NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. METODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE SULFITO REDUCTORES E DE Clostridium perfringens. ENTO DE COLONIAS microbloiogta de. almentos: proto Clostridium suifito ad po lel Coiebiano de Nemes, Teunlasy Carendin (CONTEC) Apartado 14237 Bogols, D.C. Fax. 2221635 Prohibida su reproduccionPROLOGO. EI Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificacion, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacién, segin el Decreto 2269 de 1993, ICONTEC es una entidad de caracter privado, sin animo de lucro, cuya Misién es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccién al consumidor. Colabora con el sector gubemamental y apoya al sector privado del pais, para lograr ventajas competitivas en los mercados intemo y externo. La representacién de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacién Técnica est garantizada por los Comités Técnicos y el periodo de Consulta Publica, este ultimo caractetizado por la participacion del ptiblico en general La NTC 4834 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2000-07-26. Esta norma esta sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacién se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participacién en el Comité Técnico 000031 Microbiologia. ALPINA S.A. HACIENDA SANTA HELENA ASINAL IBLAB, BIOQUILAB Lida. INVIMA CARULLA Y CIA. LABORATORIO GRAM COLOMBINA S.A. LABORATORIO PROCALIDAD. COLSUBSIDIO MEALS S.A. CONDIMENTOS EL REY MERCK EMPRESA DE ACUEDUCTO Y NULAB LTDA, ALCANTARILLADO DE BOGOTA, QUIOS LTDA FRIGORIFICOS SUIZO S.A. SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD ‘Ademas de las anteriores, en Consulta Puiblica el Proyecto se puso a consideracién de las siguientes empresas: ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A Ica, ALGARRA INGENIO PROVIDENCIA S.A. AQUALAB INGENIO RIOPAILA ASEBIOL LA CAMPINA S.A. BAVARIA S.A. LLOREDA GRASAS S.A BIOASESORIAS MAYAGUEZ S.A. CASA LUKER S.A, MINISTERIO DE SALUD CERVECERIA LEONA NESTLE S.A. ‘COMPANIA NACIONAL DE CHOCOLATES PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL CONGELAGRO PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. CREPES & WAFFLES PROCESADORA DE LECHE S.A. DISASA, PRODUCTORA DE JUGOS S.A. FRIGORIFICOS COLOMBIANOS S.A. RICA RONDO GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. TRES M COLOMBIAUNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO. PUBLICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA UNIVERSIDAD DE LOS ANDES ICONTEC cuenta con un Centro de Informacién que pone a disposicién de los interesados ‘normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCION DE NORMALIZACIONNORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. METODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES E IDENTIFICACION DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS, ‘TECNICA DE RECUENTO DE COLONIAS INTRODUCCION Debido a la gran variedad de productos alimenticios para consumo humano y animal, es Posible que este método no sea apropiado para algunos productos. En este caso, si es absolutamente necesario por razones técnicas, se pueden usar diferentes métodos que son especificos para estos productos. Sin embargo, se har todo lo posible para aplicar este método horizontal. En la préxima revision de esta norma se tendra en cuenta toda la informacion disponible, concerniente al grado de empleo del método, y las razones de las desviaciones de éste, en el caso de productos particulares. La armonizaci6n de los métodos de ensayo puede no ser inmediata, pero para algunos grupos de productos pueden existir normas internacionales o nacionales que no cumplen con este método horizontal. Se espera que cuando estas normas sean actualizadas, se modifiquen para cumplir con esta norma, de manera que eventualmente las tinicas desviaciones de este método horizontal serén las necesarias por razones técnicas bien establecidas. 4. OBJETO La presente norma describe un método horizontal para el recuento de Clostridium sutfito feductores e identificacién de Clostridium perfringens viables en productos destinados para ‘consumo humano o aninal 2, REFERENCIAS NORMATIVAS Las siguientes normas contienen disposiciones que, a través de su referencia en este texto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicacién eran validas las ediciones indicadas. Todas las normas estén sujetas a actualizacion y se recomienda a las partes que realizan acuerdos con base en esta norma, estudiar la posibilidad de aplicar las ediciones més recientes de las normas indicadas enseguida. Los miembros de ISO e IEC llevan registros de las normas internacionales validas actualmente,NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 NTC 4491:1998, Microbiologia de alimentos y de alimentos para animales. Preparacién de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los analisis, microbioldgicos. Parte 1. Reglas generales para la preparacion de la suspensién inicial y de NTC 4092:1998, Microbiologia de alimentos y de alimentos para animales. Requisitos generales para el examen microbiolégico. (ISO 7218) 3. DEFINICIONES Para los propésitos de esta norma, se aplican las siguientes definiciones: 3.1 Closiridium sulfito reductor: bacilo, .gram(+), esporulado que tiene la propiedad de reducir el idn sulfito a sulfuro en presenglal dé Stes de hierro dando colonias negras. confirmacién positiva cuando esta norma, 33 Recuento deG ti r ntimero de bacterias Clostridium pert 1 de muestra, cuando el mismo medio. 42 8 debe acordar entre las partes interesad 4.3 Recuento de las colonias caracterfsticas. 4.4 Confirmacién del ntimero de colonias caracteristicas y céloulo del nimero de Clostridium sulfito reductor por millitro 0 gramo de muestra. 8. DILUYENTE, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 6.1 GENERALIDADES Véase la NTC 4092.NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 5.2 DILUYENTE Véase la NTC 4491 y las normas especificas de los productos que van a ser examinados. 5.3 MEDIOS DE CULTIVO PARA RECUENTO EN PLACA 5.3.1 Agar triptosa-sulfito-cicloserina libre de yema de huevo (SC)' 5.3.4.1 Base 5.3.1.1.1 Composicion Triptesa” 15.09 Soytona!™ 509 Extracto de levadura 509 ‘Bisulfto de sodto anhidro (Né»S20s) 109 Citrato” do amonio -ferico (I) 109 Agar 9,092 18.09" ‘Agua 4.000 mi °) Los nombres de triptosa y soytona se usan en fa aclualided por algunos produclores de medios. Se pueden usar otras caseinas pancredticas o cigestores de soya que den resullados comparables Es conveniente que este reactive conionge por lo menos 15 % (mim) de herr "1 _Dependiendo de la concentracién de gel del agar. §.3.1.1.2 Preparacion. Se disuelven los componentes en agua, por ebullicién. Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilizacién sea de 7,6 + 0,2, a 25°C. Se vierte la base en matraces o botellas de capacidad apropiada. Se esteriliza durante 15 min a 121°C. 5.3.1.2 Solucién D-Cicioserina 5.3.1.2.1 Composicién D cicloserina”™ 409 Aqua 100 mi __Usar polvo blanco cristalino solamente. 5.3.1.22 Preparacion, Se disuelve la D cicloserina en agua y se esteriiza la solucién por filtracion. sto fue originalmente disefiado como EY-lbre TSC (Hauschid and Hisheimer, App. Microbiol, 27,1974 pp 78-82), 3NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 Se almacena en ei refrigerador a +3 °C £2 °C. La solucién se debe desechar después de 4 semanas de preparada 5.3.1.3 Medio completo. Inmediatamente antes de su uso en el método de vertido en placa (véase el numeral 9.2), se adiciona a cada 100 mi de base fundida estéril (vase el numeral 5.3.1), enfrlada a 47 °C #2 °C, 1 mide solucién de D-cicloserina (véase el numeral 5.3.1.2). 5.3.2 Agar selectivo para perfringens (SPS) 5.3.2.1. Composicién Peptona de caseina 5.3.3.1 Composicién [Poptona do caseina Extracto de levadura Citrato férico (I) Sulfto sédico 109 Polmixing-B sulfato 0.029 Neomicina sulfato 9.059 Agar AguaNORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 5.3.3.2 Preparacién, Se disuelven los componentes en agua. Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterlizacion sea de 7,2 + 0,2 Se esteriliza con cuidado en la autoclave durante 10 min a 121 °C. El medio debe ser ulilizado, en lo posible, el mismo dia de su preparacion. 6.4 MEDIO FLUIDO DE TIOGLICOLATO En ausencia de Resazurina y agar, se llama CALDO DE TIOGLICOLATO 5.4.1 Composicién Digerido enzimatico de easelna 1609 L- Cisteina 059 D-glucosa 589 Extracto de levadura 509 [Cloruto de sodio 269 Tioglicolato de sodio(mercaptoacetalo) O89 Agar 0.592,09” Resazurina 0,001 9 ‘Aqua 1.000! }?__Depende do ta concontracién de gel del agar 6.4.2 Preparacién Se disuelven los componentes en agua, por ebullcién, Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterilizacién sea de 7,1 + 0,2, a 25°C. Se vierten porciones de 10 ml en los tubos de ensayo y se esterilizan a 121 °C durante 16 min, Antes de utlizarlo, el medio se debe desairear. 6.5 CALDO DE CARNE COCIDA 5.5.4 Composicién Corazén de buey desecado 30.09) Peptona o proteasa de pepiona 2009 D (+) Glucisa 209 Cloruro de sodio 509 Agua 4.000 mtNORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 6.5.2. Preparacién Se disuelven los componentes en agua, por ebullicién. ‘Se ajusta el pH de tal forma que después de la esterlizacion sea de 7,0 + 0,2 Se vierten porciones de 10 ml en los tubos de ensayo y se esteriizan a 121 °C durante 15 min. Si el medio no se utiliza ef mismo dia en que es esterilizado, antes del uso, se deben eliminar fos gases por medio de una corriente de vapor o en un bafio de agua hirviendo. 6.6 MEDIO LACTOSA SULFITO (LS) 6.6.1 Medio base Se vierten porciones® seestetiizan a 121°C 6.6.2 Solucién de bisulfite deg 5.6.2.1 Composicién. Bisulfite de sodio (Nax$205), anhideo 129 Agua 400 mt 5.6.2.2 Preparacién. Se disuelve el bisulfito de sodio en agua y se esteriliza la solucién por filtracion. La solucién se debe usar el mismo dia.NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 5.6.3 Solucién de citrato de amonio férrico (Ill) 5.6.3.1 Composicién [Civato de amonio terico (il) 409 Ag 400 mi 5.6.3.2 Preparacién. Se disuelve el citrato de amonio férrico (ill) en agua y se ester solucién por fltracion. La solucién se debe usar el mismo dia. 6.6.4 Medio completo En caso de que no se utilice of dia de la preparacién, se calienta el medio con corriente de vapor durante 10 min para eliminar ef oxigeno disuelto y enfriar rapidamente con agua de grifo. Si el medio esta en botellas de rosca, se aflojan las tapas antes del calentamiento y se aprietan antes de enfriamiento. Luego se adicionan 0,5 ml de solucién de bisulfito de sodio (véase el numeral 5.5.2) y 0,6 ml de solucién de citrato de amonio férrico (Ill) (vease el numeral 5.5.3) a cada 8 ml de base (véase el numeral 5.5.1). 6.7 MEDIO MOTILIDAD NITRATO 5.7.1 Composicion Extracto de carne 309 Peptona 509 Nitrato potésico 109 Agar 309 Agua 1.000 m! 6.7.2 Preparacion Se disueiven los componentes en agua, por ebullicién. Se enfria hasta 50 °C a 60 °C y se ajusta el pH, de manera que después de la esterilizacion sea de 7,0 +0,2 a 25°C. Se vierten porciones de 10 ml en tubos o frascos con tapa rosca y se esterllizan a 121 °C durante 15 min,NORMA TECNICA COLOMBIANA _NTC 4834 5.8 REACTIVO DE GRIESS 6.8.1 Composicién Naftlamina Acido sutanttico 1009 Acido tartaico. 6.8.2 Proparacion ‘Se mezclan los componentes y se envasan.en.un frasco color ambar. 5.9 POLVO DE ZINC 6.10 MEDIO LACTOSA GE| 5.10.1 Composicion 6.40.2 Preparacion Se disuotven el extracto de agua. Se suspende la gelatind disolucién. Se mezclan las dos Se ajusta el pH, de 7,2 0,2. Se adiciona la solucion de rojo de fenol y se mezcla. Se vierlen porciones de 13 ml en tubos 0 frascos con tapa rosca y se esterilizan a 121 “ durante 15 min. 6. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO El equipo usual de microbiologla (véase la NTC 4092) y en particular, el siguiente: 6.1 Equipo para esterilizacién en seco (horno) o para esterilizacién hémeda (autoclave) véase la NTC 4092.NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 6.2 Incubadora capaz de mantenerse a una temperatura de 36 °C # 2 °C, dependiendo de la temperatura acordada, 6.3 Recipiente anaerobio, o cualquier otro aparato apropiado pata cullivo anaerobio, 6.4 — Medidor de pH, capaz de dar lecturas con aproximacién a + 0,01 unidad de pH a 25 °C, y que permita realizar mediciones con una exactitud de 0,1 unidad de pH, 6.5 Asas de platino-Iridio © niquel-cromo, con un didmetro aproximado de 3 mm, 0 asa recta. 6.6 Aparato de filtracion para la esterilizacion de soluciones. 6.7 — Tubos de ensayo, botellas o matraces con la capacidad apropiada, en particular, tubos de ensayo de 16 mm x 160 mm con tubos de Durham invertidos, por ejemplo de 35 mm de longitud y 7 mm de diametro. 6.8 _ Pipelas graduadas de entrega total, con capacidades nominales de 1 mi y 10 mi, graduadas en 0,1 ml y 0,5 ml, respectivamente. 6.9 — Cajas de Petri de plastico 0 de vidrio, de 90 mm x 100 mm de diémetro. 6.10 Bafio de agua o aparato similar, capaz de ser mantenido a 46 °C + 0,5 °C. 7. MUESTREO EI muestreo no es parte del método especificado en esta norma. Si no hay una norma espacifica que trate sobre o! muestreo del producto pertinente, se recomienda que las partes involucradas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto. Es importante que o! laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representaliva y que no haya sufrido cambio ni dafio durante su transporte o almacenamiento. 8, PREPARACION DE LA MUESTRA La muestra se prepara de acuerdo con la norma pertinente, aproplada para el producto involucrado. Si no hay una norma intemacional especifica, se recomienda que las partes involucradas leguen a un acuerdo sobre este aspecto. 9. PROCEDIMIENTO 9.1 PORCION DE ENSAYO, SUSPENSIONES INICIALES Y DILUCIONES Vease la NTC 4491y cualquier norma especifica apropiada al producto involucrado. 9.2 INOCULACION E INCUBACION Por duplicado, usando una pipeta estéril, se transfiere 1 mi de la suspensién inicial, o de la Muestra de ensayo, si el producto inicial es liquido, a los centros de las cajas de Petri vacias. Se vierten de 10 ml a 15 ml del agar (véase el numeral 5.3) mantenido en el bafio de agua, en la caja, y se mezcla bien con el inéculo, girando suavemente cada caja. Cuando el medio se ha solidificado, se agrega una capa de 10 mi del mismo agar y se deja solidificar. Se colocan 9NORMA TECNICA COLOMBIANA _NTC 4834 las cajas en recipientes anaerobios (véase el numeral 6.3) y se incuban a 36 °C + 2 °C durante 24 h -72 h. Se dobon obsorvar diariamente las cajas, La temperatura se debe acordar entre las partes involucradas y se debe registrar en él informe de ensayo, Se sigue el mismo procedimiento con las diluciones decimales posteriores. 9.3 RECUENTO Y SELECCION DE COLONIAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES, Después del periodo de incubacién especificado (véase el numeral 9.2), se conservan las cajas que contienen menos de 150 colonias en todas las diluciones y si es posible, en las diluciones posteriores y se debe realizar inmediatamante ef recuento de colonias negras de clostridium suifto reductores en cada caja. 9.4 CONFIRMACION BIOQUIMICA PARA Clostridium perfringens Nota. Las baterias bioquimicas disponit claim n usar de acuerdo con el numeral 9.6.5 de la rnoxma NTC 4092 Método A Se seleccionan toman las col solamente ‘absonum pede agar son pur ‘negras tomadas del vedio sulfito lactosa, medio SL por medio de una pipeta estéiif- Se incuban a 46 °C de 18 h a 24 h, en un bafio de agua (véase el numeral 6.10). 9.4.2 Interpretacion Los tubos de medio LS se examinan para determinar la produccién de gas y la presencia de color negro (precipitado de sulfuro de hierro). Los tubos Durham que tengan mas de 1/4 de gas Y los tubos que tengan un precipitado negro, se consideran positives. 10NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 En caso de duda, cuando el tubo Durham, en un medio ennegrecido tiene menos de 1/4 de gas, se transfieren inmediatamente 6 gotas del cultivo previo a otro tubo de medio LS, usando na pipeta estéril de medio LS (véase ef numeral 9.4.1) . Se incuba en el bafio de agua a 46 °C de 18 ha 24h. Se lee este tubo como se describié anteriormente. En todos los otros casos, los tubos se consideraran como negativos. Las bacterias que forman colonias caracteristicas en el medio SC y que dan una confirmacién positiva con el medio LS, se consideran como C, perfringens. Método B Se seleccionan de tres a cinco colonias caracteristicas de cada caja de agar SPS o TSN 0 SC, guardadas para el recuento y se siembra cada una en caldo de tioglicolato 0 caldo de carne cocida Se comprueba la pureza del cultivo haciendo frolis y coloracién de Gram. Se incuba en bafio de agua a 46 °C + 0,5 °C durante 3h- 4h. Luego, se siembran por puncién las pruebas bioquimicas, Se incuban a 36 °C durante 24 h - 48 h; no es necesario incubar en anerobiosis. Prueba de catalasa Se toman aproximadamente 3 mi de cada uno de los cullivos de medio tioglicolato y se mezela en otto tubo con 0,5 ml de perdxido de hidrégeno al 3 %. Si se liberan algunas burbujas de gas, se considera una reaccién positiva. Movilidad-nitratos. ‘Se observa el tipo de crecimiento a fo largo de a linea de picadura, Los microorganismos no méviles producen un crecimiento que se limita a la linea de picadura, mientras que un crecimiento difuso en el medio indica que el microorganismo es mévil Se comprueba la presencia de nitritos en el medio movilidad-nitratos, afiadiendo a cada uno de {os tubos unos miligramos del reactive Griess y se observa el color que presenta: el color rojo representa una prueba positiva de reduccién de nitratos. Sino hay cambio de color, debe efectuarse la prueba con polvo de Zinc. A los tubos negativos de ta prueba de Griess, se agrega una pequefia cantidad de polvo de zine: se agita, y si presenta color rojo es negativa para nitratos, si no cambia se considera posttiva Lactosa-gelatina. La fermentacién de la lactosa se evidencia por el cambio de color del medio a amarillo y ademés por la produccién de gas. Una vez lelda la fermentacién de ta lactosa, se colocan los tubos laclosa-gelatina en fefrigeracién por 10 minutos y se observa la licuefaccién de la gelalina; en caso de ser negativa, se incuba 24 h adicionales "4NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 Resultado que confirma la presencia de Clostridium pertringes Moviidad : Catalasa : Fermentacién de lactosa + Reduceién de nitrato * Licuetacci6n | + 40. EXPRESION DE LOS RESULTADOS 10.1 CALCULO DEL RECUENTL EXGOLONIAS DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES 10.1.1 Para las cajas que co menos 15. ntadas en todas las ‘al menos 15 colonias. Se toma como resultado el nimero de Clostridium sulfito reductores por millitro © por gramo de producto, expresado como un néimero entre 1,0 y 9,9, mulliplicado por la potencia de 10 apropiada. EJEMPLO. Un recuento directo (producto liquido) de Clostridium sullito reductores a 37 °C, en un medio para recuento en placa produjo dio los siguientes resultados: 12NORMA TECNICA COLOMBIANA _NTC 4834 En la primera dilucién retenida (10°): 66 colonias y 80 colonias. : En la segunda dilucién retenida (10%): 4 colonias y 7 colonias. Las inoculaciones se realizaron como sigue: - Para 66 colonias: 5 colonias, 4 de las cuales cumplieron con los criterios, entonces a=53. - Para 80 colonias: § colonias, 3 de las cuales cumplieron con los criterios, entonces a= 48. - Para 4 colonias: 4 colonias, 3 de las cuales cumplieron con {os critetios, entonces a=3, - Para 7 colonias: § colonias, 3 de las cuales cumplieron con tos criterios, entonces as4, Pa, sueaeedes Por lo tanto: y- te Gy Oat 2402) 10 Se redondea a dos cifras significativas, a saber: 50 000 6 5,0 x 10' Clostridium sulfito reductores por miliitro de producto, 10.1.2 Estimado de los numeros pequefios Si las dos cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos liquidos) 0 a la suspensién inicial (otros productos), contienen menos de 15 colonias de Clostridium sulfito reductores, se calcula el numero estimado de colonias Clostridium sulfito reductores confirmadas en cada caja, usando la ecuacién dada en el numeral 10.1. Se toma la media aritmética m de las colonias contadas en ambas cajas. Los resultados se reportan como sigue: a) Productos liquidos: - Numero estimado, Ne, de Clostridium sulfito reductores por mililitro. Ne=m 13NORMA TECNICA COLOMBIANA _NTC 4834 b) Otros productos: = Niimero estimado, Ne de Clostridium sulfito reductores por gramo. Ne = mid en donde des el factor de dilucion de la suspensi6n inicial, 10.1.3 Sin colonias Si las dos cajas_correspondientes suspensién inicial (otros productos) ge C. perfringens A eselntimero de colonias saleccionadas para confirmacién C ese! ntimero de colonias tipicas marcadas en la caja (véase el numeral 9.3). El resultado se redondea a un ntimero entero de colonias, 10.3 PRECISION Véase la NTC 4092 14NORMA TECNICA COLOMBIANA NTC 4834 14. INFORME DE ENSAYO El informe de ensayo debe especificar el método usado, la temperatura de incubacién y los resultados obtenidos. También se deben mencionar todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en los resultados. El informe de ensayo debe incluir toda la informacién necesaria para la identificacién completa de la muestra. DOCUMENTOS DE REFERENCIA [1] NATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs — Horizontal Method for Enumeration of Clostridium perfringens - Colony - Count Technique. Geneva: ISO, 1997. 10 p. (ISO 7937). [2] Manual de Técnicas de Analisis para control de calidad Microbiolégico de Alimentos para consumo humano. Ministerio de Salud, INVIMA. 1998 15