Validacion de Métodos Microbiologicos

Instituto de Hidrologa, Meteorologa y Estudios Ambientales
Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial Repblica de Colombia

SUBDIRECCIN DE ESTUDIOS AMBIENTALES - GRUPO DE ACREDITACIN
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Validacin de Mtodos Microbiolgicos
1.
OBJETIVOS
Establecer una gua para la validacin de mtodos microbiolgicos, con especial nfasis en mtodos
cuantitativos selectivos en los cuales el clculo cuantitativo se basa en el recuento de partculas, ya
sea directamente, con la ayuda de un microscopio, o indirectamente, sobre la base del crecimiento
(multiplicacin) en colonias o turbidez.
Los principios y procedimientos dentro de este objeto se conocen comnmente como el recuento de
colonias, presencia/ausencia (P/A), el nmero ms probable (NMP), y recuento directo
(microscpico).
2.
ALCANCE DE LA APLICACIN
La presente gua es tomada de la ISO 13843. Water Quality - Guidance on Validation of Methods.
Geneva. 2000 y adoptada por el Icontec como GTC 84. Gua para la orientacin acerca de la
validacin de mtodos microbiolgicos y de Poltica de Seleccin y Validacin de Mtodos de Ensayo
OGA-GEC-016, de la oficina de Acreditacin de Guatemala, 29 enero de 2007
Aunque los conceptos son bsicos para la validacin de un mtodo microbiolgico cuantitativo y
cualitativo, cada laboratorio de ensayos para su aplicacin debe realizar las adaptaciones necesarias
a las matrices a validar
3.
TRMINOS Y DEFINICIONES
La siguiente terminologa es aplicable y prctica para ser utilizada en cualquier tipo de validacin
microbiolgica:
Exactitud de la medicin: grado de correspondencia entre el resultado de un ensayo y el valor de
referencia aceptado.
Analito: cantidad particular sometida a medicin
Porcin analtica: volumen de suspensin de partculas inoculado en una unidad detectora
Coeficiente de variacin: CV desviacin estndar relativa para una caracterstica no-negativa, es la
proporcin de la desviacin estndar al promedio
Detector de partculas: placa de matriz slida o tubo de lquido que contiene un medio nutriente para
el recuento o deteccin de partculas microbianas vivas.
Lmite de deteccin: nmero de partculas x (por porcin analtica) donde la probabilidad p0 de un
resultado negativo es igual al 5 %.
Lmite de determinacin: concentracin de partculas mnima promedio x por porcin analtica,
donde la incertidumbre estndar relativa esperada es igual a un valor (RSD)
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Linealidad: dependencia lineal de la seal en la concentracin del analito

Distribucin binomial negativa: distribucin estadstica particular "sobre dispersa" de recuentos
Precisin: grado de concordancia entre resultados de ensayo independientes bajo condiciones
estipuladas.
Validacin primaria o validacin completa: establecimiento de las especificaciones para el
desempeo de un nuevo mtodo y/o verificacin experimental de que un mtodo cumple criterios de
calidad derivados tericamente
Validacin secundaria: demostracin, mediante experimentos, de que un mtodo establecido
funciona de acuerdo con sus especificaciones, cuando lo emplea el usuario.
Repetibilidad: grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo
elemento mensurado realizadas bajo las mismas condiciones de medicin.
Reproducibilidad: grado de concordia entre los resultados de las mediciones en el mismo elemento
mensurado realizadas bajo condiciones de medicin alteradas.
Robustez: intensidad de un mtodo analtico frente a pequeos cambios en procedimiento
Especificidad: fraccin del nmero total de culturas o colonias negativas asignadas correctamente
en la presunta inspeccin.
Incertidumbre estndar: incertidumbre del resultado de una medicin expresada como desviacin
estndar
4.
GENERALIDADES SOBRE VALIDACIN
4.1.
Definicin
La validacin significa un proceso que ofrece evidencia de que un mtodo es capaz de servir para su
propsito planeado, es decir, para detectar o cuantificar un grupo microbiano especificado con
adecuada precisin y exactitud.
Los mtodos de recuento total no tienen un grupo objeto definible y slo pueden validarse en relacin
con otros mtodos o contra expectativas tericas de precisin.
La validacin se clasifica como primaria o secundaria de acuerdo con su propsito.
4.2.
Tipos de Validacin
4.2.1. Validacin primaria

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La validacin primaria es un proceso exploratorio con la meta de establecer los lmites operacionales
y caractersticas de desempeo de un mtodo nuevo, modificado o caracterizado en forma
inadecuada. Debera originar especificaciones numricas y descriptivas para el desempeo e incluir
una descripcin detallada y precisa del objeto de inters (colonia positiva, tubo o placa)
Caractersticamente, la validacin primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayo
especialmente diseados.
Los laboratorios que desarrollan un mtodo "en casa" o una variante de una norma existente deben
realizar los pasos de validacin primaria.
4.2.2. Validacin secundaria
La validacin secundaria (tambin llamada verificacin) tiene lugar cuando un laboratorio procede a
implementar un mtodo desarrollado en otra parte.
La validacin secundaria se centra en la reunin de evidencia acerca de que el laboratorio est en
capacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validacin primaria.
Normalmente, la validacin secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos
procedimientos empleados en la validacin primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempo
mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo ptimo y el trabajo slo requiere
tratar el procedimiento dentro de los lmites operacionales establecidos por la validacin primaria.
4.2.3. Mtodos equivalentes
Es necesario aplicar dos mtodos en forma paralela sobre las mismas muestras al desarrollar un
mtodo en casa y tambin al reunir informacin para justificar el uso de un mtodo alternativo.
El desempeo del mtodo consta de muchos aspectos. No existe un nico ensayo de equivalencia de
mtodo, ni criterios numricos para l. Un mtodo puede ser superior en especificidad, pero inferior
en recuperacin.
4.3.
Detectores
Con frecuencia resulta conveniente denominar detector al medio nutriente en su contenedor. Se

emplean dos tipos de detectores: slidos y lquidos, en diferentes variantes de mtodos
microbiolgicos. Adems, en la mayora de los casos, se asocian con diferentes principios de
enumeracin o deteccin: lquido con P/A y NMP, y slido con recuentos de colonia.
Todas las formas de validacin en microbiologa se centran en el desempeo de los
detectores.
El conjunto de tubos (NMP) o la serie de placas (contables) empleadas para anlisis se denomina
conjunto de deteccin o conjunto detector. Cada NMP de tubo individual es un detector P/A.
4.3.1. Comparaciones de detectores
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Para la mayora de mtodos de recuento de colonia se puede producir una contraparte lquida con la
misma composicin qumica pero con la matriz slida (agar, filtro de membrana).
El efecto del ambiente slido puede evaluarse comparando recuentos de colonia con el clculo NMP
equivalente siempre a que la reaccin para reconocimiento de objeto sea la misma en ambos tipos de
detectores y el nmero de tubos paralelos sea lo suficientemente grande para la precisin adecuada.
Adems se puede evaluar la sensibilidad de los detectores de P/A mediante comparaciones de
lquidos-slidos similares.
4.4.
Caractersticas de Desempeo
Las caractersticas de desempeo deberan ser cuantificables y susceptibles de ensayo para usarse
en validacin.
La terminologa sobre caractersticas de desempeo en esta norma, en su mayor parte, sigue el uso
quimiomtrico. Puesto que las definiciones originales de los trminos no siempre encajan con los
mtodos microbiolgicos a la perfeccin, stas han sido modificadas y adaptadas, de acuerdo con las
necesidades.
Las caractersticas de desempeo tratadas en esta norma se relacionan con el objeto (lista de
situaciones y tipos de muestras donde el mtodo es aplicable), la precisin, linealidad, recuperacin,
lmites de trabajo en trminos del ms bajo y ms alto nmero de colonias recomendable por placa,
selectividad, especificidad y estabilidad (rugosidad).
4.5.
Especificaciones
Las especificaciones son expresiones numricas o cualitativas de caractersticas de desempeo o de

lmites de trabajo derivados de ellas. La validacin primaria debe ofrecer lo siguiente:
a) Identificacin morfolgica del (presunto) objeto
b) Declaraciones con respecto a las condiciones de incubacin (temperatura, tiempo, gas,
atmsfera, humedad) y caractersticas de los medios (pH, estabilidad)
c) Una declaracin en cuanto a los lmites de trabajo confiables en trminos de colonia o
nmeros de placa por detector (placa, nmero ms probable , filtro de membrana)
d) Expresiones de incertidumbre dentro de lmites confiables especificados
e) Objeto y limitaciones
5.
PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIN
La validacin casi necesariamente ocurre en pasos. Las investigaciones de desempeo real del
mtodo deberan estar precedidas por una bsqueda del intervalo de trabajo confiable en la que el
desempeo del mtodo es pertinente. Cualquier comparacin de recuperacin entre dos mtodos
debera limitarse a casos para los cuales son confiables ambos mtodos.
5.1.
Validacin Primaria
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5.1.1. Identificacin de objeto

Los estudios de cultivos puros durante el desarrollo inicial del mtodo proporcionan la descripcin
bsica de las colonias objeto o tubos P/A. Obviamente, se debe ensayar ms de una cepa de cultivo
puro del objeto.
Se debe probar la validez de la descripcin bsica empleando el mtodo candidato en una seleccin
representativa de muestras naturales. Se ensayan las presuntas colonias objeto, placas o cultivos
aislando los cultivos y realizando ensayos de confirmacin apropiados. Las presuntas colonias noobjeto o tubos negativos se ensayan de la misma manera.
Se deben calcular los valores numricos de sensibilidad, selectividad, tasas de falsos positivos y
falsos negativos y eficiencia.
Se corrige la descripcin del objeto, si es necesario.
5.1.2. Incertidumbre del recuento y sensibilidad al tiempo
Despus de que se ha definido adecuadamente la morfologa del objeto, el mtodo se emplea
tentativamente sobre una coleccin de muestras naturales.
Se estudia la confiabilidad de lnea de base de los recuentos mediante recuento repetido de las
colonias de las placas de muestras dentro de un corto tiempo. Si va a trabajar ms de una persona en
el laboratorio con el mtodo, todos deben participar.
5.1.3. Otras caractersticas de robustez
Si existen dudas acerca de los efectos de la temperatura de incubacin, la humedad o la atmsfera
de gas, stas deberan estudiarse mediante ensayos especiales que involucren la incubacin de submuestras paralelas bajo las condiciones alternativas.
5.1.4. Lmite superior de trabajo
Habiendo establecido las condiciones "ambientales" y las caractersticas del objeto, el siguiente paso
es explorar las limitaciones cuantitativas del detector en cuestin.
Esto puede realizarse con un nico tipo de experimento: una serie finamente graduada de diluciones
o volmenes, con paralelos. El ejercicio ofrece los datos para evaluar el lmite superior sobre la base
de proporcionalidad y repetibilidad.
5.1.5. Precisin
El laboratorio responsable de introducir un nuevo mtodo debera tambin ser el responsable de
ofrecer los valores iniciales de sus clculos de precisin. Estos deberan incluir clculos de
incertidumbre de recuento y repetibilidad bsica y clculos de reproducibilidad de diferentes
repeticiones (placas paralelas, series de dilucin paralela, matrices).
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Otros laboratorios requieren esta informacin para su validacin secundaria del mtodo y
subsecuentemente para establecer los sistemas de control de calidad analtico.
5.1.6. Veracidad y recuperacin relativa
La recuperacin absoluta (veracidad) del analito microbiolgico es inmensurable, lo cual representa
un problema en la validacin primaria de un nuevo mtodo.
5.2.
Validacin Secundaria
Se deben obtener numerosas muestras naturales. Las muestras divididas o series de dilucin
duplicadas se estudian con estriado paralelo. Se practica el recuento duplicado con el fin de verificar
el desempeo de recuento esperado.
Se debe aislar y verificar numerosos presuntos positivos (por lo menos 100). Las caractersticas de
desempeo categricas se calculan y comparan con los valores especificados, si se encuentran
disponibles.
6.
ESQUEMA DE UNA VALIDACIN
6.1.
Caso 1 - Mtodo Normalizado
El laboratorio que va a utilizar un mtodo normalizado debe verificarlo contra sus especificaciones de
validacin, atendiendo los requisitos para el aseguramiento de la calidad, y no necesita validarlo.
Esta verificacin permite demostrar que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente (el
uso corresponde al propsito para el que fue desarrollado, con respecto a la propiedad medida,
matriz, rango, equipos utilizados, repetibilidad, etc.).
En la mayora de los casos se puede considerar que en el desarrollo de los mtodos normalizados se
han tenido en cuenta todos los aspectos necesarios relativos a la validacin.
Al presentarse el caso de no haber evidencia suficiente para deducir que se ha llevado a cabo una
correcta validacin, el laboratorio usuario deber definir un procedimiento para calcular y evaluar los
parmetros de desempeo que considere necesarios para asegurar la confiabilidad del mtodo.
6.2.
Caso 2 - Mtodo No Normalizado:
El laboratorio que va a modificar un mtodo normalizado debe revalidarlo para demostrar que las
especificaciones del mtodo original no se ven afectadas por la modificacin introducida. El nivel de
revalidacin requerido aumenta conforme la magnitud de los cambios realizados.
Se consideran cambios menores, por ejemplo, la modificacin del tamao de la muestra y sustitucin
de reactivos.

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Se considera cambio mayor, por ejemplo, el cambio de procedimiento o equipo y cambios en el

alcance (aplicacin a matrices que no se especifican).
Para demostrar que una versin modificada de un mtodo cumple las mismas especificaciones que el
mtodo original, se deben realizar comparaciones utilizando rplicas. El diseo experimental y el
anlisis de los resultados deben ser estadsticamente vlidos.
El laboratorio usuario de un mtodo normalizado modificado debe verificarlo contra sus
especificaciones originales, o de revalidacin, y as demostrar que domina el ensayo y lo utiliza
correctamente.
En el caso de mtodos no normalizados, los terceros que los desarrollan son responsables de incluir
en dicho proceso la etapa de validacin, para demostrar que el mtodo cumple con los criterios de
aceptacin adecuados para el propsito de aplicacin; el laboratorio usuario debe verificar el
desempeo del mtodo contra sus especificaciones de validacin y as demostrar que domina el
ensayo y lo realiza correctamente.
6.3.
Caso 3 - Mtodo desarrollado por el laboratorio:
El laboratorio que desarrolla y utiliza sus propios mtodos debe validarlos, para demostrar que
cumplen con los criterios de aceptacin adecuados para el propsito de aplicacin.
Una vez est en uso el mtodo, el laboratorio debe verificar su desempeo contra los parmetros de
validacin, para demostrar que sigue dominando el ensayo y lo realiza correctamente.
6.4.
Revisin de los mtodos de ensayo incluidos en el alcance
Como parte de la revisin se debe incluir, pero no circunscribirse a, lo indicado a continuacin:

Para confirmar que el mtodo se ajusta al uso previsto en el laboratorio es necesario determinar su
desempeo (verificar) conforme una o una combinacin de las siguientes tcnicas, segn lo
establecido en la nota NTC/ISO/IEC 17025, adoptada como un criterio de acreditacin para
laboratorios de ensayo y calibracin:

La calibracin utilizando patrones de referencia o materiales de referencia

La comparacin con resultados obtenidos por otros mtodos
Las comparaciones interlaboratorios
La evaluacin sistemtica de los factores que influyen en el resultado
La evaluacin de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento cientfico de
los principios tericos del mtodo y en la experiencia prctica.
An cuando se haya realizado la validacin del mtodo, el laboratorio tendr que verificar
peridicamente que se cumplen los parmetros de desempeo documentados por parte de la
organizacin que lo desarroll, modific y/o public.
Para esta verificacin el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras inoculadas o materiales de
referencia incorporados a las matrices ms representativas. Tambin tiene que tomar en cuenta los
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resultados obtenidos de las auditoras internas y externas de sus sistemas de gestin, dejando
registro de las verificaciones.
La documentacin de la modificacin, actualizacin, validacin y verificacin del mtodo debe incluir
registros de la determinacin de los parmetros de desempeo, limitaciones de su aplicabilidad,
procedimientos para control de calidad, calibracin y control de documentos. Estos registros deben
estar disponibles a solicitud de los miembros del equipo evaluador durante las visitas en sitio, ya sea
de evaluacin para la acreditacin, seguimiento o reevaluacin.
Los procedimientos y responsabilidades para el desarrollo, validacin, verificacin e implementacin
de los mtodos deben ser descritos en detalle dentro de la documentacin del sistema de calidad del
laboratorio. Los diagramas de flujo son una herramienta para describir el procedimiento; para
mtodos complejos tambin se pueden utilizar programas informticos de gestin de procesos. El
personal responsable debe dejar establecidos los requisitos mnimos de calidad antes de empezar el
proceso de validacin e implementacin del mtodo, o mejor an establecerlos antes de comenzar
todo el proceso de desarrollo.
6.5.
Validacin de anlisis microbiolgicos
De acuerdo con ENAC los mtodos de anlisis microbiolgicos cualitativos y cuantitativos deben ser
validados estimando, cuando sea apropiado, los parmetros de desempeo que se indican en el
cuadro siguiente, utilizando mtodos estadsticos apropiados.
Propsito del Ensayo/
Parmetros del Mtodo
Exactitud relativa
Repetibilidad
Reproducibilidad
Sensibilidad
Desviacin positiva
Desviacin negativa
Especificidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Efecto matricial
Anlisis Cualitativo
Anlisis Cuantitativo
+
+
+
No se valida
+
+
+
+
No se valida
+
+
+
+
+
+
+
+
No se valida
+
+
NOTA:
(-) Significa que este parmetro normalmente no se evala.
(+) Significa que este parmetro normalmente se evala.
6.5.1. Para las pruebas rpidas

Para los anlisis cualitativos que detectan metabolitos, drogas, microorganismos, hormonas y otros,
en fluidos corporales, aguas, alimentos, etc., por medio de pruebas rpidas (tales como ensayos
inmunocromatogrficos tipo cassette, aglutinacin, etc.), se debe aplicar los mismos criterios de
validacin que los especificados en las pruebas convencionales.

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Para la verificacin del desempeo del mtodo en uso, como mnimo se debe determinar la
sensibilidad (lmite de deteccin), especificidad (deteccin inequvoca) y los otros parmetros de
desempeo declarados por el fabricante de la prueba y los requeridos por las normas.
Es importante mencionar que entre las pruebas rpidas, algunas son empleadas exclusivamente para
tamizaje o discriminacin, por lo que los resultados positivos requieren de un anlisis confirmatorio
posterior, cuyo principio metodolgico sea diferente.
6.5.2. Para los anlisis automatizados
En el caso de utilizar pruebas normalizadas o validadas por el fabricante del equipo automatizado, el
laboratorio deber proceder a una verificacin de la metodologa.
El laboratorio que emplee equipo automatizado deber comprobar la calibracin del mismo al
momento de su instalacin y que sta cumpla con los requerimientos de la casa comercial.
As mismo, peridicamente deben emplearse controles comerciales (negativos y positivos) y correrlos
como muestras en la rutina del laboratorio; adicionalmente debe comprobarse que los resultados de
los controles analizados se encuentren dentro del rango permisible para el anlisis, con el objeto de
verificar el buen funcionamiento del equipo. Como parte de la verificacin continua del desempeo de
los mtodos analticos automatizados, es especialmente recomendable que el laboratorio participe en
programas de comparacin entre laboratorios.
Segn los criterios internacionalmente vigentes para el aseguramiento de la calidad de los resultados
de los laboratorios analticos planteados por ICH (Chan et al), la validacin de un mtodo que usa
equipo automatizado requiere cualificar el sistema de hardware y software correspondiente y as
establecer su capacidad y confiabilidad de funcionamiento bajo las condiciones adecuadas de uso. La
cualificacin del sistema se simplifica si los fabricantes y proveedores de los equipos cumplen con la
norma ISO 9001; el proceso de cualificacin debe abarcar las etapas de instalacin, operacin y
desempeo del sistema.
El laboratorio debe contar con un procedimiento documentado de cualificacin que contenga, entre
otros componentes, las pruebas a realizar, los correspondientes criterios de aceptacin y los formatos
para el registro de datos y resultados. La cualificacin de instalacin permite establecer si el sistema
recibido cumple con las especificaciones de fabricacin y fue debidamente instalado.
La cualificacin de operacin permite establecer si, al quedar instalado el sistema integrado, o sus
mdulos, estn funcionando de acuerdo con las especificaciones operacionales del caso; se lleva a
cabo haciendo pruebas con analitos en muestras especficas para ello. Y, por ltimo, la cualificacin
de desempeo permite demostrar si el sistema cumple con los requisitos definidos acorde a las
necesidades del usuario; sta se puede llevar a cabo corriendo las aplicaciones analticas de
particular inters para el usuario.

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7.
DIAGRAMA DE UNA VALIDACIN

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8.
BIBLIOGRAFA
APHA/AWWA/WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20th
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Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y. C., Zhang, X.M. (Eds.). Analytical Method Validation and
Instrumentation Performance Verification. Wiley-Interscience. USA. 2004
CITAC/EURACHEM. Guide to Quality in Analytical Chemistry. An Aid to Accreditation 2002.
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ENAC. G-ENAC-04:2002 Gua para la acreditacin de laboratorios que realizan anlisis
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EURACHEM. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
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Garfield, F. M. Principios de Garanta de Calidad para Laboratorios Analticos. AOAC
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ICH. Harmonised Tripartite Guideline Q2A Text on Validation of Analytical Procedures.
International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use. 1994.
ICH. Harmonised Tripartite Guideline Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology.
International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use. 1994.
ILAC. ILAC-G18:2002 The Scope of Accreditation and Consideration of Methods and Criteria
for the Assessments of the Scope in Testing.
ISO. Standard ISO/TR 13843:2000 Water quality Guidance on Validation of Microbiological
Methods.
GTC 84. CALIDAD DEL AGUA. GUA PARA LA ORIENTACIN ACERCA DE LA VALIDACIN DE
MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICOS

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Caso 1 - Mtodo Normalizado

Caso 2 - Mtodo No Normalizado:

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Se considera cambio mayor, por ejemplo, el cambio de procedimiento o equipo y cambios en el

Caso 3 - Mtodo desarrollado por el laboratorio:

Revisin de los mtodos de ensayo incluidos en el alcance

Como parte de la revisin se debe incluir, pero no circunscribirse a, lo indicado a continuacin:

La calibracin utilizando patrones de referencia o materiales de referencia

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