Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Ingeniera Bioqumica

Profesora: Violeta Larios Serrato

Autor: Tinajero Vargas Sergio Aarn

Coautora: Garca lvarez Vctor Fernando

Laboratorio de Mtodos de Anlisis

Prctica: Separacin de una mezcla de aminocidos por cromatografa

de intercambio inico.

Grupo: 4IV1

Seccin 1

Fecha: 24/06/15

INTRODUCCIN

La cromatografa de intercambio inico es un mtodo que permite la separacin de molculas

basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria
o intercambiador inico, y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie
cargas electrostticas fijas, que retienen contra iones mviles que pueden intercambiarse por
iones de la fase mvil, la cual suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de
metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas
generalmente en forma de buffer. Los iones de sta compiten con los analitos por los sitios
activos de la fase estacionaria.
El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se
adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser
asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante
intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a
separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y
estable; a continuacin, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza
inica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unin.
Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos. La
mayora de las protenas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay
un margen en el que no se desnaturalizan), en el que estn cargadas positiva o negativamente.
Por lo tanto si una protena es estable a valores de pH por encima del punto isoelctrico, se
debe utilizar un intercambiador anicnico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del
punto isoelctrico, debe utilizarse un intercambiador catinico.
INTERCAMBIADOR CATINICO: Los intercambiadores catinicos son portadores de grupos
con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo tpico que se utiliza en los
intercambiadores de cationes es el grupo sulfnico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se dice que
el intercambiador se encuentra en forma cida y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un
Na+ o dos H+ por un Ca+2. El grupo cido sulfnico es un intercambiador de cationes
fuertemente cido.
Los poli aniones y poli cationes se unen a los intercambiadores de aniones y de cationes. Sin
embargo, las protenas y los poli electrolitos (polmeros poli inicos) que son portadores de
cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a los cambiadores de cationes como a los de
aniones, dependiendo de su carga neta. La afinidad con la que un poli electrolito concreto se
une a un cambiador inico determinado depende de las identidades y de las concentraciones
de los dems iones presentes en la disolucin, debido a la competencia entre los diversos iones
por los sitios de unin sobre el intercambiador inico. Las afinidades de unin de los poli
electrolitos portadores de grupos cidos-base dependen tambin, en gran medida, del PH ya
que sus cargas netas varan con dicho valor.

OBJETIVOS
Lograr la correcta separacin de una mezcla de histidina y prolina mediante la tcnica de
cromatografa por intercambio inico.
Realizar el perfil de elucin para cada aminocido tras su revelacin con ninhidrina.
RESULTADOS
1) ELABORACION DEL PERFIL DE ELUCIN

Los datos que a continuacin se muestran fueron recopilados a partir de las lecturas de los
eluatos recolectados del sistema cromatogrfico y revelados con ninhidrina, el cual consto
de los siguientes componentes:
o
o
o
o
o
o
o

Soporte: columna de vidrio.

Fase estacionaria: Amberlita
Primer fase mvil: Regulador de citratos pH 5.25.
Segunda fase mvil: Regulador de citratos pH 2.00.
Mezcla: Histidina y Prolina
Altura de empaquetamiento de la Amberlita: 38 cm
Velocidad de elucin: 40 gotas por minuto, altura constante de 45 cm.
Tabla 1. Separacin de prolina e histidina
Volumen de
Volumen de

elucin (mL)
elucin (mL)
3
0.137
63
0.241
6
0.059
66
0.392
9
0.029
69
0.493
12
0.025
72
15
0.289
75
18
1.931
78
21
1.981
81
24
1.982
84
27
1.990
87
30
1.968
90
33
1.969
93
36
1.912
96
39
1.688
99
42
1.455
102
45
1.135
105
48
0.869
108
51
0.711
111
54
0.429
114
57
0.482
117
60
0.516
120
-

0.062
0.214
0.328
0.371
0.517
0.357
0.550
0.228
0.746
0.934
0.996
1.056
1.176
1.396
1.418
1.572
1.221
1.949
0.825
1.234

Perfil de elucin de prolina e histidina

2.5

Absorbancia

2
1.5
1
0.5
0

20

40

60

80

100

120

140

Vol. de elucion (mL)

Prolina

Histidina

a) Cul de los aminocidos eluye primero? Explique por qu.

La Prolina, ya que al poseer una carga neutra no puede interaccionar con los iones fijos de la
matriz del intercambiador a diferencia de la histidina que al ionizarse con cargas positivas al
utilizar el regulador de citratos a pH de 5.2 genera interacciones con el ion COO y queda
adherido provisionalmente. Provocando que la prolina quede libre y pueda eluir por el sistema.
b) Cul es la importancia de regular la velocidad de elucin, qu pasa a altas y a bajas
velocidades?
La importancia de regular la velocidad de elucin es con el fin de que exista una interaccin
efectiva para que se lleve a cabo la separacin de los dos aminocidos, no debe ser tan rpida
debido a que no se dara tiempo suficiente para que las molculas interaccionen con la resina.
c) Empleando las frmulas de los aminocidos y del grupo funcional del intercambiador, haga
un esquema de cmo se produjo la separacin, considere el cambio de pH en el medio.

DISCUSION DE RESULTADOS

El principio por el cual se separan los aminocidos est completamente ligado con la carga que
cada aminocido tiene, el cual es conferido por sus grupos aminos, carboxilo y R, propios de
cada uno. La interaccin de cualquier componente que quiera separase con este tipo de resina
deber ser de forma catinica, es decir, debe generar interacciones electrostticas con el grupo
COO que esta fijo a la resina para poder desplazar al ion que se encuentre ligado en ese
momento con la resina. La resina al encontrarse en su forma acida el ion que est ligado a esta
es el ion hidrogeno.
El primer paso para llevar a cabo esta cromatografa fue empacar la columna con regulador de
citratos pH 5.25, el cual tambin contiene un ion sodio Na+ que es capaz de desplazar a l ion
mvil H + por tanto en un momento antes de agregar la mezcla de aminocidos el ion mvil queda
remplazado estequiometricamente por iones Na+ .
Al momento de agregar la solucin problema constituida de una mezcla de Histidina y Prolina
se hace eluir primeramente con el regulador de pH 5.25 lo que origina una ionizacin de los
grupos amino y R del aminocido Histidina proveyndolo de una carga neta de +2, esta carga
generada es la que posibilita la interaccin con el ion fijo de la resina que se lleva a cabo de
forma estequiometria, lo que quiere decir que se sustituyen dos iones sodio por uno molcula
de histidina. Esta unin provisional posibilita por tanto la elusin con muy poca interferencia del
aminocido Prolina y por tanto es de esperarse de forma correcta y como se observ en el
experimento que este aminocido saliera primero del sistema cromatogrfico, lo cual se muestra
perfectamente en el perfil de elusin. El perfil de elusin muestra que en los volmenes de
elucin de 18 33 mL ledos a una longitud de onda de 400nm, se obtuvo la mayor cantidad de
Prolina.
El siguiente paso para la separacin de los aminocidos fue liberar de su adherencia provisional
a la Histidina, la cual fue realizada mediante el cambio del eluyente a un regulador de citratos
de pH 2. El aumento en el pH provoca un aumento en la concentracin de iones H + los cuales
compiten intensamente con los grupos cargados de la histidina y debido a que estos estn
presenten en mucha mayor proporcin logran desplazar a la histidina originando su total
remocin del sistema cromatogrfico. Es por tanto de esperarse que al realizarse las lecturas
de absorbancia a una longitud de onda de 570nm se observase la recoleccin del segundo
aminocido; lo cual se observa perfectamente en el perfil de elusin construido en base a los
eluatos recolectados. La mayor cantidad de Histidina obtenida se identific en el volumen de
elucin de 114mL con un valor de absorbancia 1.949.
Ha de mencionarse que posteriormente a la recoleccin total de las 40 muestras de elucin se
realiz una reaccin con ninhidrina para lograr la coloracin de los aminocidos y poder ser
ledos en la regin visible. Tambin gracias a esta coloracin de los aminocidos por la reaccin
del grupo amino libre con la ninhidrina pudo revelarse que efectivamente el primer aminocido

que sali de la columna fue la prolina, ya que este es el nico aminocido que al no contener
un grupo amino libre en su estructura presenta una coloracin amarilla-caf con la ninhidrina,
mientras que la histidina presento la coloracin azul caracterstica de la reaccin antes
mencionada.
Tambin es de gran importancia mencionar que las tendencias irregulares mostradas por los
perfiles de elucin de cada aminocido son debidas principalmente a la evaporacin de agua y
etanol de los tubos al ser puestos en el bao mara para lograr la reaccin con la ninhidrina. La
evaporacin en medidas no proporcionadas e incapaces de controlarse; ocasionan una
diferencia en las concentraciones de aminocidos contenidas en cada tubo y por tanto las
diferentes tonalidades mostradas originando las irregularidades mostradas en las lecturas de
absorbancia.

CONLUSIONES

SE logro la separacin de los aminocidos, donde el primer aminocido en eluir como se

esperaba fue la Prolina utilizando un regulador de citrato de sodio a pH 5.25 y el segundo
aminocido en eluir fue la Histidina en el regulador de pH 2.
La coloracin que presenta la prolina depende del grupo amino que al no estar libre no reacciona
de forma estndar como los otros aminocidos con la ninhidrina.
La cromatografa por intercambio inico es una tcnica de separacin eficaz para la separacin
de molculas con capacidad de ionizarse por uso de reguladores a diferentes pHs como fase
mvil, esto basado en las interacciones que se generan con las cargas que presentan las
molculas y el ion fijo del intercambiador.
El pH, la velocidad de elucin y la altura de la fase estacionaria son algunos factores que influyen
en la separacin por cromatografa de intercambio inico.

BIBLIOGRAFIA
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia
Harris, Daniel C. Anlisis Qumico Cuantitativo,
Lehninger, Principios de bioqumica, quinta edicin.