Artculo 1

Caracterizacin de dos inulinasas termoestable de Rhizopus oligosporus NRRL 2710

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1687157X14000389

Abstracto
Dos inulinasas (Inu2 y Inu3) se purificaron a partir de Rhizopus oligosporus NRRL 2710 mediante
cromatografa en DEAE-Sepharose y de Sephacryl S-200 columnas. El peso molecular de Inu2 y
Inu3 estaba determinado a ser de 76 y 30 kDa, respectivamente.Inu2 y Inu3 tenan el mismo pH
ptimo a 5,0, temperatura ptima a 50 y 60 C, y la estabilidad trmica de hasta 60 y 70 C
durante 1 h, respectivamente. Inu2 y Inu3 tenan valores bajos km (0,93 y 0,70 mm,
respectivamente) que indican la alta afinidad hacia la inulina. Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ y EDTA no
influy significativamente en la actividad de la enzima. Ni 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ y Co 2+ mostr un efecto
inhibidor parcial, y Hg 2+ tenido un fuerte efecto inhibitorio. P -Chloromercuribenzoate tena un
efecto inhibidor parcial sobre Inu2. A partir de estos hallazgos, R. oligosporus inulinasas pueden ser
enzimas beneficiosas para la produccin enzimtica industrial de jarabe de alta fructosa.

Palabras clave

Oligosporus Rhizopus ;
inulinasa ;
La purificacin ;
Caracterizacin

1. Introduccin
La inulina es un polifructano generalizada en las races y tubrculos de la alcachofa de
Jerusaln, achicoria, diente de len, bardana y dalia. Se compone de cadenas lineales de 2,1-ligado d residuos -fructofuranose terminado por un resto de glucosa a travs de un
enlace de tipo sacarosa en el extremo reductor [19] . La inulina ha recibido gran inters
como un material barato y abundante para la produccin de fructosa y fructooligosacridos,
que se utiliza en alimentos, bebidas y las industrias farmacuticas[19] .
La fructosa se puede obtener por la hidrlisis cida de inulina. La hidrlisis cida de la
inulina, sin embargo, no es un mtodo apropiado para la produccin de fructosa porque da
lugar a la formacin de anhdridos de difructosa, que no tienen una capacidad edulcorante
pero causan el color indeseable [19] . Por lo tanto, el uso de inulinasas microbianas se ha
propuesto como el enfoque ms prometedor para la obtencin de fructosa o
fructooligosacridos de inulina.
Enzimas inulina de hidrolizar se encuentran en plantas, hongos filamentosos, levaduras y
bacterias. Entre los hongos filamentosos, Aspergillus y Penicillium especies son comunes
inulinasa-productores [21] , [15] , [6] , [10] y [2] . Estudios anteriores han revelado que
varios microorganismos producen endoinulinase as como exoinulinase, por

ejemplo, Aspergillus
niger [15] , Aspergillus
ficuum [21] , Chrysosporium
pannorum[22] , Penicillium purpurogenum [12] y A. ficuum JNSP5-06 [18] , en el que tres
inulinasas de tipo exo y dos inulinasas de tipo endo se purificaron y se
caracteriza [13] . Inulinasa extracelular tambin se purific a partir de un hongo
filamentoso, Rhizopus sp. cepa TN-96 [14] . Anteriormente, hemos investigado algunos de
los aspectos fisiolgicos de Rhizopus oligosporus NRRL 2710 con especial referencia a los
relativos a la formacin de inulinasa termoestable utilizando hojas de alcachofa como un
posible sustrato [3] .Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue purificar y caracterizar dos
inulinasas termoestables a partir de R. oligosporus NRRL 2710.
2. Materiales y mtodos
2.1. Microorganismo
R. oligosporus NRRL 2710 se obtuvo de la coleccin de cultivos del Laboratorio de
Investigacin de la Regin Norte, USDA, Peoria, IL, EE.UU..
2.2. Condiciones de funcionamiento y crecimiento
El organismo se cultiva en 5% finamente molido hojas de alcachofa secos en agua como un
medio de crecimiento completo (pH 7,0) con un tamao de partcula de menos de 300
micrmetros. La incubacin se llev a cabo a 30 C durante 48 h en un agitador rotatorio
funcionando a 200 rpm. El caldo fermentado se filtr a travs de papel de doble capa
Whatman. Despus de la centrifugacin del filtrado a 4000 rpm durante 20 min, el
sobrenadante se recogi como el extracto bruto para la purificacin adicional [3] .
2.3. Purificacin inulinasa
Extracto crudo se dializ frente a tampn de acetato de sodio 20 mM pH 5,5 y se aplic a
una columna de DEAE-Sepharose (10 x 1,6 cm id) pre-equilibrada con tampn acetato de
sodio 20 mM pH 5,5. La columna se eluy con un gradiente por etapas de NaCl 0,0 a 0,3 M
en el mismo tampn a un caudal de 60 ml / h y fracciones de 3 ml. La absorbancia se
monitoriz a 280 nm. El perfil de elucin revel cuatro picos principales con actividades
inulinasa, que fueron designados como Inu1, Inu2, Inu3 y Inu4 por el orden de elucin. Las
fracciones Inu2 y Inu3 con la mayor actividad se agruparon, se concentraron por dilisis
frente a sacarosa slido, y se cargaron en una columna Sephacryl S-200 CL-6B (93 1,6
cm id) equilibrada con tampn acetato de sodio 20 mM pH 5,5. La columna se eluy con el
20 mM tampn de acetato sdico pH 5,5 a un caudal de 20 ml / h y fracciones de 3 ml.
2.4. Determinacin del peso molecular
El peso molecular se determin mediante la tcnica de filtracin en gel utilizando
Sephacryl S-200. La columna (93 x 1,6 cm id) se calibr con citocromo C (12.400),
anhidrasa carbnica (29.000), albmina de suero bovino (67.000), alcohol deshidrogenasa

(150.000) y -amilasa (200000). Azul dextrano (2.000.000) se utiliz para determinar el

volumen vaco (Vo). Peso molecular de la subunidad se estim por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida [4] . Desnaturalizado-SDS fosforilasa b (94.000), albmina de suero
bovino (67.000), ovoalbmina (43.000), anhidrasa carbnica (30.000), inhibidor de tripsina
de soja (20.000) y -lactoalbmina (14.200) se utilizaron para la calibracin.
2.5. Ensayo de inulinasa
Las actividades enzimticas se analizaron mediante la medicin de la concentracin de
azcares reductores liberados de inulina. La mezcla de reaccin (0,5 ml) que contiene
inulina 2 mM, tampn de acetato de sodio 0,05 M, pH 5,0 y 0,1 unidad de inulinasa se
incub a 40 C durante 1 h. El incremento en la reduccin de azcar se estim por el
mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico [11] . Se ley la absorbancia a 560 nm. Una unidad
de enzima se define como la cantidad de enzima que libera 1 mol de fructosa por h.
2.6. La determinacin de protenas
Se determin el contenido de protena como se ha descrito por Bradford [8] usando
albmina srica bovina como estndar. La protena en los efluentes de la columna se
monitoriz midiendo la absorbancia a 280 nm.
2.7. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad y la estabilidad inulinasa
El efecto del pH sobre la actividad de inulinasa se determin en el intervalo de pH 4,5 a 7,0
usando tampn de 0,05 M acetato de sodio (pH 4.5 a 5.5) y tampn de fosfato de sodio (pH
6,0 a 7,0). La temperatura ptima para la actividad inulinasa se determin mediante la
incubacin de las mezclas de enzima-sustrato a diversas temperaturas (10-80 C) en
tampn de acetato de sodio 0,05 M, pH 5,0 se midieron y los azcares reductores
liberados. La estabilidad trmica de inulinasa se midi en trminos de actividad residual
despus de la incubacin de inulinasa a diferentes temperaturas (10-80 C) durante 1 h
antes de la adicin del sustrato. Actividad en el tiempo cero se tom como 100% de
actividad.
2.8. km
Los valores de Km se determinaron a partir de grficas de Lineweaver-Burk usando
concentraciones de inulina de 0,2 a 1,0 mM.
2.9. Efectos de los iones de metal y otros productos qumicos sobre la actividad
inulinasa
Los efectos de cationes metlicos sobre la actividad inulinasa fueron investigados por la
preincubacin de la enzima con 2 mM Fe 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Hg 2+ ,
Ba + y Ni 2 + para 15 min antes de la adicin del sustrato. La actividad en ausencia de

cationes metlicos se tom como 100% de actividad. Los efectos de EDTA 2 mM y p chloromercuribenzoate sobre la actividad inulinasa se determinaron en las mismas
condiciones como se ha mencionado anteriormente.
3. Resultados y discusin
La purificacin de R. oligosporus inulinasa se resumi en la Tabla 1 . Desde el perfil de
elucin de la cromatografa en columna de DEAE-Sepharose (10 x 1,6 cm id) cuatro
inulinasas Inu1, Inu2, Inu3 y Inu4 fueron separados ( Fig. 1 ). Debido al nivel de actividad
baja de Inu1 y Inu4, purificacin adicional se limit a Inu2 y Inu3, que contena la actividad
ms alta. Una columna de Sephacryl S-200 se utiliz para obtener Inu2 y Inu3 (Fig. 2 ) con
la ms alta actividad especfica posible 3258 y 7238 unidades / mg de protena, lo que
represent
20
y
40
veces
mayor
que
la
de
inulinasas
de
GS115 / inu A1 [ 5] y Streptomyces sp. [20] , respectivamente.

Figura 1.
Un perfil de elucin tpica para la cromatografa de R. oligosporus inulinasa en columna de DEAESepharose (10 x 1,6 cm id) previamente equilibrada con tampn de acetato 20 mM de sodio, pH 5,5
a un caudal de 60 ml / h y fracciones de 3 ml.
la absorbancia a 280 nm,
unidades /
fraccin.

Figura 2.
Un perfil de elucin tpica para la cromatografa de R. oligosporus Inu2 (A) y Inu3 (B) fracciones
DEAE-Sepharose en la columna Sephacryl S-200 (93 1,6 cm id) previamente equilibrada con
tampn de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5 a un caudal de 20 ml / h y 3 ml fracciones.
la
absorbancia a 280 nm,
unidades / fraccin.

La homogeneidad de la purificado R. oligosporus Inu2 y Inu3 se demostr por la presencia

de una banda de protena nica en gel de SDS-poliacrilamida ( Fig. 3 ) .El peso molecular
de R. oligosporus Inu2 y Inu3 se estim en 76 y 30 kDa por filtracin en gel,
respectivamente. Estos pesos moleculares se confirmaron mediante SDS-PAGE (Fig. 3 ), y
estima que 76 y 30 kDa como nica subunidad. Diferentes pesos moleculares se ha
informado de inulinasas de A. ficuum (31-70 kDa) [13] , Streptomyces sp. (45 kDa)
[20] , Rhizopus sp. (83 kDa) [14] y candidus Aspergillus (54 kDa) [17] .

Figura 3.
SDS-PAGE para la determinacin del peso molecular de R. oligosporus inulinasa. (1) marcadores
de protenas, (2) de Sephacryl S-200 Inu2; (3) de Sephacryl S-200 Inu3.
El efecto del pH sobre la actividad de R. oligosporus Inu2 y Inu3 se examin. Como se muestra
en la Fig. 4 A, la enzima mostr que la actividad hidrolasa a partir 4,5-6,0 pH exhibido. Los
ptimos de pH fueron 5,0 en tampn de acetato de sodio 50 mM para las dos enzimas. Las dos
enzimas fueron estables durante 2 h en los mismos valores de pH (datos no mostrados). PH ptimo
similar fue reportado por inulinasas de A. ficuum (pH 4,5-5,0) [13] , Streptomyces sp. (pH 6,0) [20] ,
GS115 / inu A1 (pH 4,5) [5] , Aspergillus awamori (pH 4,5) [1] y Penicillium Janczewski (pH 4,8 a
5,0) [9] .

Figura 4.
pH ptimos (A), ptimos de temperatura (B) y la estabilidad de temperatura (C)
de R. oligosporus Inu2 y Inu3. Cada punto representa el promedio de tres experimentos.
R. oligosporus Inu2 y Inu3 se encontr que tenan ptima temperatura a 50 y 60 C,
respectivamente ( Fig. 4 B). Las actividades de las enzimas se redujeron gradualmente con
el aumento de la temperatura. Del mismo modo, los ptimos de temperatura para inulinasa
de A. ficuum [13] , GS115 / inu A1 [5] y Rhizopus sp. [14] eran alrededor de 40 y 55
C. La elevada temperatura ptima se inform para inulinasa de Streptomyces sp.(70
C) [20] . El efecto de la temperatura sobre la estabilidad trmica de R. oligosporusInu2 y
Inu3 se investig mediante la incubacin de la enzima durante 1 h en tampn de acetato de
sodio 50 mM, pH 5,0 a diferentes temperaturas que van de 10 a 80 C antes de la adicin
del sustrato ( Fig. 4 C). Inu2 y Inu3 fueron aproximadamente estable hasta los 60 y 70
C. Las actividades de las enzimas se redujeron gradualmente con el aumento de la
temperatura. Inu2 y Inu3 retuvieron 20% y el 40% de su actividad a 80 C,
respectivamente. Se obtuvieron resultados similares por Sharma y Gill [20] , donde
Streptomyces inulinasa era trmicamente estable hasta 70 C. Nakamura et al. [13]inform
de que los cinco A. ficuum inulinasas retienen el 80% de actividad relativa despus de 1 h
(precalentado a 50 C), pero slo se observ un 40% de actividad relativa despus de 1 h
(precalentado a 60 C). Por el contrario, inulinasa de Rhizopussp. mantenido estable hasta
30 C y se inactiv completamente a 60 C [14] .
La afinidad de la R. oligosporus Inu2 y Inu3 de inulina se determin mediante la
representacin de Lineweaver-Burk ( Fig. 5 ). Los valores de Km fueron 0,93 y 0,70 mM,
respectivamente. Estos valores de Km bajo indican la alta afinidad de las enzimas hacia
inulina. Los valores km moderadas se manifest en favor de inulinasas GS115 / inu A1 (km
2,57 mM) [5] y Streptomyces sp. (km 1,63 mM) [20] . Los altos valores de km haban sido
reportados para inulinasas de Debaryomyces Cantarelli (15 mM) [7] , Candida
salmenticensis (17 mM) [16] y A. ficuum (10-15 mM) [21] .

Figura 5.
Lineweaver-Burk parcelas relacionadas R. oligosporus Inu2 (A) y las velocidades Inu3 (B)
de reaccin a concentraciones inulina como sustrato. La mezcla de reaccin contena en 0,5
ml: tampn de 0,05 M acetato, pH 5, 0,1 unidad de enzima y concentraciones de inulina
que van desde 0,2 a 1,0 mM. Cada punto representa el promedio de tres experimentos.
El efecto de diferentes cationes metlicos en la concentracin de 2 mM
en R.oligosporus Inu2 y sistema de ensayo Inu3 se muestran en la Tabla 2 . Mg 2+ , Ca 2+ y
Zn2+ no influy significativamente en la actividad de la enzima. Ni 2+ , Cu 2+ , Fe 2 + y Co 2
+
mostraron efecto inhibidor parcial y Hg 2+ tenido un fuerte efecto inhibidor. El fuerte
efecto inhibidor observado con Hg 2+ sugiri que algunos -SH-grupos en la protena podran
ser esenciales para la actividad. Esto se ha observado para otros inulinasas
microbianas [21] , [5] , [20] y [17] . Varios artculos estudiaron el efecto de los cationes
metlicos en inulinasas. Ohta et al. [14] informaron de que Ni 2+ , Mg 2+ y Zn 2+ no tuvieron
ningn efecto significativo sobre Rhizopus sp. inulinasa. Sin embargo, Co 2+modula
positivamente inulinasa actividad en el Streptomyces sp . [20]

Tabla 2.

Adems, EDTA quelante de metales no tuvo efecto en R. oligosporus Inu2 y Inu3 ( Tabla
2 ). Esto est de acuerdo con un estudio previo [13] . Sin embargo, la actividad de inulinasa
de la Streptomyces sp. Fue fuertemente inhibida por EDTA que sugiere la posible
implicacin de metales para la enzima [20] . A partir de la Tabla 2 , tambin parece que p chloromercuribenzoate tena un efecto inhibidor parcial sobre Inu2 y ningn efecto sobre
Inu3. Una prdida apreciable de la actividad de inulinasa deRhizopus sp. se observ con p chloromercuribenzoate [14] . La inhibicin de la Inu2 porp -chloromercuribenzoate sugiri
que el sitio activo de la enzima contena residuos de cistena.

4. Conclusin
En conclusin, el Inu2 y Inu3 purificada a partir de R. oligosporus se caracteriza por pH bajo, alta
estabilidad trmica y alta afinidad hacia la inulina. A partir de estos hallazgos, Inu2 y Inu3
de R. oligosporus puede ser considerado como eficiente, as como enzimas beneficiosas que se
pueden utilizar para la produccin enzimtica industrial de jarabe de alta fructosa.

Referencias
Se encuentra una base de 20 Referencias registradas en el documento.

ARTICULO 2
Caracterizacin de un termo-tolerantes micelial -fructofuranosidasa de Aspergillus
phoenicis en fermentacin sumergida utilizando salvado de trigo como fuente de carbono
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878818115000705

Reflejos
Los altos niveles de fructofuranosidasa micelial se obtuvieron utilizando salvado de
trigo.
La enzima homodimrica se purific hasta la homogeneidad electrofortica.
El micelio fructofuranosidasa termo-tolerantes fue activada por Mn 2 + y Ag + .
La enzima hidroliza la sacarosa, rafinosa y la inulina con alta afinidad por la
sacarosa.
La enzima tiene potencial para una futura aplicacin biotecnolgica.
Abstracto
El hongo filamentoso Aspergillus phoenicis ( Aspergillus saitoi ) produce altos niveles de micelial
- D -fructofuranosidase (invertasa) cuando se cultiva en fermentacin sumergida utilizando un
medio Khanna con salvado de trigo como fuente de carbono durante 72 horas a 40 C, bajo
agitacin orbital (100 rpm). La invertasa micelial se purific 20 veces con la recuperacin de 24% a
travs de dos etapas cromatogrficas (DEAE-celulosa y Sephacryl S-200). La enzima se caracteriz
como una glicoprotena monomrica con 2% de contenido de hidratos de carbono y una masa
molecular nativa de 131 kDa que comprende dos subunidades de 70 kDa. La temperatura ptima y
el pH para la actividad fueron 65 C y 4,5, respectivamente. La enzima era resistente a
temperaturas de 50 C y 60 C y estable a un pH de 4,0 a 7,0. Aumento de la actividad en
presencia de diferentes iones, especialmente Mn 2 + (177%), y Ag + aument la actividad de la
invertasa de 91%. La invertasa micelial hidroliza la sacarosa, rafinosa, y la inulina, con mayor
especificidad para el primero. Los K 1/2 y V max valores de sacarosa fueron de 22,5 mm y 124,9 U
mg -1 , respectivamente.

Palabras clave
invertasa ;
fructooligosacridos ;
La purificacin de la enzima ;
sacarosa
Autor correspondiente. Fax: +55 16 3602 3668.

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ARTICULO 3
Purificacin y caracterizacin de una nueva proteasa alcalina extracelular de Cellulomonas
bogoriensis
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046592816300195

Reflejos
Una proteasa alcalina de Cellulomonas bogoriensis se purifica y caracteriza.

La proteasa muestra una actividad ptima a pH 11 y es estable en un amplio rango

de pH de 3-12.
La enzima purificada exhibe algunas propiedades excelentes adems alcalina.
La enzima es una proteasa candidata para el detergente, cuero y otras aplicaciones.
Abstracto
Una proteasa alcalina extracelular producido por la tolerante al lcali bogoriensis Cellulomonas se purific
mediante una combinacin de precipitacin con sulfato de amonio y cromatografa de intercambio
catinico. La pureza de la proteasa se detect por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de
sodio, y su peso molecular se confirm que era 18,3 kDa. La enzima mostr una actividad ptima a 60 C y
pH 11. La estabilidad de la proteasa se mantiene en un amplio rango de temperaturas de 4-60 C y pH gama
de 3-12. Inhibicin irreversible de la actividad de la enzima por el fluoruro de fenilmetilsulfonilo y
tosyl- L fenilalanina clorometil cetona demostr que la enzima purificada es una quimotripsina de la familia
de serina proteasa. La K m y V maxde la actividad de proteasa en casena eran 19,2 mg / mL y 25.000 g / min /
mg, respectivamente. La amplia especificidad de sustrato y una notable estabilidad en presencia de
disolventes orgnicos, sal y detergentes comerciales, as como su excelente capacidad de eliminacin de
manchas y depilado, hacen que el alcalina purificada proteasa un candidato prometedor para aplicaciones
industriales.

Palabras clave

Proteasa alcalina ;
Bogoriensis Cellulomonas ;
quimotripsina ;
serina proteasa