CUANTIFICACIN DE PROTEINAS

Wilson Elas Alfonso; Walter Ignacio Cervantes; Silvia Alexandra Gil

OBJETIVO:

Manejar en el laboratorio el mtodo de Biuret para determinar protenas.

Hacer uso de los equipos adecuados para la cuantificacin de protenas.
Recordar las leyes bsicas de absorcin de luz para la determinacin
cuantitativa de compuestos coloreados.

INTRODUCCIN
Las protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente
distribuidos en el organismo y esenciales para la vida. Actan como elementos
estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas,
anticuerpos, factores de coagulacin, etc.
La protena ms abundante en plasma es la albmina. Una de sus funciones ms
importantes es la de permitir el transporte de cidos grasos, hormonas esteroides,
bilirrubina, catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso. La
concentracin de albmina en plasma influye notablemente en el mantenimiento
de la presin coloidosmtica, lo que estara relacionado con su relativamente bajo
peso molecular y su gran carga neta.
Para la determinacin de protenas totales se utiliza el mtodo de Biuret; cuyo
nombre se debe al Biuret, una molcula formada a partir de dos molculas de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva a esta reaccin. El
reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (de NaOH o KOH).
La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la
formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces
peptdicos, presentando un mximo de absorcin a 580 nm.

MARCO TEORICO
Espectrofotometra: Se denomina espectrofotometra a la medicin de la
cantidad de energa radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de la
longitud de onda, de la radiacin, y a las mediciones a una determinada longitud
de onda. La principal aplicacin de la espectrofotometra es la determinacin de

las concentraciones ya sea de sustancias qumicas o de microrganismos

presentes en una solucin.
Cmo funciona un espectrofotmetro? El funcionamiento de un
espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y
calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de
longitudes de onda. Ley de Beer-Lambert Es una relacin emprica que relaciona
la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado.

Donde:
I1, I0: Son las intensidades saliente y entrante respectivamente.
A=lc: Absorbancia
L: Longitud atravesada por la luz en el medio
C: concentracin del absorbente en el medio

La ley de Beer tiene en cuenta el rea y el nmero de partculas qu atraviesa un

haz de luz, deduciendo de esto la energa que queda atrapada. La ley de BeerLambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad
saliente despus de que en dicho medio se produzca absorcin. La relacin entre
ambas intensidades puede expresarse a travs de la siguiente relacin:
Saliva: es un lquido algo viscoso, que es segregado al interior de la boca por
diversas glndulas. Cada una de estas glndulas contribuye a la composicin de
la saliva con un conjunto de sustancias, caractersticas de cada una de ellas, y
que est formada por protenas, glicoprotenas, lpidos, y est compuesta por:
Agua 96%
Moco, de efecto lubricante (mucopolisacaridos y glicoprotenas)
Iones (sodio, potasio, cloro, fosfato, bicarbonato y calcio)
Sustancias orgnicas como urea, cido rico y hormonas
Enzimas: amilasa salival o ptialina (inicia la digestin de los
carbohidratos), la galactosidasa (descomponen la galactosa) y la lisozima
(destructora de bacterias).
Globulina (Inmunoglobulina A).
Protena R que protege a la vitamina B12 unindose a ella.

 Todo ello le otorga un pH de 6.3-6.8.

Clulas
Opiorfina, que es una sustancia analgsica
Composicin qumica de la habichuela:
Hechos
Nutrici
onales

por
1
taza

Energa

142
kj
34
kcal

Proten
a

2g

Carbohi
drato

7,84
g

Azca
r

1,54
g

Grasa

0,13
g

Grasa
Satura
da

0,02
9g

Grasa
Mono
insatur
ada

0,00
6g

Grasa
Poliins
aturad
a

0,06
5g

Coleste
rol

0 mg

Fibra

3,7 g

Sodio

7 mg

Potasio

230
mg

Alanina [mg]
Arginina [mg]
Ac. asprtico
[mg]
Ac. glutmico
[mg]
Cistina [mg]
Fenilalanina
[mg]
Glicina [mg]
Histidina [mg]
Isoleucina [mg]
Leucina [mg]
Lisina [mg]
Metionina [mg]
Hidroxiprolina
[mg]
Prolina [mg]
Serina [mg]
Tirosina [mg]
Treonina [mg]
Triptfano [mg]
Valina [mg]

aminocidos
100,00
100,00
333,00
244,00
24,00
73,00
85,00
49,00
110,00
140,00
140,00
34,00
0,00
89,00
129,00
50,00
93,00
27,00
130,00

Composicin de la orina: En los seres humanos, la orina normal suele ser un

lquido transparente o amarillento. Se eliminan aproximadamente 1,4 litros de
orina al da. La orina normal contiene un 95 % de agua, un 2 % de sales minerales
y 3 % de urea y cido rico, y aproximadamente 20 g de urea por litro. Cerca de la
mitad de los slidos son urea, el principal producto de degradacin
del metabolismo
de
las
protenas.
El
resto
incluye nitrgeno, cloruros, cetosteroides, fsforo, amonio, creatinina y cido rico.
Composicin de la orina en g/100 ml de fluido:
Urea: 2,0; cido rico: 0,05; Sales inorgnicas: 1,50

Fundamento de la prueba
El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la
formacin de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo
presenta un color violeta caracterstico, que se puede observar a 310nm o 480580nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos
de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para
formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado
entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxgeno y de
nitrgeno del pptido. Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de
tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret estable; es necesario considerar
la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en configuracin tris
y amoniaco. Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y
los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu 2+ se acompleja
con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad
de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera
que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se
recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados.

DATOS Y RESULTADOS

Preparar 50 mL de solucin estndar que contenga (20 mg/mL):

20 mg/mL=

20
mg sto=

mg sto
x 100
50 mL

mg
50 mL
mL
=10 mg
100

Preparacin de muestra de habichuela:

Peso inicial de
Volumen de agua para
8,533 g
habichuela
homogenizar (licuado)
Volumen total de muestra (diluida)
Tabla 1. Dilucin de la habichuela

25 ml
75 mL

Muestra
Volumen
Orina
Saliva sobrenadante
5 mL
Saliva precipitada
Habichuela
Tabla 1.1 Volumen de muestras
TUBO

ALBUMINA
ESTNDAR

AGUA

BIURET

Blanco
1
2
3
4
Orina
Habichuela
Saliva sobrenadante
Saliva precipitado

Tabla 1.2 Datos

------2,5 mL
5,0 mL
7,5 mL
10 mL
---------------------

10 mL
7,5 mL
5.0 mL
2,5 mL
--------------------------

1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
0.5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL