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SANTO ANDRÉ
FEVEREIRO / 2010
Sumário
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................3
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................5
3. METODOLOGIA...............................................................................................................5
3.1. Materiais ......................................................................................................................5
3.2. Métodos .......................................................................................................................5
4. RESULTADOS ..................................................................................................................6
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................9
6. CONCLUSÃO..................................................................................................................11
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................11
8. ANEXOS ..........................................................................................................................13
8.1. Anexo 1 - Exercício ...................................................................................................13
8.2. Anexo 2 – Tabela de dados espectrofotômetro..........................................................13
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1. INTRODUÇÃO
O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de
medida estão duas formas principais de verificação de misturas a espectroscopia e a
espectrofotometria.
Espectroscopia é a separação, detecção e registro de mudanças de energia
envolvendo núcleos, átomos, íons ou moléculas. Essas mudanças podem ser
decorrentes de emissão, absorção, dispersão da radiação eletromagnética ou
partículas. [1]
Já a espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos
de onda entre o ultravioleta e o infravermelho, seus valores estão especificados na
Tabela 1. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luz monocromática
através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa
solução. Um prisma contido no aparelho separa a luz em feixes com diferentes
comprimentos de onda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática
através da amostra. O equipamento permite saber que quantidade de luz é
absorvida a cada comprimento de onda. [2]
Tabela 1 – Divisão do espectro eletromagnético na região do infravermelho até o ultravioleta.
Região Denominação
>16 µm Infravermelho distante
16µ m até 2,5 µm Infravermelho no NaCl
2500nm até 780nm Infravernelho próximo
780nm até 380nm Visível
380nm até 200nm Ultravioleta próximo
200nm até 10nm Ultravioleta no vácuo
A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da
amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert –Beer (Eq. (1):
Aλ = ε λ cl (1)
2. OBJETIVOS
Esta experiência tem por objetivo compreender os conceitos e aplicações da
espectrofotometria.
Também são objetivos determinar o espectro UV-visível do complexo formado
entre os íons Cu2+ e as proteínas, utilizar o comprimento de onda de máxima
absorbância para elaboração de curva-padrão e determinação de absortividade e
calcular a concentração de proteínas de uma solução de albumina.
3. METODOLOGIA
3.1. Materiais
• Reagente de Biureto pré-preparados.
• Água destilada.
• Espectrofotômetro.
• Cubeta.
• Papel absorvente macio para limpeza das cubetas.
• 2 micropipetas volumétricas.
• Estante com 8 tubos de ensaio.
• Agitador tipo vórtex..
• Soluções-padrão de soro albumina bovina (BSA) com as concentrações
em %(m/v): 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,75.
• Amostra de concentração desconhecida.
3.2. Métodos
Adicionou-se 0,5 mL das amostras de diferentes concentrações em cada tubo
com auxílio de uma das micropipetas e um tubo com apenas água – denominado
branco. Em seguida com o uso da outra micropipeta foram adicionados 1,0 mL de
água destilada para completar 1,5 mL de solução.
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4. RESULTADOS
Pretende-se preparar 100mL da solução de biureto, as unidades de % (m/v)
representam x g de soluto para 100mL de solução, para o CuSO4 0,15 % (m/v) é
necessário 0,15g e para o tartarato de sódio e potássio 0,06% (m/v) é necessário
0,06g. Já para o NaOH (0,75 mol/L), temos:
0,75 mol - 1L 1 mol - 40g
X – 0,1 L 0,075 mol - Y
X = 0,075 mol Y= 3 g de NaOH
Figura 1 – Curva-padrão.
De posse do valor de comprimento de onda utilizou-se tal valor e mediu-se a
absorbância em cada amostra (Tabela 2).
Concentração % Absorbância
0,125 0,07
0,25 0,12
0,5 0,23
0,75 0,33
1 0,44
1,25 0,52
1,75 0,62
Desconhecida 0,19
Como b = 1cm,
5. DISCUSSÃO
Como pode ser observado no decorrer do relatório, os resultados obtidos
permitem que se possam fazer análises, as quais podem estabelecer elementos de
comparação com as teorias existentes, bem como obter subsídeos didáticos, que
constatados na prática fortalecem e retificam a base teórica.
No decorrer do experimento, depois que os 9 tubos de ensaio foram
preenchidos, foi possível fazer a comparação devido a coloração. Além das
constatações quantitativas a cerca da amostra desconhecida, que estabeleceu a
comparação com as demais, também foi possível fazê-la tomando como base as
colorações das amostras, as quais tiveram variação de seu gradiente, onde as
amostras com maior concentração apresentavam cores mais escuras. A título de
observação, já poderia se constatar o intervalo da concentração da amostra
desconhecida, pois sua coloração ficou entre aquelas dos tubos 2 e 3, ou seja,
0,25% e 0,5%, respectivamente. Entretanto, há a necessidade de se determinar com
maior precisão, a medida do possível, quanto ao valor da concentração, como a
função do gráfico Absorbância x Concentração aproxima-se de uma reta, pôde-se
estimar a concentração da amostra desconhecida.
Conforme observado graficamente, existe um comportamento da absorbância
em função da concentração, considerando uma mesma substância. Sendo esta a
mesma, ao serem utilizadas amostras com concentrações diferentes, a absorbância
varia na mesma proporção, pois é diretamente proporcional. Intuitivamente faz
sentido, seguindo a linha de raciocínio baseada no fato de que quanto maior é o
número de partículas, maior concentração, maior é a probabilidade de fótons serem
absorvidos e, consequentemente, maior será a absorbância. Entretanto, embora não
seja possível visualizar neste experimento, para altas concentrações, a curva
padrão, depois de um certo ponto, tende a ser uma curva. [5]
A absorbância seria, de maneira grosseira, uma medida quantitativa para se
obter a quantidade de luz absorvida. Em contrapartida, existe uma outra variável que
está relacionada a absorbância denominada transmitância, que seria o quanto foi
transmitido, sem absorção, de luz. Existe uma relação simples entre estas duas
variáveis, determinada como:
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da mesma cubeta para mais de uma medição, pode acontecer de haver alguma
alteração de concentração, embora tenha ocorrido a medição na ordem crescente,
se existe uma concentração baixa no recipiente e nele é acrescido uma de
concentração maior, esta tende a ser diminuída. Embora as quantidades restantes
na cubeta sejam pequenas, não se pode descartar tal possibilidade.
Embora as micropipetas volumétricas tenham boa precisão, ainda existe um
certo erro aplicado a ela, mínimo, porém existente.
Os erros citados até então são previsíveis, porém existem outros que não são,
como o manuseio. Devido a se tratar de manuseio humano para a realização das
tarefas que não dependem da medição por instrumento, podem ocorrer
determinados erros, como, por exemplo, a colocação de maneira inadequada ou não
totalmente perfeita da substância no tubo de ensaio, o que faz com que possa haver
alguma pequena mudança.
6. CONCLUSÃO
Pode-se concluir, a partir da análise dos resultados e da teoria aplicada, que a
espectrofotometria, apesar das limitações, enunciadas no anexo deste relatório, é
um método que permite analisar compostos sensíveis à luz (em destaque a
albumina, utilizada neste experimento).
Tal método permite, além da medição da concentração, a identificação dos
compostos de determinada substância, através de comparação de resultados
obtidos por outros métodos, previamente calibrados.
A absortividade obtida, que é numericamente igual ao coeficiente angular da
reta obtida na Figura 2, vale 0,3528 Lcm-¹mol-1 e a concetração 0,40% (m/v).
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
8. ANEXOS
8.1. Anexo 1 - Exercício
Descreva o princípio do método de Biureto para a dosagem de proteínas,
relacionando suas vantagens e desvantagens em relação a outros métodos para
dosagem de proteínas.
Resp.: