PRUEBAS

SEROLOGICAS

E.L.I.S.A
Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay

Antecedentes
Eva Engvall
Perimann

Peter

ELISA
Ensayo de Inmuno Absorcin Ligado a
Enzimas.
Se considera ligado a enzima porque una
enzima se une qumicamente a un anticuerpo
en las dos versiones de la prueba (indirecta y
directa)
El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que
los antgenos o anticuerpos son adsorvidos a un
plstico.
ELISA puede investigar la presencia de un
antgeno o de un anticuerpo.

ELISA
DEFINICIN

El ELISA se basa e el uso de antgenos o

anticuerpos marcados con una enzima, de forma
que los conjugados resultantes tengan actividad
tanto inmunolgica como enzimtica.

Al estar uno de los componentes (antgeno o

anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reaccin antgenoanticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser
fcilmente revelada mediante la adicin de un
substrato especifico
El cual al actuar la enzima, producir un color
observable a simple vista o cuantificable mediante

Antgenos
Los antgenos son, por definicin, generadores
de anticuerpos.
Incluyen protenas, polisacridos y varias
molculas
pequeas,
que
estimulan
la
produccin de anticuerpos.
Los antgenos son, a menudo, molculas que se
definen como <no propias> o extraas, para el
organismo.
Hay <antgenos propios> que actan como
etiquetas de identificacin

Anticuerpo
Son la respuesta del organismo ante la presencia de
un agente infeccioso.
Los anticuerpos son molculas proteicas secretadas
por los plasmocitos, y tienen una altsima afinidad por
sus antgenos correspondientes.
Anticuerpos se caracterizan por:
Ser Defensa natural
Tener Utilidad teraputica
Tener Utilidad Diagnstica
Marcador de Infeccin o exposicin.
Deteccin de antgenos
Los anticuerpos utilizados en el mtodo ELISA son de
origen monoclonal o policlonal.

Controles
Se utilizan para asegurar que la prueba
esta funcionando correctamente
Control POSITIVO
Incluyen una sustancia que se sabe que
reaccionara positivamente, proporcionando
as, un patrn sobre el cual basar los
resultados.
Control NEGATIVO
Incluyen sustancias que no deben
reaccionar .

Fundamento del
ELISA
Ag o Ac
fijado a
una fase
Slida

Ag o Ac
en la
Muestra

Conjugado:
Ac unido a
ENZIMA

SUSTRATO

CAMBIO
DE
COLOR

Elementos del
ELISA
FASE SLIDA
Antgeno o
Anticuerpo
Conjugado: ENZIMA
SUBSTRATO

Fase Slida
SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
Las que favorecen la adsorcin fsica (por fuerzas
electroestticas) de las molculas de Ags o Acs:
poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y
silicona.
Las que permiten la fijacin covalente
reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato

de

esos

Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno

y el polvinilo, por su rigidez, transparencia y
propiedades adsortivas.

Conjugado: Enzima
La enzima escogida como marcador debe:
Unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos,
Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
Tener un substrato cromognico o fluorognico
conveniente y de fcil preparacin.

Las enzimas ms utilizadas

son fosfatas alcalina,
peroxidasa de rbano y galactosidas

Substrato
La eleccin del substrato es de gran
importancia para la estandarizacin del
mtodo ELISA y hay que tener varios
factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de
lectura, as como estabilidad despus de la
reaccin.
Requerimientos del sustrato

Solubles en agua
Fcil de manipular
No txicos, no mutagnicos
Bajo costo

Tipos de ELISA
Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimtica se dividen en dos tipos:

Competitivos
No competitivos

ELISA COMPETITIVO:
En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a
competir con el conjugado por un nmero limitado de
sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el sustrato no
encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido
desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

Tipos de ELISA
ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o
anticuerpo que est en la fase slida. Si una
muestra es positiva se formar el complejo
antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado
reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando
color

Dentro de los no competitivos tenemos:

Los directos que detectan antgenos

Los indirectos que detectan anticuerpos

Tipos de ELISA
Si la prueba se disea para
detectar un antgeno, es un
ELISA DIRECTO porque esta
buscando directamente, como su
nombre lo dice, la sustancia
extraa.
En
cambio,
un
ELISA
INDIRECTO, por su parte, se
disea
para
detectar
los
anticuerpos que el paciente ha

ELISA INDIRECTO
El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el
antgeno y uno secundario marcado
contra el primario. La deteccin
tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificacin de
seal debida a la unin de dos o
ms anticuerpos secundarios por
cada primario.

Materiales
Materiales Orgnicos
Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre,
etc.)
Antgenos
Anticuerpos
Enzimas
Materiales No Orgnicos
Microplacas de 96 pocillos de plstico con fondos de pocillo
pticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100.
Espectrofotmetros de lectura de placas (lectores ELISA).

Fases del ELISA Indirecto

Fijacin al soporte insoluble de antgenos
especficos para los anticuerpos objeto de estudio.
Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus
anticuerpos reaccionarn especficamente con los
antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.

Fases del ELISA

Indirecto
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima,
los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos
aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados
a los antgenos. Lavado para eliminar los antianticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de
actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin
si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final
coloreado

Prueba ELISA

Indirecta

LEYENDA
Antgeno
Anticuerpo
Primario

Anticuerpo
Ligado a Enzima
Sustrato

Aplicaciones del ELISA

Deteccin de antgenos o anticuerpos:

Virus
Hongos
Parsitos
Bacterias.

Deteccin de autoanticuerpos:
IgG(Factor reumatoideo)
DNA
Protena del ncleo

Aplicaciones del ELISA

Medicin de Hormonas:
Progesterona, estrgenos, cortisol, insulina,
testosterona, gonadotropina corinica
humana, TSH.
Deteccin de antgenos tumorales:
Antgeno prostticoAlfa-fetoprotena
Antgeno del ovario
Antgeno carcinoembrionario

Importancia
En estudios serolgicos, hematolgicos,
endocrinolgicos, oncolgicos, en los
trasplantes.
Con propsitos mdicos se han aplicado
en la determinacin de hormonas y
protenas
plasmticas,
antgenos
tumorales,
drogas,
Ag
y
Ac
de
microorganismos
(parsitos,
hongos,
bacterias, virus)
Los
resultados
aportan
elementos
diagnsticos,
informacin
de
una
enfermedad
y
coadyuvan
en
la
planificacin del tratamiento

Inmunodifusin

Creada
Jacques Oudin,

(Dreux 1908 - Pars 1985),

Doctor en Medicina en 1946 escribi algunas
notas y clsicos en el que se describen las
soluciones de antgenos y anticuerpos de
inmunodifusin en gel de agar

rjan Ouchterlony,

(Estocolmo 1914-2004)
mdico sueco Ouchterlony desarrollado en su tesis
un nuevo mtodo analtico para la inmunodifusin .

Modificada la teora de Oudin dando

lugar a la doble inmunodifusin.

INMUNODIFUSIN
RADIAL
Tcnica que cuantifica de manera sencilla y econmica
inmunoglobulinas
de isotipo G, M y A antgenos
solubles (C3, C4, transferrina,
protena C reactiva) presentes
en muestras biolgicas.
La tcnica se basa en la difusin de la muestra conteniendo el
antgeno a medir (inmunoglobulinas
antgenos solubles) en una
matriz semislida de agar en
la que se encuentra disuelto
el Ac especfico.

 La muestra biolgica se introduce en los

orificios cilndricos excavados en el agar y a
medida que el antgenodifunde en forma
radial, se alcanza la relacin Ag-Ac que
permite la formacin precipitados visibles.

Una vez finalizada la difusin se mide el radio

(R) de los precipitados que es proporcional a la
concentracin de antgeno (C).

 La concentracin de protena en la muestra

biolgica (Cx) se calcula realizando una
curva decalibracin utilizando muestras
patrones deconcentracin conocida

La tcnica se basa en la difusin de la

muestra conteniendo el antgeno a medir
(inmunoglobulinas antgenos solubles) en
una matriz semislida de agar en la que se
encuentra disuelto el Ac especfico.

Difusin doble monodimensional o inmunodifusion

doble tipo I ( mtodo de Oakley Fulthorpe)
colocamos en la parte inferior del tubo
un vol. de agar 1% fundido, mezclado
con un vol. igual del antisuero.

Dejamos solidificar y agregamos igual

vol. de agar 0,5%, dejamos solidificar.

 Por ultimo agregamos agar 1% donde se

encuentra disuelto el Ag.

Tanto el Ag.comoel Ac.migrarnhacia la

zona media de menor concentracin, de
manera que, otra vez, se formarn gradientes
que harn que en determinado punto los
reactivos estn en equivalencia y precipiten.

 si la concentracin de Ag.yAc.estnen
relaciones ptimas (equivalentes) la banda se
formar en un punto intermedio del tubo,
mientras que silacantidad de Ag.

Estaen exceso necesitar recorrer una mayor

distancia para alcanzar una dilucin tal que se
encuentre en equivalencia con el Ac.yas la
banda se formar ms cerca del fondo.

Difusin doble bidimensional o

inmunodifusion doble tipo
II(mtodo de Ochterlony)
Constituye un mtodo muy completo ya que permite obtener mas
informacin que los anteriores.

Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego

de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a
distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan
pequeas cantidades de Ag.yAc.

 En este caso los reactivos difunden en

forma radial a partir del pocillo
generando bandas de precipitacin
cuyas caractersticas dependern de
varios factores.

 Mediante la tcnica de Ouchterlony podemos

determinar la existencia o no de determinantes
comunes entre Ag.segnlas caractersticas de las
bandas formadas.
cuando las concentraciones colocadas en los pocillos
estn cerca de la equivalencia la banda se formar a
mitad de distancia entre ellos.

Nos permite tener idea de los PMde cada reactivo ya

que al tratarse de una difusin radial, la concavidad de
la banda estar hacia el lado del pocillo donde se halla
colocado el reactivo de mayor PM,y viceversa,si
ambos PM son semejantes la banda ser recta.

 la posibilidad de hacer varios

pocillos en una placa permite
obtener informacin sobre
similitudde los Ag.reaccionantes.

Las macromolculas antignicas tienen

en su superficie zonas llamadas
determinantes antignicos y que son
los sitios reconocidos por el Ac.

 Para determinar la relacin Ag/Ac

(prueba CUALITATIVA), encontramos
tres patrones bsicos:
1. Identidad:
Los dos Ag tienen
los mismo
epitopos
reconocidos por
el suero y se
forma una banda
de precipitacin
con forma de
arco continuo.

2. No Identidad:

Los Ag son distintos y se forman

bandas de precipitacin
independientes y no dan un arco
continuo. Aparece una figura con

3. Identidad Parcial:

Los dos Ag comparte un epitopo, pero uno

de ellos tiene un epitopo extra que es
reconocido por el suero y se forma un arco
de precipitacin al que le sale un espoln.

 Mediante la tcnica de
Ouchterlony podemos determinar
la existencia o no de
determinantes comunes entre
Ag.segnlas caractersticas de
las bandas formadas.

IDENTIFICACION BACTERIANA
MEDIANTE SECUENCIACION
DEL ARNr 16s

ARN ribosmico (ARNr) 16s

Es un polirribonucletido de aprox 1500 nt codificado
por el gen rrs, a partir de cuya secuencia se puede
obtener informacin filogentica y taxonmica.
Como cualquier secuencia de nucletidos de cadena
sencilla, el ARNr 16s se pliega en una estructura
secundaria, caracterizada por segmentos de doble
cadena, alternando con regiones de cadena sencilla.

ARN ribosmico (ARNr) 16s

 Coeficiente
de sedimentacin: se define como la razn entre la

velocidad (V) a la que se sedimenta la molcula (o partcula en

general) y la aceleracin centrifuga aplicada(C). Este coeficiente
se relaciona con el radio (r) y la densidad (d) de la molcula, y
con la densidad (do) y viscosidad ( ) del medio.

El coeficiente de sedimentacin tiene unidades de tiempo y

habitualmente se mide en unidades de Svedber (S), SIENDO 1S=
1X.

Caractersticas relevantes de RNAr

16s
Molcula muy antigua presente en todas las bacteria
actuales.
Estructura y funcin han permanecido constantes.
Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta,
como para aportar informacin acerca de todos los
procariotas.
Tamao relativamente largo (1500 nt)
La conservacin en estructura secundaria puede servir
de ayuda en las comparaciones, aportando una base
para el alineamiento preciso.

METODOLOGIA
1 Amplificacin del gen a partir de una muestra
adecuada.
2 Determinacin de la secuencia de nucletidos del
amplicn .
3 Anlisis de la secuencia.

Aplicaciones de secuenciacin de
ARNr 16S en el diagnostico
microbiolgico:

Bacterias no cultivables presentes en muestras clnicas.

Bacterias cuyas caractersticas bioqumicas no se
adaptan a las de ningn genero o especie reconocido.
Bacterias ara las cuales la caracterizacin fenotpica sea
sustancialmente deficiente.
Bacterias de crecimiento lento, que retrasa
considerablemente la identificacin convencional.

TECNICAS DE
TRANSFERENCIA
BLOTTING

WESTERN BLOT
Mtodo en el cual las protenas son separadas en primer
lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
en condiciones desnaturalizantes y posteriormente se
transfieren a una membrana, mediante la aplicacin de
un campo elctrico perpendicular al gel (electroblotting).
una vez completada esta operacin la protenas de
inters son reveladas por el agregado de un anticuerpo
especfico.

 El electroblotting es el mtodo donde las protenas son

transferidas desde el gel a la membrana
electroforticamente

Inmunomtodo para la deteccin de

protenas especficas en un soporte
slido.
Preparacin de la muestra (dosaje de protenas
totales)
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Transferencia a un soporte slido
Inmunodeteccin de la protena de inters

FRACCION CELULAR

Preparacin de la muestra (dosaje de protenas totales)

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Aplicaciones de western blot

Enfermedades Infecto-Contagiosas
Enfermedades Inflamatorias
Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
Factores de Crecimiento
Protenas de Secrecin

Dot blot
Representa una simplificacin de los mtodosnorthern
blot,southern blotowestern blot. En un dot blot las biomolculas
para ser detectadas no son separadas porcromatografa . En
cambio, una gota que contiene la molcula para ser detectada se
aplica directamente sobre una membrana. esto es seguido por la
deteccin porsondasdenucletidos(northern blot y southern
blot) oanticuerpos(para un western blot).

La tcnica del Southern Blot

La tcnica de Southern Blot desarrollada en Edimburgo por E.M. Southerm, permite
identificar regiones especficas de ADN que han sido fragmentadas por una enzima de
restriccin.
El ADN se separa mediante electroforesis en gel de agarosa. Tras teirlo con bromuro
de etidio, el gel se fotografa bajo luz ultravioleta.
Posteriormente se trata con hidrxido sdico o a altas temperaturas para
desnaturaliza el ADN y romper la unin entre sus dos cadenas.
Entonces el gel se neutraliza con un buffer adecuado.
En una cubeta se extiende una pieza de papel de filtro grueso sobre un soporte
elevado, con los extremos del papel de filtro sumergidos en una solucin altamente
salina.
Se sita el gel sobre la pieza de papel de filtro y sobre el gel se coloca una membrana
de nylon especial. Encima de todo ello se pone una pila de toallas de papel.
Por ltimo se presionan todas las capas con un peso. La solucin altamente salina
asciende a travs de la pieza de papel y atraviesa el gel por accin capilar, llevando
consigo el ADN desnaturalizado. El ADN es transportado hasta la membrana de
nitrocelulosa, a la cual se adhiere.
De este modo el filtro se convierte en una rplica del gel original.

http://www.youtube.com/watch?v=VmCTsmhx2_w

http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF16Jm8

La tcnica de Northern Blot

La tcnica de Northern Blot fue desarrollada por Alwine y
colaboradores, en 1977, y es anloga al Southern Blot. Permite
determinar la cantidad y tamao de ARNs especficos presentes en
preparaciones de ARN total, mensajero, o ribosmico.
El mtodo se basa en la hibridacin de secuencias complementarias
de cidos nucleicos de cadena simple.
En esta tcnica se asla el ARN total, luego se separan los diferentes
tipos de ARN por medio de una electroforesis en gel, el ARN
separado es transferido desde el gel, hacia un soporte slido
(membrana), y luego hibridado con una sonda especfica de ADN
ARN, marcada mediante radiactividad por mtodos no radiactivos.
Se produce un hbrido ADN:ARN, dado que son molculas
complementarias y all donde esta el RNAm complementario a la
secuencia del gen forneo, se detectar la seal en el papel
fotogrfico sensible a la radiacin.

PCR
Reaccin en
Cadena de la Polimerasa

El fundamento de la tcnica es sintetizar muchas veces

un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa
que puede trabajar a temperaturas muy elevadas.

Un poco de historia
Tcnica desarrollada en
1983 por el Bioqumico
estadounidense Kary B.
Mulls, quien en 1993
recibi el premio nobel de
qumica.

Replicacin de ADN
En la procesos diferentes encargados de la transmisin
de la informacin gentica:
Replicacin: un cido nucleico bicatenario se duplica
para formar copias idnticas.
Transcripcin: un segmento de ADN que constituye un
gen se lee y se transcribe en una secuencia
monocatenaria de ARN (ncleo - citoplasma)
Traduccin: la secuencia de ARN se traduce a una
secuencia de aminocidos que forman una protena.

Extraccin de ADN
Lisis de las clulas o virus.
Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN.
Purificacin. Consta de 3 fases:
1. Precipitacin del ADN.
2. Lavado del pellet.
3. Recuperacin.
. La confirmacin de la presencia de ADN

Ingredient
es
Tag polimerasa /
Polimerasa (Thermus
aquaticus)
ADN del organismo a
estudiar (Muestra)
Oligonucleotidos
(primers, iniciadores o
cebaores)
Dinucleotidos (dNTPs)
Muestra de ADN

Condiciones
Temperatura
pH
MgCl2
KCl

Muestras
viables.
Primers.
Taq
polimerasa.

Tecnica
Ciclo 1 :

desnaturalizac
in
Ciclo 2 :
Alineamiento
Ciclo 3 :
Extensin

Evaluar la
presencia
del gen.

Ciclo 1: Desnaturalizacin.

Deteccin de resultados
Electroforesis en gel de
Agarosa, revelado con rayos
UV gracias a la utilizacin
de Bromuro de etidio
(colorante)

Tipos de PCR
PCR Anidada
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es
utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera
secuencia amplificada.
PCR Multiplex
Es un tipo de PCR en el cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin, (hasta 8 primer)
PCR in situ
Es una PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos, consiste en una reaccin de PCR en secciones
histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin.
RT-PCR
Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una enzima denominada transcriptasa inversa , para realizar la
conversin del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario). Es especialmente til cuando solo se
dispone de pequeas cantidades de ARN, esta tcnica se utiliza para amplificar genes especficos
PCR tiempo real
Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento. Para la deteccin de la cantidad de ADN
especfico se emplea una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo
(forward) y el inverso (reverse).

Aplicacin
Las tcnicas de PCR se han
hecho indispensables para
muchos procedimientos
comunes, como la clonacin
de fragmentos especficos de
ADN, la deteccin e
identificacin de genes para
diagnstico, y en la
investigacin de modelos de
expresin de los genes

DNA
RECOMBINANTE

DNA RECOMBINANTE
La tecnologa de DNA recombinante depende, en parte
de la capacidad de cortar y unir segmentos de DNA a
virus o a bacterias para amplificarlos, aislarlos e
identificarlos.

Fuente:

FABRICACION DEL DNA

RECOMBINANTE
Enzimas de Restriccin: Son enzimas aisladas de
bacterias y tienen la funcin de reconocer y cortar
molculas de DNA por secuencias nucleotdicas
especficas.
Tipo
Tipo
I

II

Fuente: Conceptos de Gentica

5 edicin

Molculas de DNA recombinante fabricado con DNA de distintas

fuentes

Fuente: Conceptos de Gentica 5

Algunas enzimas de restriccin comunes, con sus

sitios de reconocimiento y de corte, el patrn de
corte y la fuente de origen.

Fuente: Conceptos de Gentica 5

edicin.

DNA RECOMBINANTE
VECTORES: Son
molculas de DNA
transportadoras.
Plsmidos: Son
pequeas molculas de
DNA circulares
presentes en muchas
bacterias y poseen un
nmero de sitios para
poder hacer la
restriccin.

Fuente: Conceptos de Gentica 5

edicin.

DNA RECOMBINANTE
Bacterifagos: Son virus que infectan exclusivamente
bacterias. Lambda y M13
Fuente:
http://www.thebacteriophages.org/

Fuente: Conceptos de Gentica 5

DNA RECOMBINANTE
Csmidos: son vectores hbridos
construidos utilizando partes del
cromosoma del fango lambda y del
DNA plasmdico
Vectores transbordadores: Son
hbridos
que
provienen
de
diferentes
fuentes
(ejemplo,
plsmidos y virus de animales
como SV40)que pueden replicarse
en mas de un tipo de clula
husped.

Fuente: Conceptos de Gentica 5

edicin.

PROCESOS ENZIMTICOS DE LA RECOMBINACIN GENTICA

A. Alineacin de homlogos.
B. Rotura monocatenaria.
C. Invasin o desplazamiento o
de las Cadenas.
D. Migracin de las cadenas.
E. Separacin del Dplex y
rotacin de 180Corte por
una endonucleasa y Ligacin
G. Hetereroduplex no
recombinante

Fuente:
http://www2.uah.es

F. Heterodplex recombinantes

DNA RECOMBINANTE

Fuente: Conceptos de Gentica 5

DNA RECOMBINANTE

Fuente:
http://es.slideshare.net/