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  • Acido Lactico

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    Luis Ivan Calderon Castillo
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    obtencion de acido lactico por bacilus delbrueki

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    Acido lactico

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    di 7
    REVISTA COLOMBIANA DE CIENCIAS QUIMICO-FARMACEUTICAS OBTENCION DE ACIDO LACTICO POR FERMENTACION CON Lactobacillus delbrueckii bulgaricus ‘MIGUEL FEOLJ BONILLA* CARLOS ESCOBAR GUARIN- RODRIGO MARIN MAHECHA RESUMEN EI sustrato compuesto por sacarosa y suero de sangre de res, utilizado para la produccién de dcido léctico, «través de Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. frecealmicroorganismo Jos nutrientes necesarios para un buen crecimiento, bajo con- diciones éptimas de pH (5,5 - 6.0) temperatura de 48°C. La velocidad maxima de crecimiento del microorganismo ‘obtenido bajo estas condiciones es del orden del 0,068 fh aun inéculo del 1,0% y disminuye hasta legar a valores del orden, del 0,024%h con inéculo 2,5%; lo contrario sucede con su crecimiento en masacelular obiomasa;est2aumentaamedida que se aumenta el porcentaje de inéculo, partiendo de re ‘miento del 0,10% aindculos del I,0% hastallegar a0,65% con indculo det 2,5%. La mayor produccién que brinda este medio es del orden del 81,25% para una concentracién de sacarosa de 60g un ingulo del 2,59; mientras que su mayor productividad fuede 0,37 g/lh a.una concentracién de sacarosa de i00g/l y un inéculo de 2,5%., SUMMARY ‘The substrate composed by sucrose and bovinum blood serum used for the production oflacticacid using Lactobacillus, delbrueckii bulgaricus as innoculum has the nutrient required for a good growth in optimun conditions: pH (5.5 - 6.0) and temperature (48° C), * Departamento de Farmacia. Facuitad de Ciencias. Universidad "Nacional de Colombia, AA, 14490. Santalé de Bogota. Colombia, ‘The maximun growth rate under these conditions was 0,068/h with 1.0% innoculum and decreases to 0.024/h with 2.5% innoculum. On the contrary the biomas increases with the inoculum starting from 0.10 for 1.0% innoculuen up to 0.65, for 2.5% inoculum. ‘The highest yield using this medium was 81.25% with 60, ‘pf sucrose concentration and 2.5% innoculum and and the maximun productivity was 0.57g/h at 100 g/l sucrose concentration and 2.5% inoculum. INTRODUCCION Este trabajo se ocupa de la obtencién de dcido Iéctico por medio de una fermentacién homoléctica, utilizando como microorganismo fermentador Lactobacillus delbruekii bulgaricus, que produce Scido lictico a partir de glucosa, sacarosa, almidén de papa, los cuales son reducidos a ‘monosacéridos; utiliza como fuente denitrégeno, proteinasde malta, a pH 5.5 y temperatura de 48°C. (1,2). Una modificacién de este método se presenta en este trabajo, que consiste en adicionar como fuente de nitrogeno, proteins provenientes del suero de sangre de res (residuos de matadero). Este sustrato enriquecido reporta mayor rendi- rmiento y eficiencia en la produccién de dcido lactico.(1, 2). Enel pais se producen unas 200,000 toneladas anuales de sacarosa, de las cuales gran parte son consumidas y el resto se exporta (3), parte de esc excedente podra ser usado para la ‘obtencién de acide Iéctico, por medio de procesos biotec- aol6gicos. PARTE EXPERIMENTAL. El disefio experimental se lev6 a cabo en cuatro partes, la primera es la identificacién, cuantificacién y mantenimiento del microorganismo en cepa pura, la segunda parte consisteen un No. 23 1995 REVISTA COLOMBIANA DE CIENCIAS QUIMICO-FARMACEUTICAS la obtencién y esterilizacién del suero de sangre de res, la tercera es la realizacién de la fermentaci6n y la cuarta parte describe el método de cuantificaciGn del 4cido lctico, des- pués de haber terminado la fermentacién. IDENTIFICACION ADAPTACION, CUANTIFICACION DEL Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Elmediode mantenimientoparala familiaLactobacillaceae yporendedelLactobacillus delbrueckii bulgaricus, eselagar el caldo MRS. (Man, Rogosa y Sharpe 1960). (I, 4). ara mantener el cultivo puro y vivo se inocula aproxima- damente 0.5 gde liofilizadoen SOm! de caldoMRS y se incuba 2.48 °C durante 24 horas; después se efectiian inoculaciones sucesivas cada tercer dfa, en un nuevo caldo MRS. Laadaptaci6n del microorganismo al medio de fermenta- cin se da en forma gradual, usando un medio de adaptacién, ‘aque esel encargado de pasar! microorganism del medio ‘demantenimiento aun nuevo medio de caracterfsticas diferen- tes.(5). Sacarosa 1.0% ‘Suero de sangre de res, 10% Fosfato didcido de potasio 0.1% ‘Sulfato de amonio 01% Sulfato de Magnesio Heptahidratado 0.05% Tiamina 005% Agua destilada c-s.p. 100.0 Se inocula este medio de adaptacién con 10.0% (v/v) del microorganismo del medio de mantenimiento y se procede a incubar a 48 °C durante 24 horas, realizando control de esterilidad al medio.(6), Una vez adaptado el microorganism se procede a cuanti- ficarlo en el medio de transporte, mediante a) siembra en superticie y b) peso seco; (7). Con lo cual se podré calcular lapoblacién microbiana por mililtro, sabiendo que se evalua- rin concentraciones de inéculo de 1.0 a 2.5% (viv). REALIZACION DE LA FERMENTACION. Para la cual es necesario tener en cuenta dos factores: a) Concentracisn del inéculo, de 1,0% a 2,5% (v/v). 'b) Concentracién de las fuentes de carbono y de nitrogeno en el medio fermentable, Del segundo factor, se toma como fuente de carbono la sacarosa no refinada (cruda) en concentraciones que van de 6% l 12% (piv). Ya que la sacarosa no debe ser menor del 5% porque es improductivo e insuficiente para el crecimiento del microorganismo y només del 18% porque causa inhibicién del crecimiento, debido al aumento de la presién osmética. La fuente de nitrdgeno debe permanecer constante y nomenordel 20% en (p/v), para llevar una fermentacién eficiente (5). Al sustrato se le adiciona tiamina en una proporcidn de 0.005%, pues es un requerimiento vital para su crecimiento. Composicién general del medio de fermentacion: Fuente de carbono Sacarosa de 6% a 12% (piv) Fuente de niceégeno Suero de sangre de res 20% Sustancias reguladoras de pH. Carbonato de calcio, Tiamina Tiamina 0.005% Agua destilada c.s.p. 1 itro, Estos substratosson inoculados conel microorganismo,en cabina de flujo laminar. Se incuban durante 120 horas a 48° =, 2,6). ‘Método de andlisis de la cinética de fermentacién. Para la valoracién de Ia cinética de crecimiento del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus en la fermentacién se realiza determinacién de azdcar, biomasa y produccién de Acido léctico. Losmétodos utilizados enel desarrollo del trabajo guardan la_maxima confiabilidad, exactitud y precisién. Los cuales ermiten conocer lacinéticade fermentacién en formaexacta ¥ Népida. La toma de la muestra se realiza cada 12 horas, debido a 4que la fermentacin es lenta y no seria. cuantitativo tomar muestras en tempos mas corts. (8). Ladeterminacién de azticares se realiza por el método de co-toluidina, el cual se basa en la formacién de un complejo base de Schiff entreelaldehido y lao-toluidina, La coloracién cs medida espectrofotométricamente a 635 nm (9, 10). La determinacién de biomasa por peso seco se reaiza tomando un medio de cultivo en donde se ha sembrado el microorganismo, este medio de volumen conocido se filtra mediante una membrana de(0,22 micras de didmetro de poro, Ja cual es calcinada hasta peso constante, con este dato se realiza una curva de calibracién para las determinaciones posteriores de biomasa por densidad éptica.8, 11, 12, 13). Ladeterminacién de Acido léctico utiliza el método de valoracién con NaOH por potenciometria diferencial. (14). un No. 23 1995 [REVISTA COLOMBIANA DE CIENCIAS QUIMICO-FARMACEUTICAS RESULTADOS ¥ DISCUSION. De acuerdo aa metodotogiaestablecida paraeste estudio, se divide la presentacién de los resultados en tres parts. IDENTIFICACION, ADAPTACION Y CUANTIFICACION Tdentificaci6n del microorganismo. Alrrealizar observaciones microscépicas con tincién de Gram del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus en medio Iiquido y s6lido de la cepa pura y del inéculo a utilizar en las fermentaciones se comprobs la identidad de! bacilo por las caracterfsticas microscépicas que presenta: Bacilo no cesporulado, largo simple y en cadenas Gram positivo y por las, ‘caracteristicas macroscépicas observadas encuantoa: tamaiio, 1-3 mm, forma circular, aspecto untuoso, color blanco crema, borde dentado, elevacisn plana, caractersticas comunes en inéculo sembrado en medio s6lido como en la cepa pura cconcidiendo con las caracteristicas reportadas en la literatu- 1a, 15). Adaptacién del microorganismo. La adaptacién del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus se realiza como se describi6 anteriormente, obteniendo los siguientes resultados. TABLA 1. INOCULO DE 10% T = 48°C pH 5,5 - 6,0 ‘TIEMPO CRECIMIENTO 18 Horas + 24 Horas +H 35 Horas + Se observa que gn el medio de adaptacién presenta un bbuen crecimiento el microorganismo alas 24 horas bajo las ‘condiciones establecidas de pH y temperatura. Tabla No. 1 ‘Cuantificacién del microorganismo. Después de haber adaptado el microorganismo al nuevo medio de crecimiento se procede a cuantificarlo.(7). Obteniendo los siguientes resultados. TABLA 2. CUANTIFICACION DEL MICROORGA- NISMO DILUCION Ul Vertido Superficie 10% >300 >300 107 3300 300 10? 287 >300 10" 150 269 108 30 176 108 30 30 Como se ve ena tabla No.2 la mejor dilucién corresponde a 10: endonde la poblacién cuantificable esta entre 30y 300u.fc.,queeslorecomendado. En estadilucién se determiné el peso seco y se realizaron diluciones para construfr la curva patrén, VALORACION DE LOS CONSTITUYENTES DEL SUSTRATO Y DE LA CINETICA DE FERMENTACION. Nutrientes del sustrato. En [a tabla No. 3, serelacionan las cantidades de sacarosa, tiamina y proteina en relacién al porcentaje de inéculo adicio- nado en cada una de las 16 fermentaciones. TABLA 3. composiciON DE LOS MEDIOS Y FERMEN- TTACIONES A REALIZAR NumeRO De] conceNTRAGION | FORCENTAEE | FORCENTAE | PORCENTAE eswetacion | pesacarosa | pewocuto | DETIANINe | DEPROTENA 1 60 10 | 0005 | 20 2 80 10 | 000s | 20 3 100. i0 | 0.005 | 20 4 120 10 | 0.005 _| 20 5 66 1s | 000s | 20 6 80 15 | 0005 | 20 7 100 us | 000s | 20 8 120 15__| 000s | 20 9 60 20 | 000s | 20 10 80 20 | 000s | 20 u 100 20 | ooos | 20 12 120 0 | 0095 | _20 13 60 25 | 0005 | 20 14 80 25 | 0005 | 20 15 100 25 | 000s | 20 16 120 25 | 000s | 20 un No. 23 1995 REVISTA COLOMBIANA DE CIENCIAS QUIMICO-FARMACEUTICAS. Se partié de sustancias de un porcentaje de pureza determinado, no de reactivos puros. En el caso de la sacarosa se utilizé un mismo lote para surtir todos los balones de fermentaci6n, mientras que el suero de sangre deres, se tomo de varias reces, se reunié en un solo lote y se analiz6 la cantidad de proteina total. Los resultados de estas valoracio- nes se muestran en la tabla No.4 TABLA 4. vALORACION DE LOS CONSTITUYENTES DEL SUSTRATO, ‘CONSTITUYENTE, sre) | _CONCENTRACION ‘Sacarosa cruda del Ingenio del Cauca S.A. | 98.2% ‘Suero de Sangre de res *65/100ml Carbonato de CalcioR.A | 99.9% Tiamina, 5.000 UL +*6.5 gramos de proteina (Nitrégeno) por 100 ml de suero. Evaluacién de los parametros cinéticos de las fermen- taciones, Estos pardmetros se analizan en dos partes: )curvas cinéticas de biomasa, producto y sustratoresidual. ») productividad y eficiencia de cada una de ellas. Anilisis de las curvas cinéticas de fermentacién, Curva cinética del crecimiento bacteriano. De acuerdo con los datos obtenidos en biomasa y de la curva correspondiente en cada una de las 16 fermentaciones, elerecimiento del Lactobacillus delbrueckii bulgaricus tiene tun comportamiento de crecimiento exponencial durante las primeras 75 horas de fermentaciGn, en la mayorfa de las ellas después sufre un descenso en el crecimiento, permaneciendo constante por un tiempo, para luego volver a subir. Esto nos ‘muestra un tipico comportamiento de crecimiento bacteriano. ‘Como todas las fermentaciones presentan este tipo de comportamiento, es necesario buscar nuevos parémetros de comparacién entreellas. Unodeestos es a velocidad méxima de crecimiento de! microorganismo en el medio de fermenta- cién y de acuerdo a los resultados obtenidos de biomasa, se determina la velocidad maxima de crecimiento delLacto- bacillus delbrueckii bulgaricus (mmax) para cada una de las. fermentaciones, en la fase exponencial, por medio de la cexpresién matemitica que representa la velocidad de creci- miento bacteriano.(14). La velocidad de crecimiento en as fermentaciones oscila entre 0.024 a 0.064 hen las diferentes concentraciones de ingculo y de sacarosa, esta velocidad es baja, lo que confirma que la fermentacién es lenta, aproximadamente siete dias dependiendo del porcentaje de inéculo, y laconcentracién de sacarosa. La velocidad maxima de crecimiento, no varia significativamente sobre todoen los inéculos 1.5% y 2.0% que son los de concentracién intermedias. Esto se debe a que los, pardmetros externos a que estén sometidos, como son: presiOn osmética de 10s. diferentes medios, cantidad de células son similares y afectan la velocidad méxima de crecimiento de igual forma, Curva cinética de formacién de dcido léctico. Para evaluar la cinética de formacién de dcido léctico, hacemos uso del modelo matematico de Luedeking y Piret (16), que relaciona en forma lineal, la concentracién de biomasa y la produccién de écido léctico. Paraladeterminacién de as constantes del modelo cinético de Luedeking y Piret, se parte de la ecuacién de la recta que presenta en la correlacién lineal P(t) Vs X(t) y su expresién matematica es: PW A+ BPX(). En la tabla No. 5. se reportan las constantes de! modelo cinético para cada una de las fermentaciones. Alanalizar por separado el efecto de la concentracién del microorganismo sobre las constantes, se aprecia que b es ‘mayora concentraciones de inéculo del 1.5% y 2.0% y menor, a concentraciones de inéculo de 1.0% y 2.5%. a partir de la ecuacién: b= (P(t) -Pey( XE * (Lo) Para queb tenga valores altos, Xf debe ser bajo, esto ocurre cuando se trabaja a concentraciones de microorganismo entre 1.0% y 2.0%, lo cual indica, que permanece constante la concentracién celular, a un rendimiento bajo. Como se ve en la tabla No. 5. A partir de laecuacién B=(am +b)'m se observa que para ‘obtener valores altos de las constantes b (Constante asociada ‘al mantenimiento celular) y m ( Velocidad méxima de creci- ‘miento) deben ser pequefias lo cual se lograa concentraciones, de inéculo del orden de 2.5%, por lo que el inéculo recomen- dado es el de 2.5%, aunque b indique lo contrario, ya que el efecto de aes mucho mayor que el de b para la concentracién, de indculo estudiado. Existe unarelacién directaentre ay’, lo, un No. 23 1995 [REVISTA COLOMBIANA DE CIENCIAS QUIMICO-FARMACEUTICAS que corrobora la funcién de a en el modelo cinético de produccién, Cinética de consume de sustrato. Para realizar el estudio de la cinética del sustrato es necesario tener en cuenta el balance de materia de sustrato, Al observar las curvas de consumo de sustrato, se aprecia «que los puntos experimentales se ajustan al modelo propuesto, lo que indica que el Lactobacillus delbrucckit bulgaricus, ‘consume sacarosa para el manienimiento celular, crecimiento y produccién de dcido lctico, de una manera creciente y linet EVALUACION DE LA PRODUCTIVIDAD Y PRODUCCION, Laproductividad y la produccién son analizadasal cabo de 120 horas de fermentacién. Senotaqueamedidaque aumentac! porcentajede inéculo de Lactobacillus delbrueckii bulgaricus y se disminuye la concentracién de sacarosa, auments fa produccién de la fermentacién y viceversa si disminuye la concentracién del in6culo y aumentalaconcentracién de sacarosa, disminuye la produccién.Estosedebe aque si aumenta la presién osmética del sustrato, se produce un efecto inhibitorio en el crecimiento del microorganismo; pero si aumentael inéculo y dismiauye laconcentraciénde sacarosaen el sustrato, por ende lapresién cosmética del medio, 1a praduccién aumenta hasta un 81.2%.(17) En cuanto a la productividad (Qp) se observa en forma ‘general, que esta aumenta a medida que se eleva la concentra- ign de inéculo y de sacarosa en el medio de fermentacién, Figura No.|. Enel porcentaje de inéculo del 1.0% y 60 g/l de sacarosa, la productividad es del orden de 0.21 g I hy, mientras que para la misma concentracién de inéculo, pero 120 g/l de sacarosa la productividad es de 0.27 g I" h. La productividad va aumentando a medida que aumenta el porcentaje de inéculo y la concentracién de sacarosa. La productividad también aumenta a medida que aunienta la masa celular, aumentando asf la cantidad de enzimas ‘metabdlicas que procesan la sacarosa del medio. Lo que se demuestra con a productividad observada en la fermentacién No. 15, donde a un porcentaje de inéculo de 2.5% y una concentracign de sacarosa de 100 g/l, se obtiene una produe- tividad del 0.57 g I'h para un cultivo por lotes. TABLA 5. RESULTADOS DELA CORRELACION LINEAL P(T) Vs. X(F), COEFICIENTES DEL MODELO CINETICO DE LUEDEKING YY PIRET, BIOMASA FINAL, VELOCIDAD ESPECIFICA DE CRECIMIENTO Y CONCENTRACION DE ACIDO LACTICO No. 23 1995 EVISTA COLOMBIANA DE CIENCIAS QUIMICO-FARMACEUTICAS FERMENTACION 15 SACAROSA, BIOMASA, NITROGENO A. LACTICO Sucarova, Nixégeno y Aetico (wal) y——————eernrreeoorerrrer 1700, = ae 100 0 400 Cf 0 a 0 178 a1 265 415 655 715 955 1015 120 ‘Tiempo de fermentacién (Horas) 0 FERMENTACION 19 SACAROSA, BIOMASA, NITROGENO, A. LACTICO 0 © 10 20 30 40 60 60 70 8 90 100 110 120 ‘Tiempo de fermentacién (Horas) © Biomasa * Witrogeno + Ac. Lictico * Sacarosa [-+Biomasa * wixégeno + Ac, hctico * Sacarosa Figura 1. EVALUACION DE LOS PARAMETROS CINETICOS A CONCENTRACIONES ALTAS. Paracomprobar, siel Lactobacillus delbrueckiibalgaricus se comporta de igual forma a concentraciones extremas de sacarosa, ya sean bajas oaltas, alas recomendadas por Sharpe E. (1). y a porcentajes elevados de inéculo, se realizan tres fermentaciones adicionales, la combinacién de estos dos fac- tores aparecen en la tabla No. 6. TABLA 6. EVALUACION DE Los PARAMETROS CINETICOS A CONCENTRACIONES ALTAS DE SACAROSA. FERMENTACION | INOCULD | Sog | Xogl | tto(horas | Yxs% a 1.0% | 160 | 0.100} 41.5 | 022 18 10.0% | 160 | 100] 415 | 027 19 10.0% | 60 | 100] 415 | 1.97 ‘So Concentracién de sacarosa. Para estas tres tiltimas fermentaciones, se mantiene cons- tante la concentracién de protefna 20 g/l el pH y la tempera- ‘ura, como en las fermentaciones precedentes. En la figura No. 2 se observa, que la velocidad de creci- miento yelrendimientoen masacelular, aumenta con especto alas anteriores fermentaciones. Al aumentar el porcentaje de inéculo mejorael rendimiento de sustrato en biomasa y al disminuir el efecto inhibitorio por cconcentracién de sustrato el resultado es mayor. Tabla No. 6. Figura 2. Porotra parte ise analiza la productividad y rendimiento

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