasma sanguineo Fluido intersticial Fluidos intracelulares

Musculo Higado

J ugo gastrico Jugo pancreiitico Saliva

Leche de vaca Orlna

Zumo de tomate Zumo de pomelo Refresco a base de cola Zumo de limon

7,0-7,5 7,4

7,4

6,1

6,9 1.2-3,0 7,8-8,0 6,35-6,85 6,6

5,8

4,3

3,2

2,8

2,3

FIGURA 2-8

Pares conjugados ecido-besicos del ecido ecetico, del ion amenia y del agua.

Dador de protones

Aceptor de protones

Capitulo 2 El agua

pH es logaritmica. Decir que dos disoluciones difieren en su pH en una unidad siqnifica que una disoluci6n posee una concentraci6n de iones hidr6geno diez veces superior a la de la otra. La tabla 2~6 muestra el pH de algunos fluidos.

Medida del pH

La determinacion del pH es uno de los procedimientos analiticos mas importantes y mas utilizados en bioquimica, ya que el pH determina much as caracteristicas notables de la estructura y la actividad de las macromoleculas bioloqicas v, por tanto, de la conducta de las celulas y de los organismos. El patron primario para la medida de las concentraciones del ion hidrogeno (y por tanto del pH) es el electrodo de hidroqeno. Es este un electro do de platino tratado especialmente y que se sumerge en la disolucion cuyo pH se va a medir. La disolucion se hall a en equilibrio con el hidroqeno gaseoso a una presion y una temperatura conocidas. La Iuerza electromotriz en el electrode responde al equilibrio

H2 :;:==:: 2H+ + 2e-

Se mide la diferencia de potencial entre el electrode de hidrogeno y un electrode de referencia de conocida fern (p. ej., un electrode de. calomelanos}, y se utiliza para calcular la concentracion de ion H+.

El electrode de hidroqeno resulta demasiado engorroso para un empleo general y se ha sustituido por el electrode de oidrio, que es directamente sensible a la concentracion de ion H+, en ausencia de hidroqeno gaseoso. "La respuesta del electro do de vidrio debe calibrarse frente a tampones de pH conocido con precision. Otro metodo de medir el pH se basa en el empleo de indicadores acido-basicos (vease mas adelante).

Acidos y bases

Las definiciones mas generales y concisas de acidos y bases, aplicables a disolventes no acuosos y tambien a los sistemas acuosos, son las de G. N. Lewis. Un acido de Lewis es un aceptor de pares electronicos potencial, y una base de Lewis es una sustancia que puede actuar como dadora de pares elec~ tronicos. El formalismo introducido por J. N. Bronstecl y T. M. Lowry es utilizado mas ampliamente en la descripcion de las reacciones acido-basicas en sistemas acuosos diluidos. De acuerdo con los conceptos de Bronsted-Lowry, un acido es un dador de protones y una base un aceptor de proto~ nes (fig. 2~8). Una reaccion acido-basica comprencle siempre un par ecido-besico conjaqedo, constituido por un dador de protones y el correspondiente aceptor de protones. Por ejemplo, el acido acetico (CHyCOOH) y el anion acetate (CH3~COO-) forman un par conjugado acido-basico.

La ecuacion para la disociacion 0 ionizacion de un acido (HA) en disolucion acuosa diluida implica la transferencia de un proton desde el acido al agua, la cual puede actuar como aceptor del proton y forma el acido H30+:

Cada base conjugada posee una afinidad caracteristica para su proton; los que muestran una afinidad elevada por el pro-

49

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

ton son acidos debiles y solo se disocian muy ligeramente; los que muestran una afinidad pequefia son acidos fuertes y pierden iones H+ con facilidad. La tendencia de cualqUler acido a disociarse viene dada por su constante de disociacion. Para el acido HA la constante de clisociacion a una temperatura determinada es

_ [W][A-] K - [HA][H20]

en la que los corchetes indican las concentraciones expresadas en moles por litro. Es una convencion el simplificar la expresion eliminando el agua que se precis a para la hid rata cion del proton:

[WJ[A-l K= [HAl

Constituye tambien una convencion, en bioquimica, emplear las constantes de disociacion basadas en la medida analitica de las concentraciones de los reactivos y de los productos, en unas determinadas condiciones experimentales: es decir, para una con centra cion total y fuerza ionica determinadas y especificando los demas solutos. Esta constante recibe el nombre de constante de disociacion aparente y se designa por K', para distinguirla de la verdadera constante de disociacicn K, 0 constante de disodacion termodinamica empleada por los quimico~£isicos, la cual esta corregida para la desviacion del sistema de la conducta ideal provocada por factores tales como la concentracion y la fuerza ionica.

Las constantes de disociacion aparentes de algunos acidos y bases figuran en la tabla 2~7. Observese que, en la Formulacion de Bronsted-Lowry, los acidos y las bases son tratados de modo semejante, es decir, unicamente representando la tendencia de los protones a disociarse de las especies dadoras de protones. (Las llamadas constantes basicas de disociacion, tales como Ki, para la disociacion del NH40H ~ NHt + OH-, no se emplean. En realidad, seqiin la Iorrnulacion de Bronsted-Lowry, el NH40H no es ni un acido ni una base.) La tabla 2~7 contiene tambien los valores

TABLA 2-7. Constante de disociaci6n aparente y p1{' de algunos acidos (25°C).

Acido K'
(dador de ptotones] (M) pK'
HCOOH 1.78 X 10-' 3,75
CH,COOH 1.74 X 10-5 4.76
CH,CH,COOH 1.35 X 10-5 4,87
[acido propi6nico)
CH,CHOHCOOH 1.38 X 10-4 3.86
[acido Iactlco)
COOHCH,CH,COOH 6,16 X 10-5 4.21
(actdo succinico)
COOHCH,CH,COO- 2.34 X 10-' 5.63
H,PO, 7.25 X 10-3 2.14
H,PO,- 6.31 X 10-' 7,20
HPO/- 3.98 X 10-13 12.4
H,C03 1,70 X 10-' 3.77
HC03- 6.31 X 10-11 10,2
NH/ 5.62 X 10-1• 9,25
CH3NH,+ 2.46 X 10-11 10.6
50 Capitulo 2 El agua

para la expresion pK', que es una transformacion logaritmica de K', del mismo modo que el termino pH es una transfermacion logaritmica de [H+]:

pK' = log ~, = -log K'

Los valores de pK' son menos engorrosos de manipulacion que los valores de K', 10 mismo que ocurre con los valores de pH y las molaridades reales del ion hidroqeno. Los acidos Iuertes poseen valores bajos de pK' y las bases fuertes muestran valores elevados de pK'. Observese que el agua misma puede considerarse como un acido muy debil cuyo pK' es de alrededor de 14; su base conjugada, el ion hidroxilo, es obviamente una base muy fuerte que muestra una afinidad elevada por el proton.

La figura 2~9 muestra las curvas de valoracion de algunos acidos debiles valorados con hidroxido sodico. EI pH resultante despues de cada incremento de NaOH, durante la valo-

FIGURA 2-9

(Derecha) Curves de la valoraci6n acido-basica mostrendo las ptincipeles especies ionices en el comienzo, en el punta medio y al final de la valoraci6n. (Abajo) Capacidad relativa de tamponamiento expresada [rente al pH. La cepecided maxima de tamponamiento tiene lugar cuando pH = pK', donde

se produce una veriecion minima del pH el siiedir una cantidad detetminede

de ecido 0 de base.

9

Punto medic de lavaloraci6n

8

::r:: 7 0.

6

5

4

3

2

1

0,5 Equlvalentes deOH-------i>-

1,0

Acetato

Fosfato

Amonio

Capacidad reI at iva

de tamponamiento

51

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

racion de un acido, se expresa frente a los equivalentes de OH- afiadidos. Las form as de tales curvas de valoraci6n son muy semejantes para todos los acidos: la diferencia importante es que las curvas se hallan desplazadas verticalmente a 10 largo de la escala de pH. El valor del pH en el punto medio de la valoraci6n es numericamente igual al valor del pIC del acido valorado. En el punto medio se hallan presentes concentraciones equimolares de la especie dadora de protones (HA) y de la aceptora de protones (A-). El pK' de un acido puede calcularse, en realidad, a partir del pH en cualquier punto de la curva de valoraci6n del acido, siempre que se conozcan las concentraciones de las especies dadoras y acep~ toras de protones en dlcho punto. La forma de la curva de valoraci6n puede expresarse por la ecuaci6n de HendersonHesselbelch, que es una transformaci6n logaritmica de la expresi6n para la constante de disociaci6n. Se obtiene como se indica a continuaci6n:

, _ [WJ[A-] K - [HA]

Despejando [H+]:

y tomando el logaritmo negativo de ambos miembros

[HA] -log[W] =-llilgK'-log [A-]

Sustituyendo -log [H+] par pH y -log K' por pK'

PH = pK' - log [HA] [A-]

Si cambiamos ahora los signos, obtenemos la ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch :

pH = pK' + log [A-] [HA]

cuya forma mas general es la siguiente

I [aceptor de prot ones ]

pH= pK' + og ]

[dador de protones

Esta ecuaci6n permite el calculo del valor del pK' de cualquier acido, conociendo la relaci6n molar de las especies dadoras y aceptoras de protones, a un pH determinado; permite tambien el calculo del pH de un par conjugado acido-basico que posea un determinado pK' y una relaci6n molar dada asimismo permite el calculo de la relaci6n molar del acido y su base conjugada si se conocen los correspondientes valores de pH y pK'. Observese que cuando las concentraciones del dador y del aceptor de protones son iguales, el pH observado es numericamente igual al pK'. La ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch es fundamental para el tratamiento cuantitativo de todos los equilibrios acido-base en los sistemas biol6gicos.

52

Capitulo 2 El agua

Indicadores acido- basicos

El pH de una disolucion puede determinarse mediante el empleo de colorantes indicadores, la mayor parte de los cuales son acidos debiles (se designan como HInd). Tales indicadores se disocian de acuerdo con el equilibrio

HInd ~ H+ + Ind :

Supongamos que la especie HInd es incolora y que la especie Ind es coloreada. La posicion de equilibrio de esta disociacion y, por tanto, la cantidad de luz absorbida por la especie Ind a su longitud de onda caracteristica, es determinada por la concentracion de hidroqeno del medio. En una disolucion fuertemente acida, el equilibrio se desplaza hacia la izquierda y se absorbera poca luz a la longitud de onda del maximo de absorcion de Ind. En una disolucion basica, la especie Ind= se halla favorecida, ya que el exceso de iones OH- reacciona con los iones H+ para formar agua, impulsando el equilibrio hacia Ind. En este caso se absorbera mucha luz.

Tampones

Puede observarse en la Figura 2~9 que la curva de val ora cion de cada acido presenta una zona relativamente llana que se extiende alrededor de una unidad de pH a cada lado de su punto medio. En esta zona el pH del sistema cambia relativamente poco cuando se ana den cantidades mas bien pequefias de iones H+ 0 OH-. Esta ~s la zona en que el par conjugado acido-base actua como famp6n; es decir, un sistema que tiende a impedir el cambio de pH cuando se afiaden iones H+ 0 OH-. Para valores de pH fuera de esta zona hay menos capacidad para resistir los cambios de pH. La capacidad de tamponamiento es maxima en el mismo punto medio de la curva de valoracion, es decir, cuando la concentracion de aceptor de protones se iguala con la de dador de protones, en la cual se cum ple que pH = pK' (fig. 2~9). La capacidad de tamponamiento disminuye a medida que aumenta el pH o desciende, respecto a dicho pun to, como consecuencia directa del cambio en la relacion entre las especies aceptora y dadora de protones. Cada par conjugado acido-basico posee un pH caracteristico en el cual su capacidad de tamponamiento es maxima, a saber, el punto en que pH = pK'.

Los fluidos intracelulares y extracelulares de los orqanismos vivos contienen pares conjugados acido-basicos, los cuales actuan como tamp ones al pH normal de dichos fluidos. EI tampon intracelular mas importante es el par conjugado acidobasico H2P04- ~HPOi- (pK' ~ 7,2). Los fosfatos orqanicos, tales como la glucosa-6-fosfato y el ATP, contribuyen tarnbien a Ia capacidad de tamponamiento en Ia celula. EI principal tampon extracelular en la sangre y en los fluidos intersticiales de los vertebrados es el sistema tampon del bicarbonato. La extraordinaria capacidad de tamponamiento del plasrna sanguineo puede mostrarse por la siguiente comparacion. Si se afiade 1 ml de HCI10 N all de suero Hsioloqico neutro (aproximadamente 0,15 M en NaCI), el pH de la disolucion salina descenders hasta pH 2, ya que las disoluciones de NaCl no poseen capacidad de tamponamiento. Sin embargo,

53

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

si se afiade 1 ml de HCl 10 N all de plasma sanguineo, el pH solo descendera un poco, desde 7,4 a, aproximadamente, 7,2.

EI sistema tampon del bicarbonato (H2C03- HC03-) posee algunos rasgos distintivos. Mientras actua como tampon, del mismo modo que otros pares conjugados acido-basicos. el pK' del H2COJ, que es un acido relativamente Iuerte, es de 3,8, (tabla 2~7), mucho mas bajo que el intervalo de pH nor", mal de la sangre. Se plantea la cuestion de como un acido con un valor de pK' tan bajo es capaz de desempefiar el papel de tampon fisioloqico a un pH proximo a 7,0. En el sistema tampon del bicarbonato la especie dadora de protones, el acido carbonico se halla en equilibrio reversible con el CO2 disuelto:

Si tal sistema acuoso esta en contacto con una fase gaseosa, entonces el anhidrido carbonico disuelto se hallara, a su vez, en equilibrio entre la fase gaseosa y la acuosa:

Puesto que por la ley de Henry la solubilidad de un gas en' agua es proporcional a su presion parcial, el pH del sistema tampon constituido por el bicarbonato es fun cion de la presion parcial del CO2 en la fase gaseosa situada sobre la disolucion tampon. Si aumenta la presion del CO2 permaneciendo constantes las demas variables, el pH del tampon bicarbonato disminuye, y viceversa. El si'stema tampon del bicarbonato puede regular con eficacia en las proximidades de pH = 7, en el cual la relacion aceptor de protones I dador de protones es muy elevada, dado que una pequefia cantidad del dador, el H2C:OJ se halla en equilibrio inestable con una capacidad de reserva relativamente grande de gas carbonico en los pulmones. Bajo cualesquiera condiciones en que la sangre deba absorber un exceso de iones OH-, el H2C03 empleado y convertido en HC03- es rapidamente reemplazado por el CO2 gaseoso del gran «pool» pulmonar.

El rasgo distintivo del sistema tampon del bicarbonato 10 constituye que el CO2 sea el producto final de la combustion aerobia de las moleculas combustibles en los vertebrados, que se expulsa en ultimo termino por los pulmones. La relacion [HC03-]/[H2C03] en el estado estacionario, en la sangre, constituye un reflejo de la velocidad de produccion de CO2 durante la oxidacion en los tejidos y de la velocidad de perdid a de gas carbonico por espiracion.

El pH del plasma sanguineo en los vertebrados se mantiene a valores notablemente constantes. El plasma sanquineo del hombre suele ser de 7,40. Si fallasen los mecanismos reguladores del pH, como puede ocurrir en las enferrnedades, el pH de la sangre descenderia por debajo de pH = 7 a se elevaria por encima de 7,8 y podrian producirse dafios irreparables, Podemos preguntarnos: [Que mecanismos moleculares existentes en las celulas son tan extraordinariamente sensibles que un cambio en la concentracion de iones H+ tan pequefio como 3 X 10-B M (aproximadamente la diferencia entre que la sangre se halle a pH 7,4 y pH 7) pueda ser letal? Aunque muchos aspectos de la estructura celular y de la fun cion se

54

FIGURA 2-10

B/ecto del pH sobre la actividad de alguno& enzima&. Cada enzima posee una curve caracteri&tica de actividad en /uncian del pH. La in/luencia del pH puede meniiesterse no solemente en el grado de ionizacian de los enzima&, sino tembien en el de los coenzimas y en

el de las molecules de sustrato.

Pepsina 100

Ureasa Gllcina-oxidasa

1 Z 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH

Capitulo 2 Bl agua

hallan influidos por el p'H, la actividad catalitica de los enzimas es especialmente sensible. Las curvas tipicas que aparecen en la Figura 2~ 10 muestran que los enzimas ejercen su actividad maxima a un pH caracteristico, llamado pH 6ptimo, y que su actividad desciende de manera notoria a ambos lados de dicho maximo. De este modo. el control bioloqico del pH de las celulas y de los fluidos corporales es de importancia primordial en todos los aspectos del metabolismo intermediario y de la Iuncion celular.

Idoneidad del entorno acuoso para los organismos vivos

Los organismos vivos se han adaptado efectivamente a su entorno acuoso y han desarrollado metodos para aprovechar las inusitadas propiedades del agua. El eleva do calor especifico del agua resulta util para los grandes animales terrestres porque el agua del cuerpo actua como un tampon termico y permite que la temperatura del organismo permanezca relativamente con stante aunque varie la temperatura ambiente. Ade-. mas. el elevado calor de -vaporizacion del agua constituye el medio eficaz por el que los vertebrados pierden calor por evaporacion del sudor. EI elevado grade de cohesion interna del agua liquida, a causa de la existencia de enlaces de hidrogeno. es explotado por las plantas superiores para el transporte de los elementos nutritivos en disolucion, desde las rakes hasta las hojas, durante el proceso de transpiracion. Incluso el hecho de que el hielo tenqa una densidad menor que la del agua liquida y por ello nota. posee importantes consecuencias biol6gicas en la ecologia de los organismos acuaticos. Pero 10 mas fundamental para todos los organismos vivos es el hecho de que muchas propiedades biol6gicas importantes de las macromoleculas celulares, particularrnente de las proteinas y de los acidos nucleicos, derivan de sus interacciones con las moleculas de agua del medic que las rodea, tal como veremos mas adelante,

Resumen

EI agua es el compuesto mas abundante en los organismos vivos. Sus relativamente elevados puntos de fusion. de ebullicion, calor de vaporizaclon y tension superficial, son el resultado de fuertes atracciones intermoleculares en forma de puentes de hidroqeno entre moleculas de agua vecinas. EI agua liquid a posee una considerable ordenacion de corto radio. aunque los enlaces de hidroqeno Individuales poseen una Vida media muy corta.

La polaridad y las propiedades para establecer enlaces de hidroqeno de la rnolecula de agua hacen de ella un disolvente poderoso para muchos compuestos ionicos y moleculas neutras. EI agua tambien dispersa las rnoleculas anfipaticas, tales como los jabones, formando micelas, que son agrupaciones de moleculas en que los grupos hidrofobicos se hallan ocultos, no expuestos al agua, mientras los grupos hidrohlicos 0 polares se sittian sobre la superficie externa y expuestos al agua. La forrnacion de micelas es resultado de la tendencia de las mole cui as de agua del entorno a establecer el numero maximo de enlaces de hidroqeno entre ell as y con los grupos pol ares localizados en el exterior.

EI agua se ioniza muy ligeramente, formando los iones hidronio (H,O+) e hidroxilo (OH-). Los protones pueden saltar con facilldad desde el H,O+ a una molecula de H20 de la vecindad, unida por enlace de hidroqeno. Los saltos de los protones permiten interpretar la elevada movilidad electric a de los protones en el agua y en el hielo. En disoluciones acuosas diluidas las concentraciones de los iones H+ y OH- se

55

PARTE

COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

hallan relacionadas de modo Inverse. mediante la expresi6n K; = [H+] [OH-j = I X 10-" (25 °C). La concentracion de hidrogeniones de los sistemas bioloqicos se expresa en Funcion del pH. que se define como: pH = -log [H"], EI pH de las disoluciones acuosas se mide por medio del electrodo de vidrio 0 con indicadores.

Los acidos se definen como dadores de protones y las bases como aceptores de protones. Un par conjugado acido-basico esta constituido por un dador de protones (HA) y su correspondiente aceptor (A-). La tendencia de un acido, HA. a ceder protones se expresa por su constante de disociaci6n K' 0 mediante la funcion pK', definida como -log K'. E1 pH de una disolucion de un acido debil se halla relacionado cuantitativamente con su pK' y con la relaci6n de las concentraciones de sus especies dadoras y aceptoras de protones mediante la ecuacion de HendersonHasselbalch. Un par conjugado acido-basico puede actuar como tampon y resistir a los cambios de pH; su capacidad para lograrlo es maxima cuando el valor del pH es numericamente igual al de su pK'. Los pares bioloqicos mas importantes que actuan como tampones biol6gicosson H,COJ-HCOJ- y H,PO,--HPOl-. La actividad catalitica de los enzimas resulta fuertemente influida por el pH.

Bibliografia

En el apendice B Figura una bibliografia general de trabajos en bioquimica y quimica-fisica,

Libros

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Estructura, propiedades, movimiento y control del agua celular.

EDSALL. l- T •• Y ]. WYMAN: Biophysical Chemistry. vol. 1. Academic Press Inc .• Nueva York. 1958. Tratamiento detail ado del agua y de las disoluciones de electrolitos. incluidos los aminoacidos.

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MORRIS. ]. G.: A Bioloqist's Physical Chemistry, Addison-Wesley. Reading.

Mass., 1968. Excelente compendio; los capitulos 5 y 6 son especialmente utiles.

SEGEL. I. H.: Biochemical Calculations, John Wiley & Sons. Nueva York. 1968. Otro libro util sobre aspectos cuantitativos de la bioquimica.

Articulos

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WICKE. E.: «Structure. Formation and Molecular Mobility in Water and Aqueous Solutions». en AngelL'. Chern. Intern. Ed. (Ingles). 5, 106-112. 1966.

Problemas

Con objeto de hacer practica se plantea un gran numero de problemas sobre relaciones acido-base y disoluciones tampon. fundament ales para muchas operaciones de investiqacion bioquimica.

56

Capitulo 2 EI agua

1. Calculese :

a) EI pH del HCI 10-5 N.

b) EI pOH del NaOH 5 X 10-3 N.

c) EI pH del KOH 3 X 10-6 N.

d) EI pH del HCI 10-9 N.

e) EI pOH del HCI 3 X 10-4 N.

f) EI pH del H,S04 7 mM.

2. Calculense las concentraciones siguientes (vease tabla 2-6):

a) [H+] del plasma sanguineo.

b) [H+] del Iluido muscular intracelular.

c) [OH-] del juga de tomate.

d) [W] del juga qastrico (pH 1.4).

e) [OH-] de la saliva (pH 6.5).

f) [H+] del agua del mar.

3. EI pH de una disolucion 0.01 M de un acido, HA. es 3.80. Calculese: a) K'; b) pK' del acido.

4. EI grado de disociacion, a, de un acido HA, est a definido por la relacion

a = [A ] + [HA]

Calculese el grado de disociacion del acido acetico (pK' = 4,76) si su concentracion es a) 0.1 M y b) 0,01 M, suponiendo que HA no disminuye apreciablemente por la disociacion.

5. Dernuestrese que el grado de disociacion puede expresarse tambien por

K'

a= K' + [W]

6. Calculese el grado de disociacion del acido acetico si a) el pH es 3,0, b) pH 4,0 y c) pH 4,76.

7. Las rnedidas de conductividad muestran que la disolucion 0,1 M de acido propionico (CH3CH,COOH) se halla ionizada en 1,16 por ciento a 25 "C. Calculese a) la constante de dlsociacion y b) el pK' del acido propionico.

8. a) Calctilese la relacion [HC03-] / [H,CO'] en el plasma san-

guineo a pH 7,4 [vease tabla 2-7).

b) Calctilese Ia relacion [HPO.'-] ! [H,P04-] en el plasma sanguineo.

c) lCual de ambos pares acido-base conjugados es el tampon mas eficaz en una muestra de sangre contenida en un frasco cerrado sin espacio gaseoso libre alguno?

9. EI pH interne de una celula muscular es 6,8. Calculese la relacion [H,P04-] ! [HPOl-] en la celula. La segunda constante de disociacion del acido fosforico es 6.31 X 10-8 M.

10. a) lQue volumen de HCI O,to N debe afiadirse a 20,0 ml de tampon fosfato 0,04 M de pl-l 6.50, que contiene ureasa, con objeto de disminuir su actividad enztrnatica exactamente en el 50 %, cuando se ensaya en condiciones tales en las que el pH es el factor Iimitante de la velocidad? b) lCual sera la concentracion de ion-hidroqeno en tal disolucion? (Utilicense los datos de la fig. 2-10 y despreciese la capacidad de tamponamiento de Ia ureasa},

11. Calctilese a) el pH y b) la concentracion de iones CO,'- en una disolucion 0,01 M de H,C03•

12. Basandose en la respuesta que se de al problema 11. forrnulese una qeneralizaclon relacionando la concentracion de los iones A'- con el pK', para los acidos del tipo H,A.

13. Se dispone de disolucion 0,1 N de NaOH y disoluciones 0,1 N de acido sulfurico. acido acetlco (pK' = 4,76), acido lactico (pK' = 3,86), acido fosforico (pK' = 7,2) y de c1oruro amonico (pK' = 9,25).

a) Suponiendo que las disoluciones anteriores se emplean sin dilucion por adicion de aqua, lcomo se prepararian 50 ml de un rnedio tamponado que mantuviese el pH esencialmente constante a 5,40, en un experimento enzimatlco en el que se produzca acido?

57

CAPfTULO

FIGURA 3-1

Cristales de citocromo c de caballo, proteina que acnia en el trensporte de electrones.

E. Margoliash

3

Las proteinas

y sus funciones bioleglcas: perspectiva

En este capitulo haremos un estudio en perspectiva de la naturaleza qui mica y la biologia de las proteinas. Nuestro proposito es proporcionar una orientacion en este complejo campo y definir algunos terminos y conceptos esenciales, como preparacion para el tratamiento mucho mas detallado de la estructura y fun cion de las proteinas que se desarrolla en los capitulos 4 a 9.

Las proteinas son las moleculas orqanicas mas abundantes en las celulas, constituyendo el 50 por ciento 0 mas de su peso seco. Se encuentran en todas las partes de cada celula, ya que son fundamentales en todos los aspectos de la estructura y fun cion celulares. Existen muchas c1ases de proteinas diferentes, cada una de elIas especializada en una funcion bioloqica diferente. Ademas la informacion genetica es expresada en su mayor parte por las proteinas. Por esta razon debemos examinar tambien la naturaleza general de la relacion qenetica entre el acido desoxirribonuc1eico y la estructura de las proteinas, asi como el efecto de las mutaciones sobre la estructura proteica. La estructura de las moleculas de proteina, asi como su relacion con su fun cion bioloqica y actividad constituyen problemas centrales de la bioquimica actual.

Composicion de las proteinas

Se han aislado centenares de proteinas diferentes en forma pura y cristalina (fig. 3-1 ). Todas elIas contienen carbone, hidroqeno, nitroqeno y oxigeno, mientras que casi todas contienen azufre. Las hay que contienen algunos elementos adicionales, particularmente fosforo, hierro, cine y cobre. Los pesos moleculares de las proteinas son muy elevados, pero por hidrolisis acida, las moleculas proteicas dan una serie de compuestos orqanicos sencillos de bajo peso molecular; son los a-aminoecidos (figs. 1-3 y 3-2), que difieren entre si en la estructura de sus grupos R 0 cadenas laterales. Por 10 comun, solamente se encuentran 20 la-aminoacidos distintos como sillares de las proteinas (cap. 4).

En las moleculas proteicas los sucesivos restos aminoacidos se hallan unidos covalentemente entre si forman do largos polimeros no ramificados. Estan unidos en una ordenacion de cabeza a cola mediante unas uniones amida sustituidas llama ...

59

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

das enlaces~idicos, (fig. 3~2) producidas por eliminaci6n de los elementos del agua entre el grupo carboxilo de un aminoacido y el grupo a~amino del siguiente. Estas macromoleculas, que reciben el nombre de polipeptidos, pueden contener centenares de unidades de aminoacidos. Cas cadenas polipeptidicas de las proteinas no son, sin embargo, polirneros al azar, de longitud indefinida, cada cadena polipeptidica posee una especifica composicion quimica, un peso molecular y una secuencia ordenada de sus aminoacidos estructurales y una forma tridimensional (cap. 5).

Las proteinas se dividen en dos clases principales basandose en su composicion: proteinas simples y proteinas conjugadas. Las proteinas simples son aquellas que por hidrolisis producen solamente aminoacidos, sin ninqun otro producto principal, orqanico 0 inorqanico. Contienen habitualmente 50% de carbono, 7 % de hidroqeno, 23 % de oxigeno, 16 % de nitroqeno y de 0 a 3 % de azufre. Las proteinas conjuga~ das son aquellas que por hidrolisis producen no solamente aminoacidos, sino tambien otros componentes orqanicos 0 inorganicos. La porcion no arninoacida de una proteina conjugada se denomina 9!upo prostetico. Las proteinas conjuqadas pueden clasificarse de acuerdo con la naturaleza quimica de sus gru~ pos prosteticos (tabla 3~ 1 ). De este modo tenemos nucleo~ protein as y lipoprotein as, las cuales contienen acidos nucleicos y lipidos, respectivamente, asi como [osioproteines, metalopro~ teinas y glucoproteinas.

Tamaiio de las molecules proteicas

Los pesos moleculares de las proteinas muy puras pueden determinarse empleando metodos fisicos que se describiran mas adelante. En la tabla 3~2 se consignan algunos valores caracteristicos; oscilan desde 5000, que es el mas bajo, fijado arbitrariamente, hasta por encima de 1 000 000. Aun entre las proteinas que desempefian el mismo tipo de funcion no se pueden establecer generalizaciones sobre el tamafio. Diferentes enzimas. por ejemplo, poseen pesos moleculares que varian desde 12 000 a mas de 1 millen. EI limite superior del pesomolecular de las proteinas solo puede ser establecido arbitrariamente, ya que depende de la definicion de los terminos proteina y molecula, como verernos mas adelante.

La tabla 3~2 muestra tambien que much as proteinas que poseen pesos moleculares superiores a 36 000 contienen dos 0 mas cadenas polipeptidicas. Las cadenas polipeptidicas individuales de la mayor parte de las proteinas de estructura conocida contienen de 100 a 300 restos aminoacidos (Pm 12 000 a 36 000), Las cadenas polipeptidicas sencillas de ribonucleese. de citocromo c y de mioqlobine, que se encuentran entre 1isproteinas pequefias mejor conocidas, contienen entre 100 y 155 restos arninoacidos. Sin embargo, algunas proteinas poseen cadenas mucho mas largas, tales como la seroalbumina (aproximadamente 550 restos) y la miosina (aproximadarnente 1800 restos).

Conformaci6n de las proteinas

Cada tipo de molecula proteica posee en su estado nativo una forma tridimensional caracteristica que es conocida como su <:C!!!_[otTrla.ci6n, (en el cap, 6 se define con mayor exactitud).

60

FIGURA 3-2

Aminoacidos, sus grupos R y estruciure de los peptidos,

Formula estructurel general de los a-eminoecidos hallados en las proteines. La porcion sombreada es comtin a todos los emtnoecidos, los grupos R son diferentes.

Grupos R de algunos eminoecides reptesentetivos. Las estructures de los eminoecidos de las proteines pueden verse en las paginas 75 a 77.

Grupo R

Nombre del arninoacldo

H - Glicocola CH3 - Alanina HOCH2- Serina

C)- CH2- Fenilalanina

Estructure de un tetrepeptido.

Extremo amino terminal

HO

-CH,D

Extremo carboxiloterminal

Glicilalanilserilfenilalanina

o

Capitulo 3 Las ptoteines y sus [unciones bioloqices: perspective

TABLA 3-1. Algunas proteinas conjugadas.

Clase

Grupo ptostetico

Porcentaje aproximado en peso

Sistemas nucleoproteinicos Ribosornas

Virus mosaico del tabaco

Lipoproteines ,8,-Lipoproteinas

del plasma

Glucoproteines

'1-Globulinas

Orosomueoide del plasma

Fosfoproteinas Caseina (leehe)

Hemoproteines Hemoglobina Citocromo c Catalasa

Fleooproteines Succlnatc-deshidroqenasa D:- Aminoacido-oxidasa

M etelproteines

Ferritina Cttocromo-oxtdasa Aleohol-deshidrogenasa Xantinoxidasa

RNA RNA

Fosfolipidos, colesterol, Iipidos neutros

Hexosamina. gaiactosa, rnanosa, acido sialico Galactosa, manosa,

N -acetilq alactosamina, acido Nsaceulneuramtnlco

Fosfato estertficado a restos de serina

Ferroprotoporfirina Ferroprotoporfirma Ferroprotoporfirina

Flavln-nucleotido Flavtn-nucleottdo

Fe(OH), Fe y Cu Zn

Mo y Fe

50-60 5

79

2

40

4 4 3.1

2 2

23 0.3 0.3 0,4

TABLA 3-2. Pesos moleculares de algunas proteinas .

Protefna

cedenes

molecular

Peso N." de

Insulina (bovina)

Ribonucleasa (pancreas bovino) Lisozima (clara de huevo) Mioglobina (corazon de caballo) Outmotripstnoqeno (pancreas bovino) ,8-Laetoglobulina (bovina) Hemoglobina (humana)

Hexoquinasa (levadura) Trtptofano-sintetasa (E. coli) Aspartato-transcarbarnilasa (E. coli) Gluc6geno-fosforilasa (higado buey) Glutamlna-smtetasa (E. coli)

Complejo de la plruvato-deshidroqenasa (rifi6n de buey)

Virus rnosaico del tabaeo

5700 12600 13900 16900 23200 35000 64 500

102000 159000 310000 370000 592 000

7000000 40000000

2 1 1 1 1 2 4 2 4

12 4 12

160 2130

Las proteinas pueden clasificarse en dos clases principales, segtin su conformaci6n (fig. 3~3). Las proteinas_j_iJzrosas se hallan constituidas por cadenas polipeptidicas ordenadas de modo paralelo a 10 largo de un eje, formando fibras 0 laminas largas. Son materiales Iisicamente resistentes, insolubles en el agua 0 en las disoluciones salinas diluidas, Las proteinas Iibrosas son los elementos basicos estructurales en el tejido conjuntivo de los animales superiores, tales como el c,_(Jl?J1~n.(! (pag. 137) de los tendones y la matriz de los huesos, la a:SLll_e_:

61

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

ratina [paq. 128) del cabello, cuerno, cuero. ufias y plumas. y la elastina del tejido conjuntivo elastico.

Las proteinas globulares, por otra parte. estan constituidas por cadenas polipeptidicas plegadas estrechamente de modo que adoptan formas esfericas 0 globulares compactas (fig. 3~3). La mayor parte de las proteinas globulares son solubles en los sistemas acuosos. Generalmente desempefian una funcion movil 0 dinamica en la celula. De los casi dos millares de en~ zimas diferentes conocidos hasta ahora casi todos son proteinas globulares. como tambien 10 son los anticuerpos, alqunas hormonas y muchas proteinas que desempefian una fun cion de transporte, tales como la seroalbumina y la hemoglobina. Algunas proteinas se hallan situadas entre los tipos fibroso y globular. pareciendose a las proteinas fibrosas por sus largas estructuras cilindricas, y a las proteinas globulares. por ser solubles en las disoluciones acuosas salinas. Se encuentran entre ellas la miosine, elemento estructural importante del musculo, y el iibrinogeno, precursor de 1a fibrina, elemento estructura1 de los coaqulos sanguineos.

Los terminos especificos empleados corrientemente para designar los diferentes aspectos 0 niveles de la estructura proteica (fig. 3~3) se definiran de un modo mas completo y preciso en el capitulo 5. El terrnino estructura primar'ia se refiere al esqueleto covalente de la cadena polipeptidica. y establece de modo especifico la secuencia de sus restos aminoacidos. La estructura secunda!1ia se refiere a la ordenaci6n regular y pe~ riodica en el espacio de las cadenas polipeptidicas a 10 largo de una direcci6n. La estructura secundaria es sobre todo evidente en las proteinas fibrosas, en las que las cadenas polipeptidicas poseen una conformaci6n extendida 0 arrollada Ionqitudinalmente: 10 mismo ocurre en seqmentos de cadenas polipeptidicas de las proteinas globulares. El termino estructura terciaria se refiere al modo como la cadena polipeptidica se curva 0 se pliega para formar la estructura estrechamente plegada y compacta de las proteinas globulares (fig. 3~3). EI termino estructura cuaternaria pone de manifiesto c6mo se disponen en e1 espacio las cadenas individuales polipeptidicas de una proteina que posee mas de una cadena. La mayor parte de las grandes proteinas, ya sean fibrosas 0 globulares. contienen dos 0 mas cadenas polipeptidicas, entre las cuales pueden no existir enlaces covalentes (fig. 3~3). EI termino mas general de conjormecion, se emplea para referirse a la estructura combinada secundaria, terciaria y cuaternaria de una proteina. (Cap. 6).

Las proteinas con dos 0 mas cadenas polipeptidicas se conocen por el nombre de proteinas oligomericas y sus cadenas componentes se llaman subunidades 0 protometos, Un ejemplo bien conocido de proteina oliqomerica es la hemoglobina, pigmento respiratorio de los eritrocitos de la sangre. que esta constituido por cuatro cadenas polipeptidicas acopladas Intimamente, formando un conjunto globular compacto de considerable estabilidad a pesar de la carencia de enlaces covalentes entre elIas. Las proteinas oliqomericas contienen habitualmente un numero par de cadenas polipeptidicas, que pueden ser identicas 0 diferir en longitud 0 secuencia aminoacida, En las subunidades de las proteinas oliqomericas mas pequefias, puede haber desde dos a doce cadenas.

Puesto que las proteinas oliqomericas contienen dos 0 mas

62

PIGURA 3-3

Pmteinas [ibroses y globulares.

Protein a Iibrosas

Capitulo 3 Las protein as y sus [unciones bioloqicesi perspective

Esqueleto de la cadena polipeptidica en una proteine fibrosa tipica,

la a-queretine. El termino estructura secundaria se refiere a las ordenaciones arrolladas 0 en zig-zag de la cadena polipeptidica a 10 largo de una dimension.

Ovillo a-helicoidal

Superenrollamiento de ovillos a-helicoid ales formando cuerdas

Proteinas globulares

La cadena polipeptidica se halla plegada en una forma globular compacta Ilamada estructura terciaria. Los tramos cortos de la cadena polipeptidica de proteina globular pueden tener tembiett estructura secundaria helicoidal 0 en zig-zag. En las proteinas oliqomerices la ordenecion empaquetada tridimensional de las cadenas polipeptidicas se conoce por el nombre de estructura cueternerie.

Estructura terciaria de proteina globular de una sola cadena

Estructura cuaternaria de proteina globular oligomeric a 0 de cadenas multiples.

63

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

cadenas polipeptidicas, que por 10 general no estan unidas covalentemente entre si, puede parecer impropio, 0 al menos ambiguo referirse a las proteinas oliqomericas como «moleculas», y hablar de su «peso molecular». Sin embargo, en muchas proteinas oliqomericas las cadenas Individuales se hallan tan estrechamente unidas que la particula completa se suele comportar en disolucion como una sola molecula. Ademas, todas las subunidades componentes de las proteinas oliqomericas son necesarias para su fun cion bioloqica,

Asociaciones supramoleculares de las proteinas

Algunas veces aparece en las' celulas un conjunto de molecuI as de proteina actuando conjuntamente, a modo de aqrupacion 0 de complejo que puede aislarse en forma homoqenea e incluso cristalina. Un ejemplo de aqrupacion de macromoleculas relacionadas funcionalmente, llamado agrupaci6n supra.~ molecular 0 complejo, es el complejo de la sintetasa de los acidos grasos, que contiene una molecula de cada uno de los siete enzimas dilerentes que se precisan para la biosintesis de los acidos grasos (paq. 672). Este complejo puede ser aislado de las celulas de levadura en forma homogenea (tabla 3~2). Los mayores complejos proteicos supramoleculares son los virus, complejos de proteinas y de acidos nucleicos: algunos virus contienen tambien lipidos e iones metalicos. El virusl del mosaico del tabaco (fig. 3~4), uno de los virus menores, posee un peso de particula de aproximadamente 40 millones, de los cuales alrededor del 5 por ciento, es decir 2 millones, estan constituidos por acido ribonucleico. Los restantes 38 millones son aportados por la porcion proteica, constituida por un as 2200 cadenas polipeptidicas identicas. Sin embargo, las particulas virales se comportan como estructuras aisladas homogeneas que poseen un peso molecular definido, debido a que sus subunidades componentes se haIIan empaquetadas muy intimamente.

Desnaturalizacion

Muchas moleculas proteicas solo retienen su actividad biologica dentro de una fluctuacion muy limitada de temperatura y de pH. La exposicion de proteinas solubles 0 globulares a pH extremes 0 a temperaturaselevadas, les hace experimentar un cambio conocido como desneturelizecion, el efecto mas visible del cual, consiste en un descenso de su solubilidad. Puesto que los enlaces quimicos covalentes del esqueleto peptidico de las proteinas no se rompen durante este tratamiento relativamente suave, se ha IIegado a la conclusion que la estructura primaria permanece intacta. La mayor parte de las proteinas globulares experimentan el proceso de desnaturalizacion cuando se calientan por encima de 60~70 °C. La formacion de un coaqulo insoluble blanco cuando se hierve la clara de huevo es un ejemplo comun de desnaturalizacion termica. La consecuencia mas siqnificativa de la desnaturalizacion es que las proteinas pierden su actividad bioloqica caracteristica. Por ejemplo, al calentar los enzimas se suele perder su capacidad catalitica.

La desnaturalizacion consiste en el desplegamiento de la

FIGURA 3-4

Porci6n de una perticule del virus del mosaico del tebeco, ordenaci6n supremolecular de -2200 cadenas polipeptidicas y una molecule de RNA.

FIGURA 3-5

Desnaturalizacion y renetureiizecion de una proteine globular. Despues que la cadena peptidice ha sido desplegada -pOl' acci6n del calor, poe exposici6n a un pH bajo 0 pot: tratamiento con urea-, con [recuencie se rep/iega esponteneemente

y adopta la forma nativa.

Forma nativa

Forma nativa

Arrollamiento al azar

Capitulo 3 Las ptoteines y sus [unciones bioloqices: perspective

estructura nativa plegada caracteristica de la cadena polipeptidica de las moleculas de las proteinas globulares (fig. 3~5). Cuando la agitaci6n termica provoca que la estructura nativa plegada se desarrolle 0 se distienda, originando una cadena libremente ondulada, la proteina pier de su actividad biol6gica. Aunque cada tipo de proteina posee una composici6n Hja de aminoacidos, asl como una determinada secuencia, establecida durante su biosintesis, la secuencia amino acid a no confiere directemente a la proteina su funci6n biol6gica 0 actividad. Sin embargo, veremos que la secuencia aminoacida determina en Ultimo extreme la actividad biol6gica de la proteina ya que de ella depende la conformaci6n nativa 0 estado de pleqamiento de la molecula proteica, gracias a las interacciones reciprocas entre las cadenas laterales de aminoacidos, asi como entre el disolvente y solutos. Esta conclusion es consecuencia del descubrimiento, de que la desnaturalizaci6n 0 desplegamiento de las proteinas nativas, que origina formas enroll ad as al azar, desprovistas de actividad bioloqica, no es un proceso irreversible como se creia. Se han observado muchos casos en que una molecula des pie gada recupera su forma nativa en el tubo de ensayo, en un proceso que recibe el nombre de renaturalizaci6n (fig. 3~5). Si la proteina desnaturalizada fuese un enzima, puede tambien recuperar su actividad catalitica por renaturalizaci6n, sin ninqun cambio en la especiIicidad de la reacci6n catalizada. Sin embargo, la renaturalizaci6n de una proteina desnaturalizada no desarrolla ninguna actividad bioloqica que no se hallase ya presente en la proteina original. Estos hechos indican, por tanto, que la secuencia de aminoacidos en la cadena polipeptidica contiene la informaci6n requerida para especificar su conformaci6n plegada nativa, y que esta conformaci6n nativa determina su actividad biol6gica (cap. 6).

Diversidad funcional de las protein as

Las proteinas poseen muy diversas funciones biol6gicas diferentes. La tabla 3~3 da algunos ejernplos representativos de los diferentes tipos de proteinas, cIasificados de acuerdo con su funci6n. Los enzimas representan la clase mas amplia. Se conocen cerca de dos millares de enzimas diferentes, cada uno de los cuales cataliza un tipo diferente de reacci6n quimica. Los enzimas poseen extraordinaria potencia catalitica, mucha mas que los catalizadores fabricados por el hombre. Son extraordinariamente especificos en su funci6n. El enzima hexoquinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde

. el trifosfato de adenosina (ATP) a la glucosa. siendo la primera etapa del metabolismo de la glucosa. Otros enzimas deshidrogenan moleculas de combustible. Y otras, como por ejemplo, el citocromo C, transfieren electrones hacia el oxigeno molecular durante la respiraci6n, 0 bien. como la DNA polimerasa y los enzimas activadores de aminoacid os, participan en la bicsintesis de los componentes celulares. Cada tipo de molecula de enzima tiene un centro activo al que se une su sustrato especifico durante el ciclo catalitico. Muchos enzimas contienen una sola cadena polipeptidica, pero en otras hay varias 0 muchas cadenas. Algunos enzimas se hallan mas especializados y desempeiian una funci6n regula dora adem as de su actividad catalitica: son los -llamados enzim as reguladores

65

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Tipos y ejemplos

TABLA 3-3. Claslftcaclon de las proteinas por su funcion bioloqica.

Locelizecion 0 [uncion

Enzimas

Hexoquinasa Lactato-deshidroqenasa Citocromo c DNA-polimerasa

Proteinas de teserue Ovoalbiimina Caseina

Ferritina

Gliadina

Ceina

Proteinas transportadoras Hemoglobina Hemocianina Mioglobina Seroalbumina !3,-Lipoproteina

Globulina que liga hierro Ceruloplasmina

Proteines contrectiles Miosina

Actina

Dlneina

Proteines protectores en la sangre de los vertebredos

Anticuerpos

Complemento

Fibrin6geno

Trombina

Toxinas

T oxina de Clostridium botulinum Toxina diftertca

Venenos de serpiente

Ricina

Gosipina

Hormonas Insulina

Hormona adrenocorticotr6pica Hormona del crecimiento

Proteinas estructureles Proteinas recubrimiento viral Gl ucoproteinas

a-Queratina

Esclerotina

Fibroina

Colaqeno

Elastina

Mucoproteinas

Fosforila glucosa Deshidrogena lactato Transfiere electrones Replica y repara DNA

Proteina de la clara de huevo Proteina de la leche

Reserva de hierro en el bazo Proteina de la sernilla de trig6 Proteina de la semilla de maiz

Transporta O2 en la sangre de los vertebrados Transporta 0, en la sangre de algunos invertebrados Transporta O2 en el musculo

Transporta '0 acidos grasos en la sangre

Transporta lipidos en la sangre

Transporta hierro en la sangre

Transporta Cu en la sangre

Filamentos estacionarios en las miofibrillas Filamentos m6viles en las miofibrillas Cilios y flagelos

Forman complejos con proteinas extrafias Complejos con algunos sistemas antiqeno-anticuerpo Precursor de la fibrina en la coagulaci6n sanguinea Componente del mecanismo de coagulaci6n

Origina envenenamiento bacteriano de los alimentos Toxina bacteriana

Enztrnas que hldrolizan los fosfoqliceridos Proteina t6xica de la semilla del ricino Protein a t6xica de la semilla del algod6n

Regula el metabolismo de la glucosa Regula la sintesis de corticosteroides Estimula el crecimiento de los huesos

Cubierta alrededor del cromosoma Recubrimientos celulares y paredes Piel, plumas, ufias, pezufias Exoesqueletos de los insectos

Seda de los capullos, telarafias

Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso, cartilago) Tejido conectivo elastico (ligamentos)

Secreciones mucosas, f1uido sinovial

o elostericos. Virtualmente, todos los enzimas son proteinas globulares. como se dijo ya anteriormente, Como los enzimas catalizan las reacciones quimicas constituye uno de los problemas principales de la bioquimica moderna.

Otra clase importante de proteinas desempefia la Iuncion de almacenar aminoacidos como elementos nutritivos y como sillares para el embri6n en crecimiento, por ejemplo, la ovoal~ himJina de la clara de huevo, la caseina de la leche y la glia~ dina de las semillas de trigo. --

Algunas proteinas desempefian una funci6n de transporte, para 10 cual son capaces de unirse y transportar tipos especificos de moleculas por la sangre. La seroelbiunine se une estrechamente a los acidos grasos libres, y de este modo trans-

66

Capitulo 3 Las ptoteines y sus [unciones biol6gicas: perspective

porta sus mole cul as entre el tejido adiposo y otros organos de los vertebrados. Las lipoproteinas del plasma sanguineo transportan lipidos entre el intestine. el higado y los tejidos adiposos (grasos). La hemoglobina de los eritrocitos de los vertebrados transporta oxigeno desde los pulmones a los tejidos; los invertebrados poseen otros tipos de moleculas proteicas transportadoras de oxigeno, tales como las hemocienines.

Otros tipos de proteinas actuan como elementos esenciales de los sistemas motiles y contractiles. La actina y la miosina son los dos elementos proteicos principales de los sistemas; contractiles del musculo: la actina es una proteina filamentosa, Iarqa, constituida por muchas cadenas globulares polipeptidicas y ordenada como una sarta de cuentas, y la miosina es una molecula semejante a una larga varilla cilindrica, constituida por dos cadenas polipeptidicas entrelazadas helicoidalmente. (cap. 27). En los musculos, estas proteinas estan ordenadas en disposiciones paralelas y se deslizan unas a 10 largo de las otras durante la contraccion,

Algunas proteinas desempefian una Iuncion protectora 0 de£ensiva. Las proteinas sanguineas trombina y [ibrinogeno participan en la coaqulacion de la sangre e impiden de este modo la perdida de sangre del sistema vascular de los vertebrados, pero las proteinas protectoras mas importantes son los anticuerpos 0 inmunoglobulinas las cuales se combinan con las proteinas extrafias y asi las neutralizan, 0 coil otros cuerpos que se han introducido en la sangre 0 en los tejidos de un vertebra do determinado. En realidad el estudio de los anticuerpos ha conducido a la conclusion de que cada especie de organismo posee su propio conjunto especifico de moleculas proteicas (pag. 114).

Las toxinas, 0 sea, sustancias que son extremadamente toxicas para los animales superiores en cantidades muy pequefias, representan otro grupo de proteinas, que incluye a la ricina de la semilla del ricino, a la gosipina de las semillas de alqodon, a la toxina difterica y a la toxina de la bacteria anaerobia Clostridium botulinum, que es responsable de alqunos tipos de envenenamiento por alimentos.

Entre las proteinas mas interesantes se hall an aquellas que actuan como hormonas, tales como la hormona del crecimiento 0 sometotropine, una hormona de la glandula pituitaria anterior. La insulin a, segregada por ciertas celulas especializadas del pancreas, es una hormona que regula el metabolismo de la glucosa; su deficiencia en el hombre provoca la enfermedad conocida como diabetes melitus.

Otra clase de proteinas comprende a las que actuan como elementos estructurales. En los vertebrados, la proteina Iibrosa coleqeno, es la principal proteina estructural extracelular en el tejido conectivo y en el hueso. Las fibrillas de colaqeno colaboran tambien en la Iormacion de un continuo estructural uniendo entre si grupos de celulas para formar un tejido. Otras dos proteinas de los vertebrados son la elastina, del tejido elastico amarillo, y la a-queretine, mencionada anteriormente. El cartilago contiene no solamente colaqeno sino tambien qlucoproteinss, que confieren propiedades lubricantes y deslizantes a las secreciones mucosas y al £luido sinovial de las articulaciones de los vertebrados.

Ademas de estas clases principales de proteinas, algunas otras tienen funciones poco habituales. Las arafias y los gu~

67

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

sanos de seda segregan una disoluci6n espesa de la protein a [ibroine. la cual se solidi fica rapidamente forman do un Filamento insoluble de fuerza tensil excepcional y que sirve para Iormar telarafias y capullos. La sangre de algunos peces que habitan en las aguas antarticas, a temperaturas inferiores a cero grados. contiene una proteina que impide la congelaci6n de la sangre. y que recibe, muy adecuadamente, el nombre de protein a «antieongelante». La monelina es una proteina de sabor dulce, encontrada en algunos frutos; cuando se desnaturaliza no conserva su sabor dulce.

Es extraordinario que todas las proteinas incluso las que ejercen efectos biol6gicos 0 t6xieos intensos, esten constituidas por los mismos 20 aminoacidos, los cuales por si mismos no poseen sino poco 0 ninqun efecto biol6gico y t6xieo. La conformaci6n tridimensional es la que confrere a cada proteina su actividad biol6gica especifica: la conformacion, por su parte. esta determinada por la secuencia especifica de los aminoacidos en sus cadenas polipepttdicas (cap. 6).

Anticuerpos y respuesta inmuner especificidad de especie de las proteinas

Entre la gran variedad de diferentes proteinas de los orqanismos vivos los enticuerpos 0 inmunoglobulinas han sido de la maxima importancia en la demostraci6n de que las proteinas son especificas de cada especie de organismo. Las moleculas de anticuerpo aparecen en el suero sanguineo y en ciertas celulas de un vertebra do en respuesta a la introducci6n de una protein a u otra macromolecula extrafia a aquella especie. Tal especie de macromolecula extrafia se denomina antigeno. Las moleculas del anticuerpo especifico, engendradas de este modo pueden combinarse con el antiqeno que indujo su formaci6n y constituir un complejo antigeno~anticuerpo. Esta reacci6n se llama respuesta inmunitaria y constituye la base de todo el campo de la inmunologia. La inmunidad frente a las enfermedades infecciosas puede conferirse, frecuentemente. inyectando cantidades muy pequefias de ciertos componentes macromoleculares (es decir, antigenos) del microorganismo 0 del virus causante. Un anticuerpo especifico 0 inmunoqlobulina se forma como respuesta al antigeno extrafio y puede persistir en la sangre durante mucho tiempo. Si el microorqanismo tuviera acceso a la sangre 0 la linfa en cualquier ocasi6n Iutura, los antieuerpos asi formados pueden neutralizar 0 inactivar al microorganismo al combinarse con sus componentes antiqenicos. La respuesta inmune aparece solamente en los vertebrados y constituye, por tanto. un producto bastante reciente de la evoluci6n biol6giea.

Las moleculas de anticuerpo poseen centres de uni6n que son especificos para las caracteristicas estructurales del antigeno que indujo su formaci6n y complementarios respecto a elIas. La molecula del anticuerpo posee dos centres de uni6n que hacen poslble la formaci6n de una red tridimensional de moleculas alternantes de antigeno y de antieuerpo; dado que en ultimo termino precipita del suero, recibe el nombre de precipitina (fig. 3~6). La estructura y el origen de las inmunoglobulinas se describen mas detalladamente en el capitulo 35.

Los antieuerpos son muy espectficos para las proteinas extrafias que inducen su formaci6n. Un anticuerpo de conejo,

68

FIGURA 3-6

R.eaccion entiqeno-enticuerpo. Los centres coloreados sobre el antigeno son los determinentes de la especijicided antigenic, Los centres coloreedos sobre la molecule del enticuerpo son estructurelmente complementarios con los centres determinenies del antigeno. HI enticuerpo es dioelenie pero el antigeno puede

set multivelente.

TABLA 3-4. Reaccionabilidad

de las seroalbuminas de diferentes especies con anticuerpo de conejo, frente a seroalbumina bovina.*

Especie Vaca Oveja Cerdo Gato Caballo Humana Hamster Rata perro Raton

Reaccionabilidad en el ensayo de la precipitine

(100) 76 32 25 16 15 15 14 14

9

* Datos de W. O. Weigle. [, Immunol., 88: 9 (1962).

Capitulo 3 Las proteines y sus [unciones biol6gicas: perspective

formado frente a albumina de huevo de gallina. por ejemplo, se combinara con la ultima. pero no con proteinas no relacionadas, como la hemoglobina humana. Tal anticuerpo es especifico para la estructura tridimensional de la albumin a de huevo de gallina. de modo que si este ultimo es calentado 0 desnaturalizado para desplegar sus cadenas polipeptidicas, 0 si es modificado quimicamente, el anticuerpo ya no se combinara con el.

La aplicacion de la reaccion, altamente especifica, antlqenoanticuerpo al estudio de divers as proteinas de diferentes especies de organismos ha permitido obtener cierto numero de conclusiones importantes. La primera es que proteinas Iuncionalmente diferentes de una misma especie conducen a la formacion de anticuerpos diferentes. Asi. cuando un conejo se inmuniza frente a hemoqlobina de caballo. los anticuerpos formados precipitaran la hemoglobina de caballo. pero no de cualquier otra proteina del caballo.

La segunda conclusion principial, con implicaciones biologicas de largo alcance, es que las proteinas homologas de especies diferentes no son identicas inmunologicamente. Son proteinas homoloqas aquellas que poseen funciones similares, tales como las hemoglobinas de distintas especies de vertebrados. Aunque las hemoglobinas de los diferentes mamiferos poseen la misma fun cion y aproximadamente el mismo peso molecular. y asi todas contienen cuatro atom os de hierro. cuatro anillos porfirinicos y cuatro cadenas peptidicas, no obstante. son moleculas inmunoloqicamente distintas. Los anticuerpos producidos por el conejo despues de la inmunizacion con hemoglobina de caballo. por ejemplo, reaccionan al maximo con hemoglobina de caballo pero son mucho menos activas con hemoglobinas de otros vertebrados.

Una tercera conclusion consiste en que la especificidad como anticuerpo refleja relaciones filoqeneticas. Las proteinas homoloqas de especies estrechamente relacionadas tienen una identidad mas aproximada que las de especies muy distintas (tabla 3A). ASi, aunque los anticuerpos formados por el conejo frente a la hemoglobina de caballo reaccionaran mejor con hemoglobina de caballo, tarnbien 10 haran con las hemoqlobinas de aquellas especies mas estrechamente relacionadas con el caballo. tales como la cebra, la vaca, el cerdoy otros ungu~ Iados, mientras que las hemoglobinas de roedores, pajaros y anfibios seran, con mucho, menos reactivas.

Las diferencias estructurales que existen entre las proteinas homolog as de las diferentes especies, que fueron reveladas en un principio por la reaccion antiqeno-anticuerpo, son resultado de diferencias entre sus secuencias aminoacidas (capitulo 5). Cuanto mas estrechamente relacionadas se hallen dos especies de organismos, tanto mas sernejantes son las secuencias aminoacidas de sus proteinas homoloqas (pag. 115).

Isomeria secuencial en las cadenas polipeptidicas

En paqinas anteriores calculabamos que el mimero total de clases diferentes de proteinas en todas las especies de orqanismos vivos es del orden de 1010 a 1012• LPuede construirse este enorme numero de proteinas diferentes, cada una con su secuencia aminoacida propia, a partir de solamente 20 aminoacidos distintos? Es posible contestar a esta pregunta par-

69

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

tiendo solo de consideraciones matematicas. En un dipeptide que contenga unicamente dos aminoacidos diferentes, A y B. son posibles dos isomeros secuenciales. a saber. A~B y B~A. En un tripeptide que contenga tres aminoacidos diferentes, son posibles seis ordenaciones distintas de la secuencia de los tres aminoacidos: A~B~C. A~C~B. B~A~C. B~C~A CA~B y C~B~A. En la teoria de las permutaciones. la expresion general para el numero de posibles ordenaciones secuenciales de objetos diferentes, viene dada por la expresion n! [factorial de n}, en la que n es el numero de objetos diferentes. Para un tetrapeptide que posea cuatro aminoacidos diferentes, 4! = 4 X 3 X 2 X 1 = 24 secuencias diferentes posibles. Para un polipeptido de 20 aminoacidos diferentes, en el que cada uno de los aminoacidos aparece una sola vez, el numero de ordenaciones secuenciales posibles es de 20!. es decir, 20 X 19 X 18 X 17 X 16 X .... la cual asciende a la sobrecogedora cifra de 2 X 1018• Pero se trata solamente de una pequefia cadena polipeptidica (peso molecular ~ 2600). y cada uno de los aminoacidos aparece una sola vez. St consideramos ahora una proteina de peso molecular 23 000 que contenga 12 aminoacidos diferentes en mimeros iguales. se ha calculado que son posibles unos 10300 isomeros secuenciales. Lo mismo que el alfabeto inqles de 26 letras puedeser ernpleado para confeccionar un numero enormemente grande de palabras escritas, asi los 20 aminoacidos diferentes pueden utilizarse para construir un numero casi ilimitado de proteinas distintas. Descifrar las secuencias aminoacidas de diferentes proteinas y relacionarlas con las propiedades y funciones de la proteina y con la Iiloqenetica del orqanismo, constituyen los objetivos principales de la bioquimica contemporanea.

Codificaci6n qenetica de las secuencias aminoacidas de las proteinas

Debido a que la estructura y funcion de las proteinas son en ultimo termino un reflejo "de su secuencia aminoacida, dificilmente podriamos discutir las proteinas y sus actividades bioloqicas sin poseer al menos un conocimiento rudimentario de la naturaleza de la relacion molecular entre genes y pro~ teinas. Estas relaciones, que se describiran mucho mas deta-, lladamente en la parte 4. proporcionan una vision penetrante en la bioquimica comparativa de las proteinas en las diferentes especies, y en la evolucion de las moleculas proteicas. La, informacion genetica esta contenida en el acido desoxirribonucleico (DNA). que es la macrornolecula informativa de los cromosomas. Esta informacion instruye a cada celula para producir un conjunto caracteristico de proteinas, de acuerdo con el axioma central de la genetica molecular; es decir: la informacion genetica circula en la direccion DNA ~ RNA ~ ~ proteina.

La secuencie aminoacida de la cadena polipeptidica de cada tipo de proteina es la que resulta especificada 0 codificada en ultimo termino por la secuencia de restos nucleotidicos en el acido desoxirribonucleico (DNA). El segmento de una molecula de DNA. especificando una cadena polipeptidica completa se llama cistr6n 0 gen. Cada aminoacido se halla codificado por tres restos nucleotidicos sucesivos en el DNA. con junto que se llama triplete codificador. Sin embargo. los

70

IIGURA 3-7

:olinealidad de las secuencies nucleotidicas 'el DNA y el mRNA y secuencie minoecide de las cadenas polipeptidices, os tripletes de las unidades nucleotidices n el DNA detetminen la secuencia de

as eminoecidos en las proteines

or formaci6n intermedin de RNA, el

ual posee tripletes nucleotidicos (codones) omplementarios con los del DNA.

.es letras simbolizan las diierentes bases omponentes de los restos nucleotidicos en 1 DNA y en el RNA. A, adenina;

" timina; G, guanina; C, citosina;

I, urscilo.

Cadena
polipeptidica
DNA mRNA Amino
Extremo 3' Extremo 5' terminal
I I I
G C
C G Arginina
A U I
I I
c G
C G Glicocola
T A I
I I
A U
T A Tirosma
G C I
I I
T A
G C Treonina
A U I
I I
A U
A U Fenilalanina
A U I
I I
c G
G C Alanina
G C I
I I
c G
A U Valin a
A U I
I I
A U
G C Serina
A U I
I I
Extremo 5' Extremo 3' Carboxilo
terminal Capitulo 3 Las ptoteines y sus [unciones biol6gicas: perspective

genes permanecen en los cromosomas normalmente y no actuan directamente como matrices de codificacion durante la biosintesis de las proteinas, la cual tiene lugar en los ribosomas. En su lugar, el mensaje genetico del gen se trans mite primero enzimaticamente para formar un tipo especifico de acido ribonucleico llamado RNA mensajero (mRNA), cuya secuencia nucleotidica es complementaria con la del DNA del gen. Los tripletes codificadores del mRNA. 0 codones, que son complementarios de los del DNA, actuan como matriz inmediata y proporcionan la informacion genetica que especifica la secuencia de los aminoacidos durante la biosintesis de proteina en los ribosomas.

La relaci6n codificadora entre la secuencia de los nucleotidos en el. DNA, en el RNA complementario y en la secuencia aminoacida de la cadena polipeptidica resultante aparece esquematicamente en la figura 3~7. La secuencia de los tripletes codificadores en el DNA se corresponde de un modo lineal 0 secuencial; es decir, es colineal con la secuencia aminoacida de la cadena polipeptidica a la cual codifica, gra~ cias a la actuaci6n intermedia del RNA como matriz.

Mutaciones

A veces un gen especifica a unaproteina determinada, experimenta un cambia quimico como resultado de una acci6n fisica, por ejemplo, rayos X, radiactividad 0 acci6n de algunos agentes quirnicos, de modo que una de las tres bases de un triplete codificador para un resto aminoacido, resulta alterada o se cambia; a veces puede verificarse la inserci6n de un nucleotide nuevo. Como resultado la secuencia continua normalo sin coma de los tripletes codificadores del RNA resulta alterada y produce una alteracion correspondiente en la secuencia nucleotidica del mRNA, la cual a su vez codifies una cadena polipeptidica alterada. En una cadena polipeptidica anormal pueden resultar sustituidos uno 0 varios aminoacidos de su secuencia especifica por otros, y por consiguiente puede resultar defectuosa para efectuar su fun cion bioloqica. EI estudio experimental de las proteinas alteradas mutacionalmente es de gran importancia, ya que, para ernpezar, puede revelar cuales son los restos aminoacidos de una cadena polipeptidica que son esenciales para la estructura y la Iuncion de una proteina (caps. 6 y 8).

Con este esbozo sobre la estructura y la biologia de las proteinas como orientacion, podemos ahora proceder a examinar la estructura de las proteinas mas detalladamente.

Resumen

Las protein as se hallan constituidas por una 0 varias cadenas polipeptidicas, cada una de las cuales posee muchos restos e-aminoactdos, unidos entre si covalentemente por enlaces peptidicos, Sus pesos moleculares varian desde alrededor de 5000 hasta 1 000000 6 mas. Todas las proteinas, independientemente de la funci6n que desernpefian 0 de la especie de origen, estan constituidas por un conjunto basico de 20 arninoacidos, ordenados en divers as secuencias especiflcas. Las proteinas simples producen por hidrolisis sola mente a-aminoacidos, en tanto que las protein as conjugadas contienen un metal 0 un grupo prostetico orqanico. Las proteinas se clasifican de acuerdo con su conformaci6n tridimensional. Las proteinas fibrosas aparecen en forma de cilindros 0 de laminas; pose en cadenas peptidicas paralelas y relativarnente extendidas. Son insolubles y

71

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

actuan como elementos estructurales. Las proteinas globulares poseen cadenas polipeptidicas con plegamiento compacto, y su forma es esferica 0 globular y desempefian funciones dinamicas,

La estructura primaria de una protein a es su secuencia aminoaclda especifica. La estructura secundaria es la constituida por la ordenacion extend ida 0 helicoidal de las cadenas polipeptidicas a 10 largo de un eje simple y prolong ado como en las proteinas fibrosas. La estructura terciaria se refiere al modo mediante el cual las cadenas polipeptidicas se pliegan para formar proteinas globulares. En las proteinas oliqomericas, que contienen dos 0 mas cadenas polipeptidicas, el termino «estructura cuaternaria» se refiere a la manera con que las cadenas individuales pollpeptidicas se agrupan conjuntamente. En ultimo terrnino, la secuencia aminoacida es la que determina la conformacion tridimensional de las moleculas de proteina. Las proteinas se desnaturalizan 0 despliegan sin que se rompa el enlace peptidico de su cadena fundamental por accion de valores de pH 0 de temperatura extremes, 0 de otros agentes. La desnaturallzacion determina que las proteinas pierdan su actividad biolagica; en ciertos casos, la desnaturalizaclon es totalmente reversible.

Las proteinas desempefian gran diversidad' de funciones: actuan como catalizadores, como elementos estructurales, en los sistemas contractiles, como reserva de elementos nutritivos y como vehiculos de transporte, y tambien actuan como hormonas y como elementos de proteccion. En esta ultima categoria se hall an las inmunoglobulinas 0 anticuerpos, formados por los vertebrados en respuesta a los antiqenos, es decir, a sustancias extrafias a las especies. Los estudios de especifictdad antiqeno-antlcuerpo han conducido a la conclusion de que las proteinas homolog as de especies diferentes son especiftcas de la especie. La secuencia aminoacida de una protein a queda especlficada durante su biosintesis por una secuencia colineal de tripletes consecutivos de mononucleotidos en la molecula del RNA. que. a su vez, es complementario de la secuencia nucleotidica en el DNA. EI segmento de DNA que codifica una cadena polipeptidica recibe el nombre de gen.

Bibliografia

Al final de los capitulos 4 a 9 se da bibliografia de aspectos mas especiHcos de la bloquimica de las protein as.

Libros

DAVIS. B. D.; R. DULBECCO; H. N. EISEN; H. C. GINSBERG. Y W. B. WOOD. JR.:

Principles of Microbiology and Immunology, 2." ed .• Harper & Row. Nueva York. 1973. Texto elemental que proporciona una vision excelente de la respuesta inmune y de la biologia de la reaccion antiqenoanticuerpo.

NEURATH. H.: The Proteins, 3.' ed .• vols. 1-4. Academic Press. Inc .• Nueva York. 1963-66. Amplia y autorizada monografia sobre las protein as.

WATSON. J. D.: The Molecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin.

Menlo Park. California. 1975. Descripcicn elemental del fundamento qenetico de la sintesis de proteinas.

72

CAPITULO

Los aminoacidos, sillares de las proteinas

Consideraremos ahora con alqun detalle las propiedades fisi ... cas y quimicas de los aminoacidos, ya que estes constituyen el alfabeto de la estructura proteica, y determinan muchas de las propiedades importantes de las proteinas. El primer aminoacido aislado de un hidrolizado de proteina fue la gli ...

,. .

cocola, obtenida en 1820 a partir de la gelatina por - Bracon ...

not. De los 20 arninoacidos que se. hallan corrientemente en las proteinas, el descubierto mas recientemente es la treonina, aislada por primera vez par W. C. Rose, en 1935, de un hidrolizado de fibrina. Ademas de los 20 aminoacidos hallados como sillares de las proteinas, otros m uchos aminoacidos presentes biol6gicamente desempefian otras Iunciones en las celulas.

Aunque mucha de la informacion importante sabre la estructura, sintesis. propiedades opticas y reacciones quimicas de los aminoacidos procede de investigaciones iniciales reali ... zadas hace muchos afios, la apreciaci6n completa del papel de los aminoacidos en lao determinacion de la conformacion de la proteina no se ha puesto de manifiesto hasta hace .dos

d~cadas. ~

. "." ."." " : :." .

Aminoacidos corrientes de las proteinas

La £igura 4--1 muestra la formula estructural general de los 20 a ... aminoacidos hallados corrientemente en las proteinas, llamados tambien aminoacidos corrientes. Excepto la prolina, todos eIlos tienen como denominadores comunes un grupo car ... boxilo Iibre y un grupo amino libre e insustituido en el atomo . de carbono a. Difieren entre 51 en la estructura de sus cadenas laterales distintivas, llamadas grupos R.

Se han propuesto varios metodos para clasificar 10'5 amino ... acidos sobre la base de sus grupos R. EI mas .siqnificativo se funda en la polaridad de los grupos R. Existen cuatro clases principales: 1) grupos R no polares 0 hidrofobos: 2) polares, pero sin carga: 3) grupos R con carga positiva, y 4) grupos R cargados negativamente (a pH 6,0 ... 7,0, quees la zona del pH intracelular). Dentro de cada clase existen considerables variaciones en el tamafio, la forma y las propiedades de los gru ... pos R. Veremos mas tarde que este modo . de clasificar los aminoacidos puede guardar relaci6n con los vocablos del cadi ...

FIGURA 4~1

Formula estructurel general de los a-eminoecidos hallados en las proteinas., La porcion sombreede es comiin para todos los eminoecidos.

. ·H·

I· R-C-COOH

I

. NH2

73

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

go genetico de los diferentes aminoacidos hallados en las pro~ teinas (pag. 974).

Los aminoacidos se suelen designar mediante simbolos de tres letras. Recientemente se ha adoptado tambien un con .. junto de simbolos de una letra para facilitar la comparacion de las secuencias aminoacidas de las proteinas homoloqas (tabla 4~1).

Aminoecidos con grupos R no polares 0 hidrojobicos

La Figura 4~2 muestra las formulas estructurales y los modelos espaciales de los ocho aminoacidos que contienen grupos R no polares, junto con sus simbolos. Esta familia contiene cinco aminoacidos con grupos R que son hidrocarburos alifaticos (la elenine, la leucine, la isoleucine, la valina y la prolina), dos con anillos arornaticos (la fenilalanina y eI triptofano) y uno que contiene azufre (Ia metionina). Como grupo estos aminoacidos son menos solubles en el agua que los aminoacidos con grupos R polares. El miembro menos hidrofobo de esta clase es la alanina, la cual se halla casi en la linea Ironteriza entre los aminoacidos no polares y los que poseen gru~ pos R polares (vease mas adelante).

La prolina se diferencia de todos los demas aminoacidos corrientes en que es en realidad un a~aminoacido; puede considerarse como un ,a~aminoacido cuyo grupo R es un sustituyente en el grupo amino.

Aminoacidos con grupos R polares sin carga

Estos aminoacidos (fig. 4~3) son relativamente mas solubles en el agua que los aminoacidos con grupos R no polares. Sus grupos R contienen grupos funcionales polares, neutros (sin carga) que pueden establecer enlaces de hidroqeno con el agua. La polaridad de la serine, la treonina y la tirosina se debe a sus grupos hidroxilo: la de la asparagina y la glutamina a sus grupos amidicos, y la de la cisteine a la presencia del grupo sulfhidrilo (- SH). La glicocola, termino fronterizo de este grupo. se claslfica, a veces, como un aminoacido no polar (vease mas arriba). pero su grupo R. que es un atomo de hidroqeno, es demasiado pequefio para que pueda influir en la elevada polaridad de los grupos a~amino y e-carboxtlo.

La asparagina y la glutamina son las amidas de los acidos aspartico y glutamico (vease mas abajo). a los que liberan Iacilmente por hidrolisis acida 0 basica. Los simbolos de tres letras Asx y Glx, 0 los de una letra B y Z. se emplean para designar la sum a de acido aspartico y asparagina y de acido glutamico y glutamina. respectivamente, cuando el contenido amidico no se conoce.

La cisteina y la tirosina poseen las funciones mas polares de esta clase de aminoacidos: a saber. los grupos tiol e hidroxilo Ienolico, respectivamente. Estos grupos tienden a perder protones por ionizacion mucho mas Iacilmente que los gru~ pos R de otros aminoacidos de esta clase, aunque est an muy poco ionizados a pH 7.0. La cisteina se encuentra con Irecuencia en las proteinas en su forma oxidada, la cistine, en la que los grupos tiol de dos moleculas de cisteina se han oxidado para formar un grupo disulfuro, de modo que se establece un enlace covalente transversal entre elIas. La estructura de la cistina puede verse en la paqina 85.

74

TABLA 4-1. Simbolos de los amtnoacldos.
Simbolos de Simbolos de
Aminoecidos tres letras una letra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Acido aspartico Asp D
Asn + Asp Asx B
Ctstetna Cys C
Glutamina GIn Q
Acido glutamico Giu E
GIn + Giu GIx Z
GIicocoia Gly G
Histidina His H
Isoleucina lIe I
Leucina Leu L
Listna Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serlna Ser S
Treonina Thr T
Tript6fano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V i'rr,uRA 4-2

Aminotkidos con grupos R no polercs, ,S~ consiqnan los simbolos de WI.l !I de trcs ictcns. Lo« .ltm'tw.kidos .ipotccen en las formQS loni::aaas que predominnn de pH 6,0 a 7,0.

Grupos R

~ Gru.pos R

Alanlua Ala

A

+

H

N

Pm 89

Vallna Vtli

V

Pm 117

Cli~ \ CII

/

( :ll:~

H I I

I C---COO-

,I

~ ~H3.

ir

I

Pm Ul

(;11:,

\. .

(]I-CI{',-

/ ~

r.n,

I c--coo-

I

~J

Lcucina Leu

L

lso~cu.cinCl Ile'

I

(]h-(:ll.; (:11

Pm 131

Proiina Pro

p

II .. ~(: <--, :-...: }I'

Pm :::::: 115

PC'nilJItmina Phc

F'

CcC-CIL II .

... CH

r\"-

H

Prn= J65

Trtptcfano Trp

\'if

Pm = 204

Metioninl.l. Met

M

I----..L_-----'-_-'--' G~,r, 11111

75

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 4-3

Aminoecidos con grupos R poleres, sin carga.

Grupos R

Grupos R

Tirosina Tyr

y

Pm = 181

Glicocola Gly

G

Pm 75

Serina Ser

S

Pm = 105

Treonina Thr

T

Pm = 119

Cisteina Cys

C

Pm = 121

Asparagina Asn

N

Pm = 132

Glutamina GIn

Q

Pm = 146

NH2

\ C-CH-CH

J 2 2

o

76

Capitulo 4 Los eminoecidos, sillares de proieines

FIGURA 4-4

Aminoacidos con grupos polares cargados a pH 6.0-7.0:

Aminoacidos acidos

(cargados negativamente a pH 6.0)

Grupos R

Grupos R

Acido gIutamico GIu

E

Pm = 147

-0

'c

II o

Acido aspartico Asp

D

Pm = 133

-0

\ C-

II

o

AminOt'tcidos baslcos

(cargados positivamente a pH 6.0).

Grupos R

Grupos R

Hlstidina (a pH 6.0) His

H

Pm = 155

HC=.C-

I I

H~~ /NH C

H

Lisina Lys K

Pm = 146

+

H3N-CH2-CH2-

Arginina Arg

R

Pm = 174

H N-C-NH-CH -CH

2 II 2 2

~H2

0,5 nm

77

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Aminoecidos con grupos R cargados positivemente (besicos]

Los aminoacidos basicos (fig. 4A). en los que los grupos R poseen carga positiva neta a pH 7. poseen todos seis atom os de carbono. Estan constituidos por la lisina. que contiene un segundo grupo amino en la posicion e de la cadena alifatica: la arginina, que tiene un grupo guanidinio cargado positivamente y la histidine. que contiene la fun cion imidazolio, debilmente basica. La histidina posee propiedades limites. A pH 6 mas del 50 % de las moleculas de histidina poseen un grupo R cargado positivamente, pero a pH 7 menos del 10 % de las moleculas poseen carga positiva. Es el unico aminoacido cuyo grupo R posee un pK' proximo a 7.0.

Aminoscidos con grupos R cargados negativamente (acidicos)

Los dos miembros de esta c1ase son los acidos aspartico y glutamico, cada uno de los cuales posee un segundo grupo carboxilo que se halla completamente ionizado y. por tanto. cargado negativamente a pH 6 a 7 (fig. 4~4).

Amtnoacidos poco frecuentes en las proteinas

Ademas de los 20 aminoacidos corrientes, se han aislado otros varios de aparicion poco frecuente, a partir de los hidrolizados de algunos tipos especializados de proteinas. Todos son derivados de alqun aminoacido corriente. Se encuentra entre ell os la 4~hidroxiprolina, derivado de la prolina que se encuentra con cierta abundancia en la proteina fibrosa colaqeno (pag. 137) y en algunas proteinas de las plantas (fig. 4~5). La hidroxilina,

FIGURA 4-5

Algunos eminoecidos «poco [recuentes» hallados en las proteiriss [ibroses (formas no ionizadas).

NH2CH2CHCH2CH2CHCOOH

I I

OH NH2

5-Hidroxilisina

CHaNHCH2CH2CH2CH2CHCOOH

I

NH2

e-N-Metil-lisina

HC=C-CH2CHCOOH

I I I

CHa-N ""N NH2

"Cr'

H 3-Metil-histidina

78

Desmosina

HN NH2

2 " 4 I

/CH-(CH2l'UI ~a (CH2l,-CH-COOH

HOOC 6 +...,:: 2 (CH2l -CH-COOH

N1 3 I

I NH2

(CH2l,

I

/C~

H2N COOH

Isodesmosina

FIGURA 4-6

Algunos eminoecidos de la naturaleza que no se hallan en las proteines.

f3 "

CH,CH,COOH

I

NH2

,8-Alanina

y f3 a

CH,CH2CH,COOH

I

NH,

Acido y-arninobutirico

CH2CH,CHCOOH

I I

SH NH,

Hornocisteina

CH.CH2CHCOOH

I I

OH NH,

Hornoserina

H,N -C- NHCH,CH2CH2CHCOOH

II I

o NH,

Citrulina

CH2CH2CH,CHCOOH

I I

NH, NH2

Ornitina

H I

H2N-C-N-O-CH2CH,CHCOOH

II I

NH NH,

Canavanina

HOOCCHCH,-S-CH2-S-CH2CHCOOH

I I

NH2 NH2

Acido dyenc6lico

N=C-CH2CHCOOH

I

NH,

,8-Cianoalanina

Capitulo 4 Los eminoecidos, silletes de proteinas

que es e1 5~hidroxiderivado de la Iisina, esta presente en e1 colaqeno. La desmosina y le isodesmosina, se hallan en la proteina fibrosa e1astina. Sus estructuras, bastante extraordinarias, pueden visualizarse como formadas por cuatro moleculas de lisina que han unido sus grupos R para formar un anillo piridinico sustituido. Esta estructura posiblemente per~ mite a la desmosina y a la isodesmosina unir cuatro cadenas peptidlcas en una ordenaci6n radial; la elastina difiere de las otras proteinas Iibrosas en que es capaz de experimentar un estiramiento endos direcciones. Los aminoacidos poco Irecuentes, e-Ni-mettl-Itsina, s-Ni-trlmetil-Iisina y metilhistidina, derivados metilados de los aminoacidos corrientes (pag. 77), han sido hallados en ciertas proteinas musculares.

Aunque es probable que se descubran otros a!l1inpacidos, poco frecuentes de las proteinas, podemos suponer, sin embargo, Iundandonos en la genetica, que seran en numero muy pequefio y derivaran de los aminoacidos corrientes conocidos hasta ahora, as! como que su incidencia se limitara a tipos especificos de proteinas. Los aminoacidos poco comunes de las proteinas son geneticamente distintivos, ya que no hay vocablos para sus tripletes codificadores (pag. 975). En todos los casos conocidos se producen por modificaci6n enzimatica, despues de que los aminoacidos precursores se han insertado en la cadena polipeptidica.

Aminoacidos no proteicos

Ademas de los veinte aminoacidos corrientes y de varios otros poco frecuentes de las proteinas, se conocen unos 150 aminoacidos mas que se encuentran en diferentes celulas y tejidos en forma libre 0 combinada. pero nunca en las proteinas. La mayor parte de ellos son derivados de los a~aminoacidos halIados en las proteinas, pero tambien se conocen f3~, Y" y Il~aminoacidos (fig. 4-6).

Algunos aminoacidos no proteicos actuan como precursores import antes 0 intermediaries en e1 metabolismo; asi, la !3~ala~ nina es el precursor de la vitamina acido pantotenico: la homocisteina y la homoserina son intermediarios en el metabolismo de los aminoacidos: la citrolina y la ornitina son intermediarios en la sintesis de la arginina. Otros aminoacidos no proteicos actuan como agentes quimicos para la transmisi6n de los impulsos nerviosos, tal como ocurre con el acido y~aminobutil'ico. Algunos aminoacidos no proteicos poseen la configuraci6n D, por ejemplo el acido D~fllutamico, hallado en cantidades sustanciales en las paredes celulares de muchas bacterias (pag. 275), la ti-elenine, hallada en las larvas 0 pupas de algunos insectos y la e-serine, que se encuentra en los gu~ sanos de tierra.

Los hongos y las plantas superiores contienen una variedad extraordinaria de aminoacidos no proteicos, algunos de los cuales poseen estructuras muy curiosas. Las funciones metabolicas de la mayor parte de estes aminoacidos de las plantas no se han comprendido todavia; por ejemplo, algunos como la ceneuenine, el acido dyencolico y la l3~cianoalanina, SOIl t6xicos para otras formas de vida.

79

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Propiedades acido-basicas de los aminoacidos

EI conocimiento de las propiedades acido-basicas de los aminoacidos es sumamente importante en la comprension y el anal isis de las propiedades de las proteinas. Por otra parte, todo el arte de la separacion, la identificacion y la valoracion cuantitativa de los diferentes aminoacidos, que son etapas necesarias en la determinacion de la composicion de los aminoacidos y de la secuencia de las proteinas, se basa en su conduct a acido-base.

Consideremos, en primer lugar, las especies ionicas corrientes de los aminoacidos. Los aminoacidos cristalizados poseen puntos de fusion 0 de descomposicion relativamente elevados; generalmente por encima de los 200°C. Son mucho mas solubles en el agua que en los disolventes no polares. Tales propiedades son, precisamente, las que deben esperarse si el reticulo de las moleculas de los aminoacidos en est ado cristalino esta estabilizado por fuerzas electrostaticas de atraccion entre gru~ pos con cargas opuestas, como ocurre en el eleva do punto de fusion de la red cristalina de las sales, como el cloruro sodico. Si los aminoacidos cristalizasen en una forma no ionica, que~ darian estabilizados por las fuerzas de van der Waals, mucho mas debiles, y tendrian puntos de fusion bajos. Este y otros muchos mas datos han conducido a la conclusion de que los aminoacidos se encuentran y cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras en forma de iones dl'polares, llamados tambien iones hibridos, (fig. 4~7) en lugar de hacerlo en forma de moleculas no disociadas. Que los aminoacidos existen como iones dipolares en las disoluciones acuosas neutras 10 indican tambien sus elevadas constantes dielectricas, asi como sus gran des momentos dipolares, que reflejan la aparicion de cargas positivas y neqativas, en la misma molecula.

Cuando se disuelve en el agua un ion hibrido cristalizado, como la alanina, puede actuar 0 bien como acido, (dador de protones) 0 como base (aceptor de protones):

+

Como acido: HsNCH(CHs)COO- :;::::=:::::: H+ + H2NCH(CH)3COO-

Como base: H+ + HsNCH(CH3)COO- :;::::=:::::: HsNCH(CHs)COOH Las sustancias que poseen esta propiedad son anf6teras (del griego amphi: «ambos») y se llaman an[6litos, locucion abreviada de «electrolitos anfoteros».

EI comportamiento acido-base de los anfolitos se formula sencillamente en terminos de la teoria de acidos y bases de Bronsted-Lowry, (paq. 49). Un a~aminoacido sencillo, monoamino y monocarboxtlico, por ejemplo la alanina, es considerado como un acido dibasico cuando se halla en su forma totalmente protonizada; puede ceder dos protones durante su valoracion completa con una base. EI curso de tal valoracion en dos etapas con NaOH puede representarse mediante las siguientes ecuaciones, que indican la naturaleza de cada una de las especies ionicas que intervienen:

+ +

H3NCHRCOOH + OH- -- H3NCHRCOO- + H20

+

HaNCHRCOO- + OW -- H2NCHRCOO- + H20

La figura 4~8 muestra la curva de valoracion bifasica de la alanina. Los valores de los pK' de las dos etapas de diso-

80

FIGURA 4-7

Formas no ionizada y de ion hibrido de los eminoecidos.

H

I R-C-COOH

I

NH2

H

I R-C-COO-

I

~H3

Forma dipolar o de ion hibrido

Forma

no disociada

TABLA 4-2. Valores de pK' para la
disociacion de los grupos de algunos
amtnoacidos (25oC).
Aminoecido pK; pK~ pK~
a-COOH a-NH~ grupo
R.
Glicocola 2,34 9,6
Alanina 2.34 9,69
Leucina 2,36 9,60
Serina 2.21 9,15
Treonina 2.63 10,43
Glutamina 2,17 9,13
Acido aspartico 2,09 9,82 3,86
Acido glutamico 2,19 9,67 4,25
Histtdina 1.82 9.17 6,0
Cisteina 1.71 10,78 8,33
Tirosina 2,20 9,11 10,07
Lisina 2,18 8,95 10,53
Arginina 2,17 9,04 12,48 PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

de este grupo esta originado por la presencia del grupo a~amonio, que atrae electrones, y por su carga positiva que produce un efecto de campo intense, incrementando de este modo Ia tendencia del hidroqeno carboxilico a disociarse como un proton.

2. EI grupo a~amino de los acidos monoamino-monocarboxilicos es un acido mas fuerte (0 una base mas debil]. que el grupo amino de las aminas alifaticas com parables.

3. Todos los aminoacidos monoamino-monocarboxilicos que poseen grupos R sin carga tienen valores casi identicos de pK'l, y tambien 10 son los valores de pK'2'

4. Ninguno de los aminoacidos monoamino-monocarboxilicos posee capacidad de tamponamiento siqnificativa en la zona de pH Iisiologico, es decir, entre pH 6,0 y 8,0. Muestran capacidad de tamponamiento en las zonas proximas a sus valores de pK', es decir, en las zonas de pH 1,3 a 3,3 y de pH 8,6 a 10,6. Solamente existe un aminoacido con capacidad de tamponamiento significativa entre pH 6 a 8; se trata de la histidina.

5. El grupo j3~carboxilo del acido aspartico y el y~carboxilo del acido glutamico, aunque se hallan totalmente ionizados a pH 7,0, poseen valores de pK' considerablernente mas elevados que los correspondientes valores de pK' de los grupos a~carboxilos, y mas aproximadamente iguales a los de los acidos carboxilicos sencillos, tales como el acido acetico.

6. El grupo tiol 0 sulfhidrilo (- SH) de la cisteina y el gru~ po p~hidroxi de la tirosina son acidos muy debiles. A pH 7,0 el primero de ell os esta ionizado alrededor de un 8 %, y el segundo un 0,01 i%.

7. EI grupo c-amino de la lisina y el grupo guanidinio de la arginina son fuertemente basicos: solo pierden sus protones a valores de pH muy elevados. A pH 7,0 estos aminoacidos poseen carga positiva neta.

Las curvas de valoracion de los aminoacidos con grupos R que se ionizan (tales como la histidma, la lisina y el acido glutamico) son mas complejas, puesto que son una combinacion de curva correspondiente a la disociacion del grupo R y las curvas de valoracion de los grupos a~amino y o-carboxilo (fig.·4~9).

El formaldehido en exceso se combina facilmente con los grupos amino libres (es decir, no protonizados) de los aminoacidos, y origina metilolderivados. Esta reaccion provoca que un aminoacido isoelectrico pierda un proton del grupo amonio (+NH3-) del ion hibrido:

+

HaNCHRCOO- :;;=::= H2NCHRCOO- + W

H2NCHRCOO- + 2HCHO ---'> (HOCH2l2NCHRCOO-

Aminoacido dimetilol

El proton asi liberado puede valorarse directamente con NaOH hasta el punto final de la fenolftaleina pH 8,0 (figu~ ra 4~ 10). Este sistema de valoracion de aminoacidos 0 de mezclas de aminoacidos en presencia de exceso de formaldehido (valoraci6n con formol) se utiliza como metodo analitico, particularmente para seguir la Iormacion de aminoacidos libres durante la hidrolisis de las proteinas por enzimas proteoliticos.

82

FIGURA 4-9

Curves de oelorecion del ecldo glutamico de la lisine y de la histidine. EI pK' del gl'llpO R se designa como pK'R'

pH

Acido glutamico

deOH-

pH

Lislna

2,0 Equivalentes de OH-

pH

FIGURA 4-10

La alanina se velore en ausencia y en presencia de [ormeldehido para mostrer la liberecion del H+ veloreble cuando el [ormeldehido se combina con el grupo amino libre.

TABLA 4-3. Rotaci6n especiftca de algunos aminoacidos aislados de las proteinas (t-estereotsomeros) en disoluci6n aeuosa.

Aminoacido

Rotaci6n especijice [an'

L-Alanina t-Arqtnina t-Leuctna t-Isoleuctna t-Fenllalantna Aeido L-glutamico t-Hlstidina

Acido t-aspartico t-Metlontna t-Lislna

t-Serma

t-Prokna t-Treonina t-Trtptofano t-Valina

+ 1.8 +12,5 -11,0 +12,4 -34,5 +12,0 -38,5 + 5,0 -10,0 +1},5 - 1,5

-86,2

-28,5

-33,7

+ 5,6

FIGURA 4-11

Eiecto del pH sobre la rotecion 6ptica de los eminoecidos.

40

30

t-Leuctna

t-Histldlna

3456789 pH

Capitulo 4 Los eminoecidos, sillsres de proteines

13 12 11 10

9 8

I

I

,#

" .",.------.",.

"

"

, Con formaldehldo

1,0 Equivalentes OH

2,0

Estereoquimica de los aminoacidos

Con la (mica excepcion de la glicocola, todos los aminoacidos obtenidos a partir de la hidrolisis de las proteinas en condiciones 10 suficientemente suaves muestran actividad optica: es decir, pueden hacer girar el plano de la luz polarizada cuando se examinan en un polarimetro. La actividad optica se presenta en todos los compuestos capaces de existir en dos formas cuyas estructuras son como imaqenes especulares, no superponibles: tales compuestos, que pueden existir en formas que son entre si como la mana derecha y la mano izquierda, se Haman compuestos quireles (del griego, «mano»). EI fen6meno de estereoisomeria, 1Iamado tambien quiralidad aparece en todos los compuestos que poseen un atomo de carbono asimetrico, es decir, uno que posea cuatro sustituyentes distintos. A causa de la naturaleza tetraedrica de los orbitales Sp3 del atorno de carbono, los cuatro grupos sustituyentes distintos pueden ocupar dos ordenaciones diferentes en el espacio en torno al atomo de carbono para dar dos estereoisomeros 0 enentiometos diferentes. La glic()cola no posee ninqun atorno de carbono asimetrico: los restantes aminoacidos hallados corrientemente en las proteinas poseen un atomo de carbono asimetrico, a excepcion de la treonina y la isoleucina, que poseen dos. El numero de estereoisomeros posibles es de 2n, en don de n es el mimero de atomos de carbono asimetricos.

La actividad optica es expresada cuantitativamente como la rotaci6n especifica [a] rl:

rotacion observada 0 X 100

recorrido 6ptico (dm) X concentracion (g/100 ml) La temperatura (normalmente 25°C) y la longitud de onda de la luz empleada (normal mente la linea D del sodio, 589,3 nm ) deben especificarse. La tabla 4~3, muestra que algunos a~ami~ noacidos aislados a partir de las proteinas son dextrorroteiotios (Ala, Ile, Glu, etc.), mientras que otros son leoorrotetorios (Trp, Leu, Phe) cuando se observan a pH 7. Los compuestos dextrorrotatorios se design an con eI simbolo (+) y los levorrotatorios con (-). La figura 4~ 11 muestra que la rotaci6n especifica de un aminoacido varia con el pH al que se mide: en general, la rotaci6n de un aminoacido monoamine-monocarboxilico alcanza su maximo poder levorrotatorio cuando se

83

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

halla en su forma isoelectrica. De los datos de la tabla 4~3 podemos deducir la conclusion de que la rotacion especffica de un aminoacido depende de la naturaleza de su grupo R.

La estereoquimica de los aminoacidos hallados normalmente en las proteinas se discute mejor no sequn medidas de rotacion especifica como las anteriormente descritas, sino mas bien en Iuncion de la confiquracion absoluta de los cuatro sustituyentes distlntos del tetraedro en torno al atomo de carbo no asimetrico. Todos los compuestos opticamente activos pueden relacionarse de forma estereoquimica (mediante secuencias de reacciones apropiadas realizadas de tal modo que la actividad optica no se pierda) con el centro opticamente activo de un determinado compuesto progenitor que ha sido arbitrariamente escogido para utilizarlo como patron de referencia para los estereoisomeros. Es el azucar de tres atom os de carbono Ilarna do gliceraldehido, el carbohidrato mas pequefio con un atomo de carbone asimetrico (paq. 258).

Los dos isomeros posibles del gliceraldehido se designan convencionalmente por L y D (observese el empleo de letras versalitas). La figura 4~ 12 muestra las convenciones por las que se designan las formulas estructurales de los estereoisomeros y la figura 4~ 13 muestra como se hallan relacionados el L~ Y n-qliceraldehido. respectivamente. Vemos que el grupo amino sustituyente del atomo de carbono asimetrico de la alanina (0 de cualquier otro a~aminoacido) puede relacionarse estericamente con el grupo hidroxilo del atomo de carbono asimetrico del gliceraldehido, que el grupo carboxilo del aminoacido puede relacionarse con el grupo aldehido del glice~ raldehido y que el grupo R del aminoacido puede, a su vez, relacionarse con el grupo - CH20H del gliceraldehido. De este modo los estereoisomeros de todos los aminoacidos que aparecen en la naturaleza pueden relacionarse estructuralmente con los dos estereoisomeros del gliceraldehido. Todos los estereoisomeros relacionados estereoquimicamente con el L~gliceraldehido se designan por L, y los que se hallan relacionados con el n-qliceraldehldo se designan por D, independientemente de le direccion de rotecion del plano de La luz polarizada que muestren los isomeros. Los simbolos D y L se refieren de este modo a la configuraci6n absoluta, no a la direccion de la rotacion. Se ha recomendado que los prefijos d- y L, que indicaban la direccion de la rotacion, sean sustituidos por los signos (+) y (-) para eliminar cualquier confusion 0 ambigiiedad. Siempre que se conozca la confiquracion absoluta de un compuesto que contenga un atomo de carbono asimetrico, se ha adoptado la convencion de desiqnarlo por DOL, siendo entonces innecesaria la especificacion de la direccion de rotacion. sr no se ha establecido la confiquracion absoluta de un compuesto opticamente activo, entonces tales compuestos pueden ser designados, por convencion, (+) o (-), para indiear la direccion de la rotacion, si bien las condiciones de medida deben entonces especificarse. A 10 largo, del texto, la confiquracion correct a en torno a un atomo de carbono asimetrico aislado, esta indicada mediante una formula de proyeccion (fig. 4~12), 0 sea, cuando el atomo de carbono aparece con cuatro enlaces sencillos que 10 unen a cuatro sustituyentes distintos. Siempre que los cuatro en ... laces sencillos no aparezcan explicitamente, la estereoquimica no esta especificada.

84

FIGURA 4-12

Formulas esttuctursles de los estereoisomeros. Aparecen abajo tres reptesenteciones diferentes de un par de estereoisomeros

que contienen un Momo de carbono -esimetrico. En las formulas en perspective, la conuencion es que los enlaces en forma de cuiie se proyectan por encima del plano del papel y los enlaces punietulos por detras. En las formulas

de proueccion ordinaries los enlaces horizontales se supone que se proyectan POt encima del plano del papel y los enlaces vertic ales pot detres. En este libro empleamos esta convencion para designar las releciones estereoquimices.

Sin embargo, las formulas de proyeccion se utilizan a veces independientemenie,

sin relerencia a la conjiqureciori estereoquimice. En las proyecciones de Fischer se omite el simbolo del cerbono y los enlaces horizontales se prouecten

pot encima del plano del papel y los enlaces vetticeles pot detras.

z-c-x

x-C-z

Formulas en perspectiva

w

I Z-C-X

I y

w

I X-C-Z

I

y

Formulas de proyeccion

z+x x+z

y y

Proyecciones de Fischer

FIGURA 4-13

Configuraciones de los esteteoisometos del gliceraldehido y de la alanina.

C;:HO H-¢-OH CH20H n-qliceraldehido

C;:HO HO-¢-H CH20H L-gliceraldehido

c.;OOH

C;:OOH

H-¢-NH2 CH, n-alanlna

H2N-¢-H CH3 t-alanlna

FIGURA 4-14

Esteceoisomeros de la treonine.

GOOH I HN-G-H

z I

H-G-OH I

GH3

L-Treonina

GOOH I HzN-?-H

HO-G-H I

GH3

u-elo- T reonina

GOOH

I H-G-NH

I z

HO-G-H

I

GH3

GOOH

I H-G-NH

I z

H-G-OH I

GH3

n-Treontna

ti-elo- Treonina

FIGURA 4-15

Estereoisomeros de la cistina.

GOOH GOOH

I I

HN-G-H HN-G-H

z I z I

GHz--S-S--GHz

L-Cistina

GOOH GOOH

I I

HN-G-H H-G-NH

z I I Z

GHz--S-S--GH2

meso-Cistina

GOOH GOOH

I I

H-G-NH H-G-NH

I z I z

GHz--S-S--GHz

n-Cistina

Capitulo 4 Los eminoecidos, silleres de proteinas

Los estereoisomeros D y L de un compuesto determinado, por ejemplo la alanina, poseen propiedades fisicas identicas e igual reactividad quimica; hay dos excepciones: (1) ambos hacen girar el plano de polarizacion de la luz igualmente pero en direcciones opuestas; (2) reaccionan a diferentes velocidades con reactivos que sean asimetricos. La mayor parte de los enzimas que actuan sobre los aminoacidos poseen centros de union asimetricos y son, por tanto, capaces de discriminar completamente entre las form as D y L de los aminoacidos.

Todos los aminoacidos que aparecen en la naturaleza y se han hallado en las proteinas pertenecen a la serie estereoquimica L. Sin embargo, tal como muestran los ejernplos de la tabla 4~3, cuando estan disueltos en aqua, la actividad optica de los aminoacidos puede ser conservada sin racemizacion si la hidrolisis de la proteina se realiza en condiciones apropiadas. Sin embargo, cuando un aminoacido es sintetizado en el laboratorio mediante simples reacciones quimico-organicas, se obtiene, por 10 general, una forma opticamente inactiva. Se denomina a esta recemeto, el cual se halla constituido por una mezcla equimolar de los estereoisomeros D~ y L~, Y se simboliza mediante el prefijo DL. Los aminoacidos opticamente activos se racemizan, es decir, se convierten en mezclas DL, durante cualquier reaccion quimica en que el atomo de carbono asimetrico pase a traves de un estado simetrico intermedio; por ejemplo, por ebullicion con una base fuerte. Cuando los aminoacidos se cali en tan con acidos fuertes se racemizan muy poco 0 nada.

Los aminoacidos que poseen dos atomos de carbono asimetricos, la treonina y la isoleucina, presentan cuatro estereoisomeros. La forma de la treonina aislada de los hidroli ... zados de proteina se designa convencionalmente como L, y su imagen especular sera la forma D. Los otros dos estereoisomeros son diastereois6meros 0 form as alo; tambien son entre si como imaqenes especulares uno del otro (fig. 4~ 14) . Siempre que un aminoacido posea mas de un atomo de carbono asimetrico, se toma la confiquracion del atomo de carbono a como base para la asiqnacion de la confiquracion. La cistina, forma oxidada de la cisteina (paq, 88), que contiene dos atomos de carbono asimetrico, uno en cada mitad de la molecula, puede aparecer no solo en las formas D y L sino tambien como un isomero en el que los atomos de carbono asimetricos sean la imagen especular uno del otro. Este isomero compensado internemente, que no aparece bioloqicamente se llama forma meso (fig. 4~15). Desde luego, la desiqnacion de los estereoisomeros de compuestos con mas de un atomo de carbono asimetrico puede conducir a ambiqiiedades. Estas y otras dificultades se evitan mediante un nuevo sistema de desiqnacion de estereoisomeros, la convencion de Cahn-Inqold-Preloq, llamada normalmente sistema RS. Aunque todavia no muy utilizado en bioquimica proporciona el unico camino exento de ambigiiedades para la desiqnacion de las configuraciones absolutas de moleculas con dos 0 mas centros asimetricos (vease Bibliografia).

Aunque en las moleculas de las proteinas solamente se encuentran r.-aminoacidos, muchos n-aminoacidos diferentes estan presentes en las celulas vivientes en otras formas quimicas, por ejemplo, en las paredes celulares de algunos microorganismos 0 forman do parte de la estructura de antibio-

85

PARTE COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

ticos peptidicos tales como la gramicidina (pag. 813) y la actinomicina D (pag. 933).

Espectros de absorcion

Aunque ninguno de los 20 aminoacidos hallados en las pro~ teinas absorbe luz en la zona del espectro visible, tres de ellos -la tirosina, eI triptofano y la fenilalanina- absorben luz significativamente en eI espectro ultravioleta (fig. 4~ 16 ) .

1

Tript6fano

280 Longitud de onda (nm)

Puesto que muchas proteinas contienen restos de tirosina, las medidas de absorcion de la luz a 280 nm en un espectrofotometro constituyen un medio conveniente y extremadamente rapido de determinar el contenido en proteina de una disolucion. La cis tina absorbe debilmente a 240 nm a causa de su grupo disulfuro. Todos los aminoacidos absorben en el ultravioleta lejano « 220 nm).

Reacciones quimicas de los aminoacidos

Las reacciones orqanicas caracteristicas de los aminoacidos son las de sus grupos funcionales, es decir, los grupos carboxilo, los grupos a~amino y los grupos funcionales presentes en las distintas cadenas laterales. EI conocimiento de estas reacciones es util en varios aspectos importantes de la quimica de las proteinas: (1) la identificacion y analisis de aminoacidos en los hidrolizados de proteina, (2) la identificacion de la secuencia aminoacida en las moleculas de proteina, (3) la identificacion de los restos aminoacidos especificos de las proteinas nativas que se precisan para su fun cion bioloqica, (4) modificacion quimica de los restos aminoacidos en las moleculas proteinicas para alterar su actividad bioloqica u otras propiedades, y (5) la sintesis quimica de los polipeptidos.

Reacoiones de los grapos cerboxilo

Los grupos carboxilo de todos los aminoacidos experimentan reacciones orqanicas bien conocidas, conducentes a la formacion de amidas, esteres y haluros de acilo. Estas reacciones no necesitan detallarse aqui. La esterificacion de los aminoacidos con etanol 0 con alcohol bencilico, se utiliza frecuentemente como metodo para proteger eI grupo carboxilo de los aminoacidos en la sintesis quimica de los peptidos (pag. 119).

86

FIGURA 4-16

Espectros de ebsorcion en el ultreviolete de tript6fano, tirosine y [enilelenine.

FIGURA 4-17

Reducci6n del grupo carboxilo de los eminoecidos.

COOH I

H2N-C-H

I R

1 UBH.

?H,DH

H2N-C-H

I R

PIGURA 4-18

Formeciott del derivedo benziloxicerbonilico [cerbobenzoxi] de los eminoecidos.

H I

R-C-COOH

I

NH2

+

Cl

I c=o

I o

I

o

t-HC1 H

I

R-C-COOH

I

NH

I

c=o I

o

I

o

Clorocarbonato de bencilo

Derivado

benziloxicarbonilico (carbobenzoxi)

FIGURA 4-19

Reaccion de la ninhidrine. Este agente oxidente [uerte efectua la descerboxilecion oxidativa de los eminoecidos, El amoniaco

y la . hidrideniine esi [ormedes reaccionan con una segunda molecule de ninhidrine para producir un pigmento purptireo,

del que solamente el atomo de ·nitrogeno pertenece al eminoecido.

Capitulo 1: Los eminoecidos, silleres de proteines

Otra reaccion del grupo carboxilo de especial utili dad en el estudio de la secuencia aminoacida (pag. 106) es la reduccion en un medio anhidro con el potente reductor borohidruro de litio para obtener el correspondiente alcohol primario (fi~ gura 4~17).

Reacciones de los gropos amino

El grupo «-amino de los aminoacidos puede acilarse por tratamiento con haluros 0 anhidridos de acido: este procedimiento se utiliza corrientemente para proteger el grupo a~ami~ no en la sintesis quimica de los peptidos (paq. 119). Un reactivo profusainente utilizado con este objeto es el clorocerbo ... nato de bencilo, que rinde el correspondiente benciloxicarbo~ nilo derivado del aminoacido (fig. 4~ 18). designado frecuen ... temente como csrbobenroxiderioedo, Cuando las acilaciones se realizan en condiciones suaves, la integridad estereoquimica del atomo de carbono-o se mantiene: sin embargo. en condiciones drasticas, es decir, si se aplica calor. puede producirse la racemizaci6n.

Una de las reacciones del grupo a-amino mas caracteristicas y mas ampliamente utilizada es la reacci6n de la ninhliddna, que puede utilizarse para valorar los aminoacidos cuantitativamente en cantidades muy pequefias. Por calefaccion de un a-aminoacido con dos moleculas de ninhidrina da un producto intensamente coloreado (fig. 4-19). En la reacci6n con la ninhidrina aparece un color purpura con todos los aminoacidos y peptidos que poseen grupos a-amino libres, mientras que

~OH

~OH

o

Ninhidrina

+ H I

R-C-COOH

I

NH2

Aminoacido

lR-C-H+CO

1-> II 2

o

~OH ~H

o

Hidridantlna

+ NH3

Ninbidrina 1" 2H20

o 0

II II

CXcf=N-C~~

C '\C~

II I

o 0-

Pigmento purpura

87

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

la prolina y la hidroxiprolina, en las que el grupo a~amino se halla sustituido, rinden derivados algo diferentes que poseen un color amarillo caracteristico.

Los grupos a~amino de los amino acid os reaccionan reversiblemente con los aldehidos para formar compuestos llamados bases de Schiff (fig. 4~20). Las bases de Schiff intervienen como intermediaries en cierto numero de reacciones enzimaticas en las que se registra la acci6n mutua del enzima con grupos amino 0 carbonilo del sustrato (pags. 228, 435 y 479). Otra reacci6n importante de los grupos amino tiene lugar con el cianato, que rinde derivados carbamilicos (fig. 4~21). La reacci6n se ha empleado para modificar las propiedades de la hemoglobina falciforme para hacerla mas parecida a la hemoglobina de adulto normal (paq. 153).

Ademas de estas reacciones del gtupo amino, otras varias resultan particularmente utiles para el marcado de los restos aminoacidos del extreme final de una cadena polipeptldica, en la que el grupo amino se halla libre 0 no combinado, es decir, el extremo amino terminal. Estas importantes reacciones se describiran detalladamente en el capitulo 5, paqinas 104 a 107, en relacion con los metodos para el establecimiento de la secuencia aminoacida de los peptidos.

Reacciones de los grapos R

Los aminoacidos muestran tambien reacciones coloreadas cualitativas tipicas de las funciones presentes en sus grupos R, tales como el grupo tiol de la cisteina, el grupo hidroxilo fen6lico de la tirosina y el grupo guanidinio de la arginina. Aunque estas reacciones coloreadas resultan, a veces, utiles para ensayos a la gota 0 para identificacion cualitativa, los aminoacidos se identifican y determinan con mas seguridad a concentraciones muy bajas, mediante metodos cromatoqraficos (vease mas adelante). Sin embargo, otros grupos funcionales situados en las cadenas laterales de los aminoacidos desempeiian importantes cometidos en la actividad bio16gica de las proteinas; se encuentra entre ellos el grupo tiol 0 sulfhidrilo de la cisteina. Este grupo, que es muy reactive, es extremadamente susceptible a la oxidaci6n a disulfuro por el oxigeno atmosferico en presencia de sales de hierro u otros oxidantes suaves. El producto de la oxidaci6n es la cistina (fig. 4~22), en la que el enlace disulfuro constituye un puente covalente entre dos restos de cisteina, Otra reacci6n importante y caracteristica del grupo tiol ocurre con metales pe~ sados tales como Hg2+ y Ag+, con los que forma mercaptidos (fig. 4~23). Los grupos tiol de la cisteina y los restos de cisteina de los peptidos y de las proteinas pueden determinarse por una reacci6n cuantitativa con el reactivo de Ellman (figura 4~24), dan do un producto que puede medirse colorimetricamente. Veremos mas ade!ante (paq, 230) que los grupos tiol de restos especificos de cisteina juegan, en ciertas moleculas enzimaticas, un papel importante sobre su actividad catalitica; la modificacion de tales grupos tiol mediante reacciones como las descritas anteriormente, inactivan Irecuentemente al enzima.

La cistina, forma oxidada de la cisteina, desempeiia un papel especial en la estructura de la proteina, ya que su grupo disulfuro actua como un enlace covalente transversal entre

88

FIGURA 4·20

Formecion de una base de Schiff.

H

I

R-C-COOH Aminoactdo

I

NH.

+ o

II

R'-C-H Aldehido

H'01l-H,O

H

I

R-C-COOH

I Base de Schiff

N

II

R'-C-H

FIGURA 4·21

Reeccion de los aminoacidos can el cianato.

H I

R-C-COOH

I

NH.

+ CNO-

rW

H I

R-C-COOH

I

NH

I

c=o

I

NH.

Ion cianato

Aminoacido carbamilado

FIGURA 4.22

Oxidecton de cisterna a cistina.

COOH I HN-C-H

• I t-Ctstetaa CH.

I SH

+ SH I

CH.

I t-Cistlna

H--C-NH

I •

COOH

t2H

COOH COOH

I I

~N-C-H ~N-C-H

I I

CH.--S-S--CH. t-Cistina

FIGURA 4-23

Reeccion de fa cisteina con Ag+.

COOH I HN-C-H

• I

CH.

I SH

+ Ag"

~w

COOH I HN-C-H

• I

CH.

I

~

Ag

Cisteina

Mercaptide arqentico de la cisteina

FIGURA 4-24

Reeccion de la cisteine con el reectivo de Ellman. Esta reeccion ptouocn la liberecion de una molecule de ecido tionitrobenzoico, el cual a pH 8,0 posee una ebsorcion intensa a 412 nm,

NO. COOH

I

~

S I

S

Q-COOH

NO. + SH

I

CH.-CH-COOH

I

NH. Cisteina

5.5' -Ditiobis(2~acido nitrobenzoico)

Acido tionitrobenzoico

Capitulo 4 Los eminoecidos, sillares de ptoteines

FIGURA 4-25

Reduccion de eistina a cisteine,

COOH COOH

I I

H.N-9-H H.N-?-H Cistina

CH.--S-S--CH.

+

SH

[2] 6Hz ,8-Mercaptoetanol

I

CH.OH

1l

COOH I

[2] H.N-?-H

CH.

I

SH

+ CH.OH

I

CH.

I S

I S

I

CH.

I

CH.OH

Cisteina

Di-,8-dihidroxietil-disulfuro

dos cadenas polipeptidicas 0 entre dos puntos de una misma cadena. Los enlaces disulfuro transversales pueden escindirse por la acci6n de agentes reductores, por ejemplo el mercap~ toetenol, que rinde dos moleculas de cisteina (fig. 4~25). La cisteina puede ser oxidada tambien mediante eI acido performico, y origina dos moleculas de ecido cisteico, Esta importante reacci6n se discutira mas adelante (pag. 102). Tanto los grupos sulfhidrilo como los grupos disulfuro se destruyen en disoluciones alcalinas concentradas, con formaci6n de diversos productos.

Amllisis de mezc1as de aminoacidos

La separaci6n cuantitativa y la valoraci6n de cada aminoacido en una mezcIa compleja, como eI hidrolizado de una proteina, constituye un problema formidable cuando se ataca por los metodos clasicos de separacion, tales como la precipitaci6n fraccionada, la cristalizaci6n 0 la destilaci6n. Hace veinticinco aiios eI analisis cuantitativo de un solo aminoacido en una mezcla, podia representar varios meses de trabajo, Hasta que los metodos cromatoqraficos no fueron aplicados sistematicamente al analisis de mezcIas de los aminoacidos, no pudieron lograrse progresos significativos en el estudio detaIIado de la estructura de las proteinas. Desde entonces los metodos analiticos basados en estos principios se han refinado mucho, y son capaces de obtener gran velocidad, precisi6n y sensibilidad; ademas han sido automatizados.

Los metodos cromatograficos pueden aplicarse no solamente a la separacion, identificacion y anal isis cuantitativo de mezcIas de aminoacidos, sino tambien de peptidos, proteinas, nu-

89

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

c1e6tidos, acidos nucleicos, lipidos e hidratos de carbono. Debido a la universal importancia en bioquimica de las muchas formas de cromatografia empleadas en la actualidad, revisaremos, brevemente, sus principios Iisicos basicos. Se pondra c1aramente de manifiesto que el arte del analisis de los aminoacidos por metodos crornatoqraficos y electroforeticos se funda en el conocimiento de la solubilidad reI at iva y de la conducta acido-base de los distintos aminoacidos.

Principio de reperto: cromatografia de reperto

Cuando se distribuye un soluto entre volumenes iguales de dos liquidos inmiscibles, la relaci6n de concentraciones del soluto entre las dos fases en equilibrio a una temperatura determinada recibe el nombre de coeficiente de reparto. Los aminoacidos pueden distribuirse de este modo entre dos fases liquidas tales como los pares Ienol-aqua 0 n-butanol-aqua: cada aminoacido posee un coeficiente de reparto distintivo en cada par de disolventes inmiscibles. Una mezcla de sustancias que posea diferentes coeficientes de reparto puede separarse cuantitativamente por un proceso conocido como de distribuci6n en contrecorriente, desarrollado inicialmente por L. C. Craig, en el que se producen muchas etapas de reparto sucesivas.

Disolvente B

Total Y 1 Tubo 1

6 15 20 15 6 1 2 3 4 5 6 7

Numero de tuba

90

FIGURA 4-26

Disttibucion en conirecorriente. Comprende este tipo de distribucion much os repertos repetidos de una mezcln de sustancias entre dos disolvenies inmiscibles. El fundamento es ilustrsdo con una sustancia y, que posee un coe[iciente de reperto

(K = [Y:]A/[Y]a) igual a 1,0 entre los disolventes A y B. El soluto Y

(64 unidades) disuelto en uri uolumen

del disoloente B, se halla presenie en el tuba 1; los tubos 2 a 7, contienen volumenes iguales de disoluente puro B. Al tubo 1 se le eiiede uti volumen del disolvente A y se agita hasta alcanzar el equilibrio: el resultedo es una distribucioii del soluto Y entre los disolventes A y B en centidedes iguales, es decir 32 unidedes en cada uno. El disolvente A (capa superior) se trsnsliere a continuecion desde el tubo 1 al tubo 2 y se eiiede nueva cantidad de disolvente A al tuba 1. Se agilan los tubos 1 y 2 hasta alcanzar

el equilibria, con el resultedo de que

cada capa de disolvente en ambos tubos contiene 16 unidades de y, de ecuerdo can el coeiiciente de reperto K = 1,0.

Despues de cada etapa de distribucion 0 reperto se sepere. la cepe superior de cada tubo y se eiiede al siguiente de la dereche: cada vez una nueva cantidad

de disolvente A se afiade al tubo 1.

El diagram a muestra los resultados de siete etapas de distribucion; en la practice real de leboretorio se emplean 100 0 mas etapas de distribucion,

La cantidad total de soluto Y en cada uno de los siete tubos se puede ver en una grafica. Con objeto de comperecion se muestre la distribucion de los otros

dos solutos X y Z [erbitreriemenie 64 unidedes) que ha tenido lugar a treves del mismo con junto de distribuciones en conirecorriente. El soluto X posee un coejiciente de reperto inferior (Kx = [X]A/. [Xj , = 0,33) y el soluto Z un coeiiciente de reperto superior (K, = [Z] AI [Z]a = 3.0) al soluto Y. Cuanto mas elevado es el coeiiciente de tepetto mayor es la cantidad de soluto desplazada pot: cada trensierencie. Puesto que cada

soluto se mueve independientemente del otto en concordencie con su coejiciente de reperto, la mezcla de solutos . X. Y y Z

se sepersre pot completo en tres picos despues de uri niimero mucho mayor

de trensierencies.

Capitulo 4 Los aminoecidos, silleres de protcinas

El fundamento del metodo aparece esbozado en la figura 4~26.

La cromatogra{ia de reparto es la separacion de mezclas en contracorriente, esencialmente mediante el principio de distribucion antes descrito. Fue desarrollado inicialmente como un poderoso metodo para la separaci6n de aminoacidos por A. J. P. Martin y R. L. M. Synge en Inglaterra y desde entonces ha sido aplicado a un gran nurnero de diferentes sustancias. La separacion se consigue mediante un eleva do, mimero de etapas de reparto 0 distribuci6n separadas, que tienen lugar sobre los grtmulos microsc6picos de una sustancia inerte, insoluble e hidratada, como el almidon 0 el gel de silice, empaquetados en una columna cuya longitud oscila de 10 a 100 cm. Los grtmulos de almidon 0 de gel de silice son hidrofilos y se hallan rodeados de una capa de agua fuertemente unida, la cual actua como fase acuosa estacionaria, mas alla de la cual fluye una fase m6vil constituida por un disolvente inmiscible que contiene la mezcla que se va a separar. La mezcla de solutos experimenta un proceso de reparto microsc6pico entre la capa de agua inm6vil y el disolvente que fluye. El proceso, que se veri fica en la superficie de cada granulo, es semejante a las etapas de reparto en la distribuci6n en contracorriente. Los procesos de reparto individuales que se producen en una columna de almidon 0 de gel de silice no alcanzan necesariamente el estado de equilibrio, pero el numero total de etapas de reparto en la columna es tan grande que los diferentes aminoacidos de una mezcla se desplazan hacia abajo en la columna a diferentes velocidades, a medida que la fase liquida m6vil fluye a su traves. El Iiquido que sale por el fondo de la columna, llama do elueto, se recoge en pequefias fracciones mediante un colector auto~ matico de fracciones y se analiza por medio de la reaccion cuantitativa de la ninhidrina. Como expresion grafica de la cantidad de aminoacido en cada tubo apareceran una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a un aminoacido diferente.

El mismo principio es, precisamente, el implicado en la cromatografia de papel de los aminoacidos. La celulosa de las fibras del papel esta hidratada. A medida que un disolvente que contiene una mezcla de aminoacidos asciende por capilaridad por el papel, mantenido en posici6n vertical (0 desciende, en la cromatografia descendente}, se producen multitud de distribuciones microsc6picas de los aminoacidos entre la fase que fluye y la fase estacionaria acuosa, ligada a las fibras del papel. Al final del proceso los diferentes aminoacidos han recorrido distancias diferentes desde su origen. El papel se seca, se pulveriza con disoluci6n de ninhidrina y se calienta, con objeto de localizar los aminoacidos. En el importante refinamiento que constituye la cromatografia bidi~ mensional sobre papeZ, la mezcla de aminoacidos se cromatografia en una direccion: a continuacion se seca el papel y se somete a cromatografia con un sistema diferente de disolventes en una direcci6n que forme anqulo recto con la primera. Asi se obtiene un mapa bidimensional de los diferentes aminoacidos. La cromatografia bidimensional sobre papel, 0 la electroforesis sobre papel (vease mas adelante) en una direccion y seguida de cromatografia en anqulo recto, se utilizan profusamente con objeto de separar aminoacidos y peptidos (paq. 109).

91

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Cromatografia de intercembio ionico

El principio de reparto ha sido ulteriormente mejorado en la cromatografia de intercambio ionico, que fue desarrollada inicialmente por W. Cohn. En este metodo las moleculas de soluto se separan basandose en las diferencias de comportamiento acido-base. Para este proceso la columna se llena con una resina sintetica que contiene grupos cargados fijos. Existen dos clases principales de resinas de intercambio i6nieo: intercambiadores cati6nieos e intercambiadores ani6nicos. Los aminoa~idos se separan habitualmente mediante columnas de intercambio cati6nico rellenas con particulas s6lidas de una resina de poliestireno sulfonada que se ha equilibrado previamente con una disoluci6n de NaOH. de suerte que sus grupos sulf6nicos acidos se hall en totalmente «cargados» con Nat. Esta forma de la resina es la «forma s6dica»; la resina puede tambien prepararse en forma protonizada 0 «forma hidroqenada», mediante lava do con acido. A la forma sodica de la resina lavada se Ie afiade una disoluci6n acida (pH = 3) de la mezcla de aminoacidos: a dicho pH los aminoacidos se encuentran principalmente en forma de cationes, con carga positiva neta. Los aminoacidos cati6nieos tienden a desplazar algunos de los iones sodio ligados a las particulas de resina; la cantidad de desplazamiento variara ligeramente entre los distintos aminoacidos a causa de las pequefias diferencias en eI grado de ionizaci6n. A pH = 3.0 los aminoacidos mas basicos [lisina, arginina e histidina) se uniran a la resina muy estrechamente por fuerzas electrostaticas, y los mas acidos (los acidos glutamieo y aspartico ) seran los que se unan menos. A medida que se aumenta gradualmente el pH y la concentraci6n de NaCI del medio eluyente acuoso, los aminoacidos descienden en la columna a velocidades diferentes y pueden recogerse en muchas fracciones pequefias. Las divers as fraccio-

FIGURA 4-27

Analisis crometoqreiico con registro eutometico de aminoecidos mediante una resina de iniercembio i6nico. La eluci6n se lleoa a cabo con diferentes tampones de pH sucesiv emente mas altos. EI efluyente se recoge en pequefios volumenes, y el contenido en eminoecido

de cada tubo se analiza aufomaticamente. El area comprendida bajo cada pico es proporcionel a fa cantidad de cada uno de los eminoecidos en la mezcla. [Reproducido de D. H. Spackman, W. H. Stein y

S. Moore, Anal. Chern .. 30: 1190 (1958)].

I· Columna de 150 em. pH 3.25. 0.2 N
citrato sodico
Treonina
1,0 Acido aspartic \ Serina
III Acido gluta
'u 0,5
§
i! 0,4
0 0,3
.,
..0
< 0,2
0,1
40 80 160 200
Efluyente, mI
92 Capitulo 4 Los aminoacidos, silletes de proteinas

nes pueden analizarse cuantitativamente mediante la reaccion de la ninhidrina. Los aminoacidos mas anionicos, por ejemplo el acido glutamico, aparecen primeramente y los mas cationicos, por ejemplo la Iisina, aparecen posteriormente. A partir de los datos se construye una curva de elucion (fig. 4~27). El pro~ cedimiento analitico completo ha sido automatizado, de modo que la elucion, la recogida de las fracciones, e1 analisis de cada fraccion y los datos de registro son e1aborados automaticamente mediante servomecanismos en un aparato llamado analizador de eminoecidos. Esta tecnica de analisis de aminoacidos fue iniciada por W. Stein y S. Moore en el Rockefeller Institute de Nueva York.

Con objeto de reducir el tiempo necesario para efectuar medidas cromatoqraficas precisas de la composicion en aminoacidos, particularmente en hidrolizados de proteinas, se emplean columnas de cambio ionico muy cortas y mediante pre~ sion, se fuerza el paso de los tampones eluyentes a traves de la columna. El empleo de estas y otras mejoras ha hecho posible determinar el tipo y las cantidades de todos los aminoacidos de una mezcla en poco mas de dos horas: solamente se precisa una muestra de un mg.

Otro metodo de separacion de aminoacidos es la electt'O~ loreSiis sobre papel. En este proceso se coloca una gota de una disolucion de la mezcla de aminoacidos sobre una hoja de papel de filtro adecuada, la cual se humedece a continuacion con un tampon de pH determinado. Los extremes de la hoja se sumergen en los recipientes que contienen los electrodos y se aplica un campo electrico. A causa de sus diferentes valores de pK' los aminoacidos emigran en direcciones diferentes a distintas velocidades, que dependen del pH del sistema y de la fuerza electromotriz aplicada. Por ejemplo, a pH 1 la histidina, la lisina y la arginina poseen una carga igual a + 2, mientras que todos los demas aminoacidos la tienen de + 1. A pH 11 el aspartato y el glutamato poseen una carga de - 2, y todos los demas la tienen de - 1. El conocimiento de las propiedades acido-basicas de los aminoacidos permite seleccionar las condiciones de tal modo que se logre la separacion de cualquier mezcla dada de aminoacidos. Tambien puede conseguirse la separacion de aminoacidos mediante cromatogralia en capa [ina, perfeccionamiento de la cromatografia de reparto que se describira en el capitulo 11 (pag. 292).

Valina

Columna de 15 em ------Citrato Na 0,2 N de pH 4,25--------+-_- Citrate Na 0,35 N de pH 5,28

Alanina

Metionina I Isoleuclna

Lislna Histidina

Arginina

Leueina

NH3

Fenilalanina ,

Tirosina

330

Efluyente, ml

320

370

93

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

Resumen

Los veinte aminoacidos hallados corrientemente como productos de la hidrolisis de las protein as se parecen todos en que contienen un grupo o-carboxilo y un grupo a-amino, pero difieren entre si en la naturaleza quimica de los grupos R sustituidos en el atorno de carbono a. Se clasifican basandose en la polaridad de sus grupos R. La cIase no polar (hidrofoba} comprende la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanlna, el trlptofano y la metionina. La cIase neutra polar incluye la qllcocola, la serina, la treonina, la cisterna, la tirosina, la asparagina y la glutamina. En la clase con carga negativa (aclda) se hallan comprendidos los acidos aspartico y qlutamico. Finalmente, en la clase basica cargada positivamente sa hallan la arginina, la lisina y la histidina, En unas poe as proteinas especializadas pueden existir otros aminoacidos. tales como la hidroxiprolina, la hidroxilisina y la desmosina.

Los aminoacidos monoamino-rnonocarboxilicos se comportan como acidos dibasicos (+NHJCHRCOOH) a valores bajos de pH. A medida que se aumenta el pH a las proximidades de 6, se pierde el proton del grupo carboxilo para constituir la especie dipolar 0 ion hibrldo +NHJCHRCOO-, que es electricamente neutra. Un aumento ulterior del pH origina la perdid a de un segundo proton y se produce la especie ionica NH2CHRCOO-. EI pK' de la primera ionizacion, es decir, del grupo a-carboxilo, se halla entre 2,0 y 2,5; el pK' de la segunda etapa se halla entre 9 y 10. Los aminoacidos que poseen grupos R ionizables pueden existir en especies ionicas adicionales, que dependen de los valores de pK' de sus grupos R. EI atomo de carbono-o de los aminoacidos es asimetrico, excepto en la qlicocola. y puede existir por tanto en dos form as estereoisomeras por 10 menos; en las proteinas sola mente se encuentran los estereoisorneros L, que se hallan relacionados con el L-gliceraldehido.

Todos los a-aminoacidos forman unos derivados colore ados con la ninhidrina que son de utilidad analitica.

El grupo a-amino se acila tambien con facilidad. EI bencilclorocarbonato rinde derivados benciloxicarbonillcos a partir de los arninoacidos. EI grupo a-amino forma bases de Schiff con los aldehidos y carbamil derivados con el cianato. Los grupos carboxilo y R de los aminoacidos muestran tambien reacciones caracteristicas. EI grupo tiol de la cisteina se oxida con facilidad para dar cistina que', a su vez, puede reducirse a cisteina. Tales reacciones son extremadamente titiles para la identificacion y el analisis de aminoacidos,

Las mezclas complejas de arninoacidos pueden separarse, identiflcarse y determinarse mediante cromatografia sobre papel 0 de columnas de intercambio ionico 0 por electroforesis sobre pape!. Estos metodos utili zan las diferencias de comportamiento acldo-basico y/o la solubiltdad de los diferentes aminoacidos.

Bibliografia

Libras

Vease tambien la Biblloqrafia de los capitulos 3, 5, 6 y 9.

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BLACKBURN, S.: Amino Acid Determination. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1968. Extenso tratado sobre metodos analiticos.

EDSALL, ]. T., Y ]. WYMAN: Biophysical Chemistry. vol. 1, Academic Press, Inc., Nueva York, 1958. Un buen tratado de los aminoacidos como electrolitos desde el punto de vista te6rico fisico-qulmico.

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94

Capitulo 4: Los eminoecidos, sillares de proteines

Atticulos

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Problemas

1. Designese un aminoacido encontrado en las proteinas que pueda ser convertido por tratamiento con una base fuerte en otro aminoacldo que tambien se encuentre en las proteinas,

2. Designese un aminoacido natural cuyo punto isoelectrico sea mayor de 8.0 y que por tratamiento con borohidruro de litio forme un dertvado cuyo peso molecular sea 118.

3. Calculense los valores de pHI de la glicocola. la alanina, la serina, la treonina y el acido qlutamico a partir de sus valores de pK' (tabla 4-2).

4. Tomando de la tabla 4-2 los valores de pK' necesarios, indiquese la carga neta (-, 0 0 +) de la qltcocola, el acido aspartico, la lis ina y la histidina a: a) pH 1.0. b) pH 2.10. c) pH 4.0 y d) pH 10.

5. Se practice una electroforesis sobre papel, a pH 6.0. de una mezcla de qltcocola, alanina, acido qlutamico, lisina, arginina y serina.

a) [Cual(es) de los compuestos se mueve hacia el anode?

b) lCual de ellos emigra hacia el catodo?

c) [Cual de ellos perrnanece en. 0 cerca de. el oriqen?

6. A una resina de intercambio anionico se Ie afiade una mezcla de lisina, arqinina, acido aspartlco, acido qlutamico, tirosina y alanina, a pH elevado. Predecir el orden de elucion de los aminoacidos por tratamiento de la resina con disoluciones de pH sucesivamente decreciente.

7. La cromatografia monodimenslonal sobre papel de una mezcla de serina, alanina, acido qlutamico y de isoleucina, se lIeva a cabo con un sistema disolvente que contiene n-butanol, agua y acido acetieo. Predecir las movilidades relativas de los aminoacidos en el sistema descrito indicando, en primer luqar, cual se espera sea el que se des place a mayor distancia del origen.

8. lCuantos gramos de NaOH deberan afiadirse a 500 ml de disolucion 0.01 M de histidina total mente cargada con protones para poder obtener un tampon de pH 7.0?

9. A una disolucion de 1 litro de 1.0 M de glicocola. que se hall a al pH de su punto isoelectrico, se Ie afiaden 0.3 mol de HC!. [Cual sera el pH de la disolucion result ante? lCual seria el pH si en su lugar se afiadiesen 0.3 mol de NaOH?

10. Una disolucion de t-alanma (400 ml) se llevo a pH 8.0. Se trato a continuacion con un exceso de formaldehido. La disolucion resultante necesito un total de 250 ml de disolucion de NaOH 0.2 M para lIevarIa nuevamente hasta pH 8.0. [CUantos gramos de t-alanina contiene la dlsolucion original?

11. Utilizando los datos de la tabla 4-3, calculese la rotacion optic a de la disolucion de 1.10 M de alanina en agua a 25°C. medida con un tubo polarimetrlco de 25 em y utilizando como fuente lumi-, nosa la linea D del sodio.

12. Una disolucton que contiene unicarnente t-Isoleuclna y t-fentlalantna, exhibe un poder rotatorio de -1.97° en un tubo de polarimetro de 25 em a 25°C. Cuando 100 ml de la disolucion se lIevan a pH 8.0 y se tratan con exceso de forrnaldehido, se precis an 66.8 ml de NaOH 0,5 N para valorar por retorno hasta pH 8.0. [Cual es la

95

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

concentraci6n molar: a) de Isoleucina, y b) de fenilalanina en 1a muestra original?

13. La glicocola es 4 veces mas soluble en el disolvente A que en el disolvente B. mientras que la fenilalanina es solamente la mitad de soluble en el disolvente A que en el disolvente B. Los disolventes A y B son inmiscibles; el disolvente B es mas dense que el disolvente A. Se agita una mezcla de 1.0 mg de glicocola y 1.0 mg de fenilalanina con volumenes iquales del disolvente A y B en un embudo de separaci6n hasta que se alcanza eI equilibrio. Se separa la capa superior. se transfiere a otro embudo de separaci6n y se afiade un volumen igual de nuevo disolvente B. Se agita el contenido hasta alcanzar el equilibrio. Calculese la cantidad de glicocola y de fenilalanina en el disolvente A despues de haberse alcanzado el equiIlbrio por segunda vez,

14. EI aminoacido X es 4 veces mas soluble en el disolvente A que en el disolvente B. EI aminoacido Y es solamente 1,5 veces mas soluble en A que en B. La distrlbucion en contracorriente entre los disolventes A y B fue utilizada para separar X e Y. Partiendo de una mezcla de 100 mg de X y 100 mg de Y: a) LEn que tubo de un sistema en contracorriente de cuatro tubos (vease fig. 4-26) es maximo el contenido en X y en cual el de Y? b) LCuantos mg de cada aminoacido hay en cada uno de los tubos?

15. Sup6ngase que la distribucion en contracorriente del Problema 14 se extiende hasta un total de 20 tubos. LCuantos mg de a) X y b) Y se hallan presentes en el tubo 20?

16. A 400 ml de glicocola 0.1 M en su punto isoelectrico se le afiaden 100 ml de acido acetico 0,5 M. Calculese a) el pH de la mezcla y b) una concentraci6n aproximada para 1a forma isoelectrica predominante de la glicocola en la mezcla.

17. Una disoluci6n 0.1 M de acido glutamico se halla en su punto isoelectrico.

a) Calculese una concentraci6n aproximada para la forma Isoelectrica principal.

b) Calculese una concentraci6n aproximada para la forma completamente protonada.

c) LCuantas formas en total se hallan presentes en la disolucion, incluso a concentraciones pequefiisimas?

96

CAPITULO

~IGURA 5-1

~structura de un peniepeptido,

:us peptidos se designan comenzando por I resto N-terminal. Los enlaces peptidicos e hallan sombreados en color.

Extremo Nvtermtnal

CH. 'cH-L.n.-L.u

/ CH.

"coo-

Extremo Cvtermmal

Serilglici1tirosilalanilleucina (Ser-Gly- Tyr-Ala-Leu)

5

Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminoacida

Examinaremos en este capitulo diversos aspectos de la estruc~ tura primaria de las proteinas, que hemos definido (pag. 62) como estructura del esqueleto covalente de las cadenas polipeptidicas, incluida la secuencia de restos aminoacidos, Comenzaremos considerando las propiedades de los peptidos simples. Examinaremos despues tres problemas principales: 1) la determinacion de la secuencia aminoacida en las cadenas polipeptidicas; 2) el significado de las variaciones en las secuencias aminoacidas de las diferentes proteinas en las diversas especies y 3) la sintesis en el laboratorio de cadenas polipeptidicas. Emplearemos los diferentes terminos y conceptos ya definidos en el capitulo 3, a los que puede remitirse como orienta cion.

Estructura de los peptidos

Los peptidos sencillos que contienen dos, tres, cuatro 0 mas restos aminoacidos es decir, los dipeptidos, tripeptidos, tetrapeptidos, etc., que se hallan unidos covalentemente, proceden de la hidrolisis parcial de cadenas polipeptidicas de las proteinas mucho mas largas. Centenares de diferentes peptidos se han aislado de tales hidrolizados 0 han sido sintetizados (pag. 119). Los peptidos se forman tambien en el tracto gastrointestinal durante la digestion de las proteinas por las proteasas, enzimas que hidrolizan los enlaces peptidicos. Los peptidos se designan a partir de sus restos aminoacidos componentes en la secuencia que comienza con el resto aminoterminal (abreviadamente Nvtermtnal ) (fig. 5-1).

Una amplia evidencia experimental apoya la conclusion de que el enlace peptidico es el unico enlace covalente existente entre los aminoacidos que constituyen el esqueleto de la estructura lineal de las proteinas. La evidencia precede no solamente de los estudios de deqradacion quimica y enzimatica, sino tambien de diversas medidas de caracter Iisico. Par ejemplo, las proteinas muestran bandas de absorcion en la region del ultravioleta lejano (180 a 220 nm) y en la region del infrarrojo, que son semejantes a las que producen los peptidos autenticos. Ademas, los anal isis por difraccion de rayos X (cap. 6) muestran directamente la presencia de enlaces peptidicos en las proteinas nativas. Solamente existe otro

97

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

tipo de enlace covalente entre los aminoacidos: es eI enlace disulfuro de la cis tina (pag. 88), que actua en algunas proteinas como enlace transversal entre dos cadenas polipeptidicas separadas (enlace disulfuro intercadenas) 0 entre curvaturas de una misma cadena (enlaces disulfuro intracadena).

Los peptidos pueden considerarse como amidas sustituidas.

A semejanza del grupo amida, eI enlace peptidico muestra un elevado grado de estabilizacion por resonancia. El enlace simple C~N del enlace peptidico posee alrededor del 40 por ciento de caracter de enlace doble y eI enlace doble C = 0 posee cerca del 40 por ciento de caracter de enlace simple. Este hecho determina dos consecuencias importantes: 1) EI grupo imino (- NH -) del enlace peptidico no posee tendencia significativa a ionizarse 0 a captar protones en el intervalo de pH entre 0 y 14.2) El enlace C-N del enlace peptidico (fig. 5~1) es relativamente rigido y no puede girar libremente, propiedad que es de suprema importancia con respecto a la conformacion tridimensional de las cadenas polipeptidicas, como se vera en el capitulo 6.

Peptidos de origen no proteinico

Ademas del gran numero de diferentes peptidos cortos, identificados como productos de la hidrolisis parcial de las pro~ teinas, se han encontrado en la materia viva, otros muchos no derivados de las proteinas (fig. 5~2). Tales peptidos no proteicos difieren habitualmente en estructura de los derivados de las proteinas. Por ejemplo, el tripeptide glutati6n halIado en todas las celulas de los animales superiores, contiene un resto de acido glutamico unido mediante un enlace pep~ tidico poco frecuente en el que interviene su grupo y~carboxilo en lugar del grupo e-carboxilo. La camosina dipeptide del rmisculo, contiene un p~aminoacido. Algunos peptidos no proteicos contienen n-aminoacidos, como el antibiotico t.irocidi~ na A (fig. 5~2). En las protein as no aparecen p~aminoacidos, ni enlaces y~peptidicos ni n-aminoacidos: es probable que estas variaciones de estructura protejan a estos peptidos especializados de la accion de las proteasas, las cuales son general~ mente especificas para los peptidos que poseen t-aminoacidos unidos por enlace peptidico normal. Entre los peptidos no proteicos se encuentran algunos que poseen actividad hormonal, por ejemplo, el factor regulador hipotalamico, para la Iiberacion de la hormona tirotropica de la glandula pituitaria anterior; las hormonas de la pituitaria posterior, la oxitocina y la vasopresina, y el nonapeptido bradiquinina del plasma sanguineo, el cual participa en la requlacion de la presion de la sangre (vease paq. 820). Muchos antibioticos son peptidos o derivados de peptidos, incluyendose entre ellos la gramici~ dina y el decapeptido ciclico velinomicina.

Propiedades acido- base de los peptidos

Los peptidos poseen habitualmente puntos de fusion elevados, 10 cual indica que cristalizan de las disoluciones neutras en forma de reticulo ionico como iones dipolares igual que los aminoacidos (paq. 80). Dado que ninguno de los grupos a~car~ boxilo ni de los grupos a~amino, que estan combinados constituyendo enlaces peptidicos, pueden ionizarse en el intervalo

98

IGURA 5-2

llgunos peptidos biol6gicos de origen no toteinico, Tales peptidos coniienen, -ecuentemente, sminoecidos distintos de

)s hallados en las proteines. Las [lechas, '1 los casos que se empleen, muestrsn

I polaridad 0 la direcci6n de los enlaces eptidicosi estan orientadas desde el xttemo N-terminal hacia el extrema :-terminal de la cadena.

COOH I

H.NCH.CH.C- NHCHCH.C=CH

\I I I

o HN"" _,9-N

C

H

Carnosina (,8-alanilhistidina)

COOH I

H.N-CH

I

CH2

I

CH.

I c=o

I

NH

I

HS-CH'-rH

c=o I

NH

I

CH2

I COOH

Glutati6n (y-glutamilcisteinilglicina)

t-Orn-e-t.-Leu ? \.

L-Val n-Phe

i t

L-Tyr t.-Pro

i 1

L-Gln L-Phe

'" It"

t-Asn-+n-Phe

Ttrocldina A [Om es el simbolo de la Ornitina (paq, 79) 1

Capitulo 5 Proteinas. esqueleto co valente y secuencia sminoecide

Arg

1

Pro

1

Pro

!

GIy

!

Phe

!

Ser

!

Pro

!

Phe

!

Arg

Bradiquinina

TYSi

Tyr

1

Ile S

t I

GIn S

1sn_j

Cys

!

Pro

!

Leu

1

Gly-NH.

Oxitocina bovina

TYSi

Tyr

!

Phe S

1 I

Gin S

Jsn_j

Cys

1

fro

Arg

t

Gly-NH.

Vasopresina

bovina

O~ /~"" 1

c\ rH2 Resto de acido

H C-CH piroqlutamlco

2 ""

C=O /N~

[ / HC ~CH

HN"" '\ /

Resto de H-C-CH -C-NH

histidina / •

O=C

-,

r /N---CH2

Resto de CH I

prolinamida O=C/ \C~CH.

\ H.

NH.

Factor Iiberador tirotroptco

de pH comprendido entre 0 y 14, el comportamiento acidobase de los peptidos viene determinado por el grupo a~amino libre del resto N~terminal, por el grupo a~carboxilo libre del resto carboxi-terminal (abreviadamente Cvterminal) y por los grupos R de los restos situados en posiciones intermedias que pueden ionizarse (pag. 81). En las cadenas polipeptidicas largas, los grupos R que se ionizan sobrepasan en gran numere a los grupos ionizables de los restos terminales. Puesto que los grupos libres a~amino y a~carboxilo, se hal1an mucho mas separados entre si en los peptidos que en los simples aminoacidos, las acciones electrostaticas e inductivas entre ellos decrecen: por tanto, los valores de pK' de los grupos a~carboxilo terminales son algo mayores, y los de los grupos o-amino algo menores, que en los a~aminoacidos lib res (tabla 5~ 1 ). Los valores de pK' de los grupos R en los peptidos

99

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

TABLA 5-1. Valores de pK' de algunos amlnoacidos y peptidos (25 0C).

pK', pK'2
a-COOH a-NH3+
Gly 2,34 9,6
Gly-Gly 3,06 8,13
Gly-Gly-Gly 3,26 7,91
Ala 2,34 9,69
Ala-Ala-Ala-Ala 3,42 7,94
Ala-Ala-Lys-Ala 3,58 8,01
Gly-Asp 2,81 8,60 pK'1l gropo R.

10,58 4,45

5,97 5,59 5,58 6,02 5,68

-9.3

-3,6

cortos, se aproximan mucho a los que exhiben los correspondientes a~aminoacidos Iibres.

Las curvas de valoracion acido-base de los peptidos cortos son muy semejantes a las de los a~aminoacidos libres. Las especies ionicas predominantes en las diferentes etapas de las curvas de valoracion son com parables a las de los aminoacidos libres (fig. 5~3). Los peptidos poseen tambien un pH isoelectrieo que puede calcularse a partir de sus valores de pK' (tabla 5~ 1 ).

Propiedades 6pticas de los peptidos

Si la hidrolisis parcial de una proteina se realiza en condiciones 10 suficientemente suaves, de modo que no se produzca racemizacion del atomo de carbone a asimetrico, los peptidos formados son opticamente actives, ya que solo contienen restos t.-aminoacidos. En los peptidos relativamente cortos, la actividad optica total observada es una Iuncion aditiva aproximada de las actividades opticas de los restos aminoacidos componentes. Sin embargo, la actividad optica de las cadenas polipeptidicas largas de las proteinas en su conformacion nativa (paq. 133) es mucho menor que aditiva, 10 que constituye un factor de gran siqnificaclon con respecto a la estructura secundaria y terciaria de las proteinas, como veremos en el capitulo 6.

Propiedades quimicas de los peptidos

Los grupos amino Nsterminales de los peptidos experimentan identicas clases de reacciones quimicas que los grupos a~amino de los aminoacidos libres, tales como la acilacion y la carbamilacion (pag. 87). El resto aminoacido N~terminal de los peptidos reacciona tambien cuantitativamente con la ninhidri~ na (paq. 87) para formar derivados coloreados: est a reacci6n se emplea profusamente para la identificacion y determinacion cuantitativa de los peptidos mediante los procedimientos electroforeticos y cromatograficos. De modo similar, el grupo carboxilo C~terminal de un peptide puede ser esterificado 0 reducido. Ademas los diversos grupos R de los diferentes restos aminoacidos encontrados en peptidos dan usualmente las mismas reacciones caracteristicas que las de aminoacidos libres.

Una reaccion coloreada, muy empleada, que dan los peptidos y las proteinas, y que no producen los aminoacidos Iibres, es la reacci6n del biuret. El tratamiento de un peptide 0 de una proteina con Cu2+ y alcali produce un complejo purpureo del Cu2+~peptido, que puede medirsc cuantitativamente en un espectrofotometro.

100

FIGURA 5-3

Especies i6nicas principeles de la elanilqlicine.

CH3 + I

H3N-CH -C- NH -CH2COOH

II

o

A pH - I,D. especie cati6nica

CH3 + I

H3N-CH-C- NH -CH.COO-

II o

A pH - 6,0, especie isoelectrica

CH3

I

H2N-CH-C- NH-CH2COO-

II o

A pH - 11, especie ani6nica

FIGURA 5-4

Alquilaci6n de S de un peptido que contiene uri resto de cisteine.

NH.

I

R-CH

I I

c=o I HN

I

HS-CH -CH

• I

C=O I HN

I

R-CH

• I

COOH + ICH.COOH

tHI

NH.

I R-CH

I I

C=O I HN

I

CH,-S-CH2-CH

I I

COOH C=O

I

HN

I R,-CH

I COOH

Tripeptido que contiene cisteina

Acido iodoacetico

Derivado S-carboximetilado del peptide que contiene cisteina

Capitulo 5 Proteinesi esqueleto co valente y secuencie eminoecide

Etapas de la determinacion de la secuencia aminoacida

Con esta informacion sobre las propiedades de los peptidos sencillos como base, podemos examinar la estrategia general empleada para determinar la secuencia aminoacida de los peptidos y de las proteinas, ideada por Frederick Sanger en 1953 para la determinacion de la secuencia aminoacida de las cadenas polipeptidicas de la insulina, que marco un hito, ya que fue la primera proteina de la que se lle go a conocer su estructura covalente completa. Aunque cad a proteina ofrece problemas especiales, se emplea generalmente la secuencia de eta pas que se indica a continuacion:

1. Si la proteina contiene mas de una cadena polipeptidica, en primer lugar, se separan las cadenas individuales y se purifican.

2. Se reducen todos los grupos disulfuro, y los grupos sulfhidrilo resultantes se alquilan.

3. Se somete una muestra de cada cadena polipeptidica a la hidrolisis total, y se determina su composici6n en aminoacidos,

4. Sobre otra muestra de la cadena polipeptidica se identifican los restos N~ y C~ terminales.

5. La cadena polipeptidica intact a se escinde en una serie de peptidos menores mediante hidrolisis enzimatica 0 quimica.

6. Los fragmentos peptidicos resultantes de la etapa 5 se separan, y se determina su composici6n en aminoacidos y su secuencia.

7. Se hidroliza parcialmente otra muestra de la cadena polipeptidica original por un procedimiento distinto, que pro~ voque la ruptura de la cadena en puntos diferentes a aquellos por los que tuvo lugar la hidrolisis parcial inicial. Se separan los fragmentos peptidicos y se determinan su composici6n en aminoacidos y su secuencia (tal como en las etapas 5 y 6).

8. Por comparaci6n de las secuencias aminoacidas de los dos con juntos de fragmentos peptidicos, particularmente cuando los fragmentos de la primera hidrolisis parcial se superponen sobre los puntos de ruptura de la segunda, se pueden situar los fragmentos peptidicos en el orden adecuado para proporcionar la secuencia arninoacida cornpleta.

9. Se determinan las posiciones de los enlaces disulfuro y de los grupos amida en la cadena polipeptidica original.

Describiremos a continuaci6n los metodos empleados en la realizaci6n de las etapas individuales de la estrategia global.

Ruptura de los enlaces disulfuro y separacion de las cadenas polipeptidicas

Antes de comenzar el analisis de la secuencia arninoacida de una proteina el investigador debe determinar si la pro~ teina contiene una 0 varias cadenas polipeptidicas. EI mimero de cadenas se deduce habitualmente del numero de restos aminoacidos Nstermtnales por rnolecula de proteina, por metodos que se describiran mas adelante (vease tambien paqina 104). Esta claro que el nurnero de cadenas de polipeptido sera igual al mimero de restos aminoacido Nvterminales por

101

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 5-5

Escisi6n oxidativa de los enlaces disulfuro trensverseles, pot oxidaci6n con Bcido perf6rmico.

Cadena 1

o

I II

-C-N-CH-C-N-

II I I

o CH2 H

I

Enlace S

disulfuro·/I transversal T

H CH2

I I I

-C-N-CH-C-N-

II II

o 0

Oxidaci6n con. acido performico

o

I II

-C-N-CH-C-N-

II I I

o CH2 H

I

SOaH

+ SDaH

I

H CH2

I I I

-C-N-CH-C-N-

II II

o 0

Cadena 1

H

H

H

H

Cadena 2

Cadena 2

Restos de acldo cisteico

molecula de proteina, Si las cadenas polipeptidicas no poseen enlaces covalentes transversales, pueden separarse tratando la proteina con un acido, una base a con concentraciones elevadas de sales 0 de un agente desnaturalizante (pag. 153).

Si las cadenas polipeptidicas se hallan unidas transversalmente por enlaces covalentes mediante uno 0 varios enlaces disulfuro entre hemirrestos de cistina (paq. 89), estos enlaces transversales deben escindirse mediante reacciones qui micas apropiadas. El procedimiento mas corriente consiste en reducir el enlace disulfuro a grupos sulfhidrilo, empleando un exceso de mercaptoetanol (paq. 89). A continuaci6n se emplea un agente alquilante como el iodoeceteto, para alquilar el gru~ po sulfhidrilo de los restos de cisteina y formar los derivados S~carboximetilados (fig. 5A). Cuando la cadena polipeptidica es subsiguientemente hidrolizada, estos residuos aparecen como Si-cerboximetilcisteine, la cual se identifica can facilidad par los procedimientos cromatoqraficos empleados para el analisis de aminoacidos. La alquilaci6n de los restos de cisteina es conveniente, ya que el grupo sulfhidrilo de la cisteina es relativamente inestable, y tiende a experimentar oxidaci6n. Otros reactivos tales como la iodoacetamida y la etilenimina se emplean tambien para la alquilacion de los grupos sulfhidrilo. Un metoda mas antiguo pero menos frecuente para la ruptura de los enlaces disulfuro transversales, desarrollado inicialmente par Sanger, es la oxidaci6n del grupo disulfuro para dar restos de acido cisteico a partir de las hemi-cisteinas (fig. 5~5). Una vez que se han escindido los enlaces disulfuro intercadenas, se separan las cadenas polipeptidicas individuales, generalmente por electroforesis (pag. 170).

Aunque la proteina examinada contenga solamente una cadena polipeptidica, se deben romper, en caso de poseerlos, sus enlaces disulfuro intracatenarios y alquilar todos los restos de cisteina transformandolos en los derivados Svcarboxfmetilados. mas estables.

Hidrolisis completa de las cadenas polipeptidicas y determinacion de la composicion aminoacida

Una vez que la cadena polipeptidica a examinar se ha obtenido en forma homoqenea, sin que quede ya ninqun enlace transversal disulfuro a grupos sulfhidrilo Iibres. se somete a

102

Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia eminoecide

hidrolisis completa y se determina su composici6n en aminoacidos, Los enlaces peptidicos se hidrolizan con facilidad por calefaccion, ya sea con un acido 0 con una base. La calefaccion de los polipeptidos con exceso de acido clorhidrico 6 N, entre 100 y 120 "'C durante 1 0 a 24 h, normalmente en un tubo cerrado en el que se ha hecho el vacio, constituye el procedimiento mas frecuente de efectuar la hidrolisis completa. En estas condiciones apenas se produce la racernizacion de los aminoacidos. Sin embargo, no todos los aminoacidos pueden recuperarse cuantitativamente despues de una hidrolisis acida: el triptofano generalmente, se destruye por este tratamiento, el cual provoca tarnbien la perdida de alguna cantidad de serina y de treonina, Ademas, los grupos amida de la asparagina y de la glutamina (pag. 76) experimentan hidrolisis completa transformandose en acidos, para rendir los acidos aspartico y glutamico respectivamente, y ademas Iones amonio libres.

Los polipeptidos pueden hidrolizarse tambien por ebuIIi~ion con disoluciones concentradas de hidroxido sodico, pero la hidrolisis alcalina provoca la destruccion de la cisteina, la

TABLA 5-2. Composici6n en aminoacidos de algunas proteinas representativas: numero de restos
por molecule. Las letras del c6digo de las proteinas son arbitrarias.
Letras del c6digo de las proteines (vease abajo para la clave)
A B C D E F G H J K
No polares
Ala 12 15 9 9 22 14 6 45 19 28 12
Val 6 9 11 7 23 14 3 9 17 39 9
Leu 8 21 17 8 19 12 6 2 20 25 2
lie 6 10 11 4 10 9 6 1 10 24 3
Pro 2 8 17 4 9 8 4 7 17 20 4
Met 2 4 5 0 2 0 2 0 2 9 4
Phe 3 4 8 2 6 8 4 4 11 18 3
Trp 6 2 2 1 8 3 1 1 6 2 0
Polares (sin carga)
Gly 12 3 9 6 23 6 12 74 16 38 3
Ser 10 7 16 7 28 16 0 17 30 26 15
Thr 7 8 5 8 23 16 10 2 14 24 10
Cys 8 5 0 5 10 1 2 2 1 14 8
Tyr 3 4 10 4 4 4 4 23 8 4 6
Asn 13 5 8 2 14 10 5 1 17 8 10
GIn 3 9 14 4 10 9 3 0 9 8 7
Cargado neg ativamente
Asp 8 11 7 11 9 8 3 4 14 17 5
Glu 2 16 25 9 5 7 9 4 13 21 5
Cargados positivamente
Lys 6 14 14 4 14 2 19 5 18 30 10
Arg 11 3 6 1 4 11 2 3 7 12 4
His 1 2 5 1 2 0 3 2 11 7 4
Porcentaje de no polares 35 46 40 36 40 43 31 33 39 44 30
Restos totales 129 160 199 97 245 158 104 206 260 374 124
A = Lisozima de polio B = ,B-Iactoglobulina bovina
C = o-casetna bovina D = ferredoxina de espinacas
E = quimotripsin6geno bovine F = proteina de la capsida del virus del mosaico del tabaeo
G = citoeromo c equino H = fibrolna de la seda del Bombyx mori
I = anhidrasa earb6nica humana J = alcohol deshidrogenasa equina
K = ribonucleasa bovina
103

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