Manual Bioquímica III

}
2,016
Manual de prcticas de
BIOQUIMICA III
Elaboracin
Licda. Eyda Menda de Campollo (QB)
Licda. Ana Ester Barrientos (QB)
Revisin
Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramrez (QB, MA)
Licda. Isabel Cristina Gaitn Fernndez (QB, MA)
REGLAMENTO GENERAL
MANUAL DE PRCTICAS
BIOQUMICA III
TERCER AO
QUINTO SEMESTRE
FACULTAD
DE
CIENCIAS MDICAS
UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ
DE
GUATEMALA
BASADO
FECHAS
EN
DE
GUAS
DE
LABORATORIO I2QB3
MODIFICACIN: AO 2008, AO
2011
INDICE
N O.
DE PRACTICA
NOMBRE
N ORMATIVA
N O.
DE PRACTICA
DE
LABORATORIO
DE HOJA
C APACIDAD BUFFER
13
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE PROTENAS
21
EN
3
4
SUERO
COAGULACIN
FUNCIN
RENAL:
PLASMA
28
SANGUNEA
DETERMINACIN
DE
34
UREA
39
CREATININA
FUNCIN
RENAL:
DETERMINACIN
D ETERMINACIN ENZIMTICA DE
EL ELISA
DE
CIDO RICO
44
COMO UN ANLISIS CUALITATIVO Y
50
CUANTITATIVO
D ETERMINACIN CUALITATIVA
DE
TIROXINA
54
TRIIODOTIRONINA TOTAL
9
10
11
D ETERMINACIN
DE CORTISOL
D ETERMINACIN FSH Y LH
D ETERMINACIN DEL
LMITE DE DETECCIN DE
UNA PRUEBA CUALITATIVA
PRUEBA
HCG DE EMBARAZO
60
66
71
INTRODUCCIN AL TRABAJO DENTRO DEL LABORATORIO DE

BIOQUMICA
NORMATIVA DE COMPORTAMIENTO Y DE TRABAJO
Introduccin
Trabajar dentro de un laboratorio de cualquier ndole supone un grado de
responsabilidad del cual muchos estudiantes no estn conscientes. Es necesario
que cualquier persona que se encuentre dentro de las instalaciones del laboratorio
sepa comportarse de forma adecuada. Un mal comportamiento no solamente
tendr implicaciones disciplinarias, sino podra tambin tener serias implicaciones

de salud y seguridad. Es absolutamente necesario que tanto el instructor como
el estudiante que trabaja dentro del laboratorio sepan que una accin fuera del
comportamiento adecuado puede desencadenar un serio accidente que puede
afectar tanto la salud y seguridad propia como la de los dems. Para evitar
este tipo de situaciones, se ha diseado una prctica de introduccin para dar
a conocer al estudiante lo que se espera de l o ella durante el transcurso de
los laboratorios.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Conozca la responsabilidad que adquiere al trabajar dentro del lab oratorio
de Bioqumica.
2. Conozca el trabajo que se espera de l o ella antes, durante y despus

de realizarse un laboratorio de Bioqumica
3. Se comprometa con los Laboratorios del Instituto a guardar compostura
tanto en su rendimiento acadmico como en su comportamiento personal,

de manera que pueda obtener el mayor provecho de su experiencia en el
laboratorio.
Alcance
Que el estudiante:
1. Conozca la forma de evaluacin dentro del laboratorio
2. Est consciente de las consecuencias de su calidad de trabajo en el
laboratorio
3. Conozca a cabalidad los aspectos que se tomarn en cuenta en la

evaluacin del laboratorio como parte del curso de Bioqumica.
Reglamento para el estudiante
Para que un estudiante tenga derecho a participar en las sesiones del
Laboratorio de Bioqumica, debe cumplir con las siguientes reglas:
1. Estar inscrito en el curso terico de Bioqumica III.
2. Guardar un comportamiento adecuado en las actividades del laboratorio,
adhirindose completamente al R EGLAMENTO
DEL
LABORATORIO establecido.
Puede encontrar una copia del REGLAMENTO DEL LABORATORIO en el apndice

al final de este manual.
El faltar al reglamento tiene consecuencias que
pueden llegar hasta el retiro definitivo del laboratorio.

3. Asistir al laboratorio de manera PUNTUAL.
El alumno que no se presente
puntualmente a la puerta del laboratorio, perder el derecho de presentar

examen corto.
El alumno que se presente despus de haberse presentado
las instrucciones para el laboratorio, perder el derecho de ingresar a la

prctica.
4. De no asistir a una prctica, el alumno pierde automticamente el derecho a

presentar todos los componentes de la nota de esa prctica, teniendo un
cero inmediato.
Sin embargo, si el alumno justifica su ausencia (razones
mdicas o por luto), la nota de ese laboratorio ser eliminada del promedio
para obtener la nota final.
Independientemente que su ausencia sea
justificada o no, es responsabilidad del alumno ponerse al da con el
contenido de la prctica perdida. Existe la opcin de reponer prcticas si

el alumno lo tramita con su instructor anticipadamente y si existe espacio
disponible para hacerlo.
5. Haber cumplido con las tareas preparativas de cada prctica, las cuales
incluyen, pero no se limitan a, la informacin solicitada en el cuaderno, una
lectura a conciencia de la prctica y cualquier investigacin previa que se
haya solicitado (ya sea escrita o no). Se practicar un examen corto al inicio
de la prctica para asegurar que el alumno conoce el tema a tratar y el

procedimiento a seguir. Queda a discrecin del instructor permitir la entrada
de un alumno que evidentemente no maneja el conocimiento previo requerido.

6. Utilizar su equipo de proteccin personal todo el tiempo que se encuentre
dentro de las instalaciones del laboratorio.
Como equipo d e proteccin
personal se incluye: bata larga (siempre cerrada), de manga larga, sin bolsas
en los costados y
deber contar con su respectivo nombre y logo de la
Universidad, anteojos de seguridad y zapatos cerrados. El no cumplir con
esta regla es causa justificada para retirar a un alumno del laboratorio del
da, perdiendo el derecho a presentar examen, cuaderno, prctica y reporte.
De reincidir, el alumno incluso puede ser retirado definitivamente de
laboratorio.
7. No llevar consigo bolsas, mochilas ni artculos de uso personal (celulares,

localizadores, joyas, etc.). De descubrirse que un alumno porta consigo una
de estas pertenencias, sta se confiscar y se devolver al final de la prctica.
No utilice su telfono mvil como calculadora; lleve la propia. El laboratorio

no se hace responsable de guardar ninguna pertenencia personal de los
alumnos durante la prctica. Es responsabilidad del estudiante asegurar sus

pertenencias personales ANTES de llegar al laboratorio.
Trabajo antes de llegar al laboratorio:

El Pre-Lab
El laboratorio es un lugar donde nunca debe llegarse a improvisar.
Es
necesario asegurar que el estudiante est familiarizado con el tema a tratarse
en el laboratorio, as como con el procedimiento que se seguir. Como ayuda

al estudiante, se ha diseado un cuestionario que llamaremos Pre -lab.
Responder el Pre-lab a conciencia tiene la ventaja de ayudar a un mejor
rendimiento para el examen corto que se realizar en cada prctica al inicio de
la misma.
El Pre-lab es un cuestionario que queda bajo la responsabilidad del estudiante

el resolver a conciencia para asegurarse que se comprender el trabajo que se
va a realizar durante el laboratorio.
La resolucin escrita del Pre -Lab deber
entregarse al Instructor antes de empezar la prctica del da.

Para la presentacin del Pre-Lab se deber incluir:
- Revisin Bibliogrfica acerca de la prctica (No ms de una pgina)
- La importancia Clnica-medica que tiene la prctica
- Cuestionario
- Referencias Bibliogrficas
Trabajo dentro del Laboratorio
Como se indic anteriormente, se espera que el estudiante haga su mejor
esfuerzo para aprovechar al mximo el recurso que se tiene en el laboratorio.
El trabajo que se realice dentro del laboratorio deber ser registrad o por cada
estudiante a manera de poder comprobar qu se hizo, cmo se hizo y cundo
se hizo.
Para este propsito, es necesario la realizacin de un examen corto
y que cada uno lleve un cuaderno de laboratorio.
o Examen Corto
Al inicio de cada laboratorio se realizar un examen corto que evidenciar el
conocimiento con el que se prepar el estudiante para la prctica. El alumno

pierde el derecho a esta prueba si llega despus de iniciado el laboratorio.
o Cuaderno de Laboratorio
El cuaderno de laboratorio est diseado para cumplir como evidencia del

trabajo que se ha realizado durante cada prctica de laboratorio.
Lo ms
valioso de su cuaderno de laboratorio es el contenido. Aunque su presentacin
es importante, no es lo principal en un cuaderno de laboratorio, por lo que el

estudiante no debe temer a hacer cualquier anotacin dentro de su cuaderno
en cualquier momento.
Cada estudiante debe poseer un cuaderno de laboratorio que cumpla con

ciertas especificaciones establecidas. Si alguna persona desea usar el
cuaderno de laboratorio de otro curso que haya llevado previamente, puede
hacerlo siempre y cuando se identifique claramente el cuaderno (vuelto a
forrar si hay cambio en el color a usarse) y la seccin que se utiliza.
No
puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultneos

en un mismo ciclo.
Un trabajo que no puede leerse simplemente no tiene validez alguna, por
lo que se espera que el estudiante tenga un cuaderno tan ordenado como
sea posible, y sobre todo, legible. No se permitir el uso de lpiz o de
corrector en el mismo.
El cuaderno de laboratorio deber contener las siguientes secciones:
Seccin
Contenido
Fecha de
Indicar claramente la fecha en que se llevar a cabo la
realizacin
prctica de laboratorio.
Encabezado
Indicar claramente el ttulo de la prctica que se llevar a cabo
Valor1
---
en el laboratorio y nmero de la misma.

Objetivos
Enumerar de dos a tres objetivos a conseguir durante la

prctica.
Incluir los presentados en la gua y dos personales
ms, distintos.
20
Materiales y Reactivos Enumerar los materiales y reactivos que se requerirn durante
10
la prctica.
Toxicidades
Para los reactivos, es necesario incluir la toxicidad del reactivo

que se manejar.
10
Es de vital importancia incluir los efectos de
exposicin, forma de aplicar primeros auxilios y la forma

adecuada de desecho.
Clculos previos
Cualquier clculo que sea necesario en la preparacin de
10
soluciones a usarse o de la muestra en s.

Reacciones
Reacciones qumicas o bioqumicas involucradas en la prctica
10
de laboratorio.
Procedimiento
Enumerar los pasos a seguir durante la prctica.
Debe
20
indicarse claramente cada paso, incluyendo los pesos

preparativos involucrados.
Debe incluirse al final un diagrama
de flujo para hacer ms fcil el seguimiento del procedimiento.

Tablas de resultados
Se debe preparar por adelantado las tablas que se usarn para
20
registrar los resultados de la prctica.

Observaciones
Es necesario que despus de anotar los resultados obtenidos
--
en la prctica, se anote tambin cualquier observacin que

posteriormente pueda explicar una alteracin en los resultados.
No debe confiarse en la memoria ni debe recurrirse a papelitos
sueltos para anotar esta clase de informacin (Durante el
laboratorio)
Nota total del cuaderno de laboratorio
1
Valor: Algunos rubros no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega puntos de
nota al laboratorio. Sin embargo, su ausencia s resta puntos de la nota del cuaderno
Trabajo posterior al laboratorio

La principal forma de evaluacin del trabajo hecho durante el laboratorio, as
como la comprensin obtenida despus de realizado el laboratorio, es el reporte
del mismo. En l de evidencia el nivel de comprensin y la calidad del trabajo

realizado por el estudiante.
100
o Reporte del Laboratorio

El reporte de laboratorio tiene doble funcin: permite al estudiante entrenarse
en el arte de la escritura cientfica y le brinda la oportunidad de demostrar qu

tanto aprendi durante la realizacin de la prctica.
Para presentar un buen
reporte de laboratorio, el estudiante debe esforzarse en varios aspectos. Primero,

debe asegurarse que el contenido del reporte sea acorde al tema que se trat
en el laboratorio. Segundo, es necesario que muestre tanto una buena redaccin

como una buena ortografa.
Como futuros mdicos, es importante que los
estudiantes ejerciten su habilidad de escribir bien, ya que forma parte de la

buena formacin de todo profesional.
El reporte debe contener las siguientes secciones:

Seccin
Encabezado
Resumen
Contenido
Ver hoja 13.
Valor 1
Se debe incluir de forma sintetizada lo realizado durante la
10
prctica, principalmente respondiendo las preguntas Cmo lo

hice?, Por qu lo hice? y A qu llegu?. Mximo 10 lneas.
Objetivos
Se debe de escribir el o los objetivos principales de la prctica.
10
Resultados
Debe presentar de la
20
Recuerde que a partir de ellos, deber realizar sus conclusiones.

manera ms ordenada posible, los
resultados obtenidos en la prctica. Debe incluir: el nmero de la

tabla, el ttulo de la tabla entre comillas ( ). Debajo de la tabla,
incluir la fuente de los datos con tamao 8. Se de presentar en
tablas de fcil entendimiento a manera que alguien que no haya
estado en el desarrollo de la prctica pueda entenderlo con
facilidad. NO se aceptan resultados escritos a mano
Discusin de
Es la seccin en donde el estudiante debe discutir los resultados
resultados
obtenidos en la prctica. Por qu obtuve esos resultados,

posibles fuentes de error. Debe refutar su justificacin de fuentes
confiables.
10
30
Conclusiones
Como regla, no se puede concluir teora ni un asunto que no
15
haya sido incluido en la discusin. Es necesario haber discutido

un punto para poder concluir al respecto. Mnimo deben ser 3
conclusiones.
Anexo
Debe incluir cualquier informacin adicional que complemente sus
resultados (datos o clculos) o discusin de resultados, as como

imgenes si usted lo desea.
Bibliografa
Debe escribir toda fuente CONFIABLE que haya consultado para
10
justificar su discusin, todo de acuerdo a las normas de

laboratorio.
Nota total del reporte de laboratorio
1
Valor: Algunos rubros no tienen valor asignado, ya que su presencia no agrega puntos de
nota al laboratorio. Sin embargo, su ausencia s resta puntos de la nota del cuaderno
Formato para entregar el REPORTE DE LABORATORIO:

Hojas tamao carta, blancas.
Fuente: Arial 11.
Interlineado sencillo (1.0).
Ttulo de las tablas Entre comillas.
Fuente de los datos obtenidos, Arial
Los objetivos y las conclusiones, se deben escribir con vietas.
8.
Si incluye imgenes en la seccin de ANEXOS debe colocar el nmero de la
figura, nombre y fuente y agregar descripcin, no se otorgara calificacin si la

imagen no tiene descripcin.
El reporte de laboratorio debe ser entregado durante el perodo de laboratorio
siguiente de realizada la prctica.
Todo reporte debe presentarse escrito con
mquina de escribir o impreso. No se recibirn reportes parcial o totalmente
escritos a MANO (salvo excepciones precisas indicadas por su instructor), ni en

formato electrnico.
Estos debern entregarse debidamente engrapados. Se
11
100
entregar una hoja de control de entrega de reporte, donde se anotar

semanalmente la fecha en que se entreg el informe.
Toda aquella persona que se haya ausentado por cualquier motivo de una
prctica, NO TIENE DERECHO a entregar un reporte, sin importar si la falta ha
sido justificada o no. De ser justificada, la nota de dicho laboratorio se eliminar,
a manera de no ser tomada en cuenta en el clculo de la nota final.
Sin
tema de la prctica durante las pruebas finales del laboratorio del curso.
ES
embargo, esto no quiere decir que el estudiante se libere de la evaluacin del

RESPONSABILIDAD DEL ALUMNO investigar el tema tratado durante la prctica
que faltara, independientemente si la falta ha sido justificada o no.
IMPORTANTE: NO se tolerar ningn tipo de copia en los reportes de

laboratorio.
Cualquier indicio de plagio (reproduccin no autorizada de una publicacin,
palabra por palabra, incluyendo Internet) ser castigado con una nota de cero
en el reporte. Cualquier indicio de copia (entrega de reportes idnticos por parte
de dos o ms alumnos) ser evaluado como un cero para todos aquellos
estudiantes que tengan el reporte igual, sin importar quin lo gener ni quin lo
copi. Todo caso quedar documentado, y una reincidencia puede significar el

retiro definitivo del o los alumnos involucrados del laboratorio del curso.
Los reportes se corregirn durante la semana y se devolvern en la siguiente

semana. Si algn alumno tiene cualquier reclamo sobre la forma en que se ha
calificado su reporte, debe hablar con el catedrtico DENTRO DE LA PRIMERA
SEMANA despus de haberlo recibido corregido.
No se aceptarn reclamos
posteriormente.
Las actividades que se entreguen impresas debern de ir debidamente
identificadas de la siguiente manera:
12
UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ

FACULTAD DE MEDICINA
BIOQUIMICA III
NOMBRE DE ALUMNO
CARN
SECCIN
NUMERO DE LA PRACTICA
INFORMACIN SOLICITADA
NOMBRE DE LA PRACTICA
Evaluacin de todo el trabajo del laboratorio

Al final del curso, la nota final de laboratorio se compondr de la siguiente
forma
Rubro a evaluar
Puntaje
Exmenes cortos de laboratorio
Trabajo terico practico
Cuaderno de laboratorio
Reportes de laboratorio
Texto paralelo
Exmenes parciales de laboratorio
Examen final de laboratorio (Incluye los temas
vistos en todas las prcticas del laboratorio)
Total Nota de Laboratorio
20
13
REALIZADO POR: LICDA . SARA
BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA /
D RA. DORA INS
MAZARIEGOS C ORDERO
PRCTICA NO. 1
CAPACIDAD BUFFER
Introduccin
El papel de las soluciones buffer son de gran importancia no solamente para
el organismo sino para el trabajo dentro del laboratorio. El pH de los diferentes
fluidos orgnicos vara grandemente. Por ejemplo, el jugo gstrico se encuentra
en el rango de pH 1 y no se regula en gran manera, mientras que el pH de la

sangre ronda los 7.40 y es uno de los parmetros ms regulados del organismo.
Para cumplir esta regulacin, el organismo se vale de las propiedades de algunos
compuestos qumicos que tienen capacidad de resistir cambios de pH drsticos
por la adicin o remocin de iones H +. Estos compuestos forman las conocidas

soluciones buffer, de gran importancia dentro del organismo.
Esta prctica ayuda al estudiante a darle un significado ms all que el
puramente terico a la existencia y comportamiento de las soluciones buffer, as

como a sus propiedades. El significado del pK de disociacin pasa de ser un
valor numrico a un valor prctico que el cuerpo usa en la regulacin del pH.
El principal propsito de esta prctica es ilustrar al estudiante a visualizar algunos
procesos, en su versin simplificada, que se llevan a cabo dentro del organismo.

Objetivos
Que el estudiante
1. Conozca las propiedades de las soluciones buffer y la importancia de su
rol dentro del organismo y dentro de las actividades del laboratorio de
Bioqumica.
2. Determine el valor de pK de disociacin de un cido dbil (KH2PO4).

3. Identifique una solucin con mejor comportamiento de buffer.
14
Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparacin de soluciones.
2. Conozca la forma correcta de utilizar un potencimetro.
3. Aprenda la aplicacin de curvas de calibracin de un aparato simple.
4. Aplique su conocimiento matemtico en la obtencin e interpretacin de
grficos en el laboratorio.
Antecedentes
El agua tiene diversas propiedades que le ha convertido en el solvente
universal adecuado para la vida tal y como la conocemos. Es una molcula

tetradrica con extremos ligeramente cargados, dndole carcter de molcula
polar.
Esta caracterstica le permite interaccionar con la gran cantidad de
molculas de diferente naturaleza que nos conforman.
Es capaz de formar puentes de hidrgeno, lo cual estabiliza su relacin con

otras molculas de agua as como otras molculas polares (hidroflicas).
Esta
propiedad ayuda a que la estructura tridimensional de las grandes molculas

orgnicas, como protenas y cidos nucleicos, pueda ser estable.
Una de sus propiedades ms importantes fisiolgicamente es la tendencia que
muestran las molculas de agua a que una pequea porcin de ellas se disocien.
El agua tiene capacidad para funcionar como cido o como base, por lo cual su
disociacin puede escribirse como una transferencia de protones entre cido y
base, de la siguiente forma:
Se ha observado que la tendencia del agua a disociarse se comporta de

manera tal que mantiene una constante de disociacin, K, la cual se define de
la siguiente manera:
15
Sin embargo, la disociacin del agua se da en un grado tan pequeo que no
afecta la concentracin total del agua, as que puede incorporarse a la constante

(ya que siempre permanece constante) para dar la siguiente ecuacin:
Esta nueva constante, KW, se conoce como producto inico del agua, y tiene
un valor de 1 x 10 -14, y es vlida para todas las ecuaciones acuosas.
Esto
quiere decir que en un vaso de agua pura, por ejemplo, donde no hay influencias
de cidos o bases, se encontrar una concentracin de protones (H +) equivalente

a 1 x 10 -7.
Este nmero vara y ya no se hace tan sencillo cuando ya se
consideran soluciones con la influencia de cidos y bases.
Para facilitar el
manejo de estas concentraciones, se recurre a una escala logartmica mucho

ms fcil de utilizar: el pH.
El pH se define clara y llanamente como el logaritmo negativo de la
concentracin de protones de una solucin, o escrito matemticamente:
Esta ecuacin permite que lo que sera una escala complicada se convierta
en una simple escala lineal que va desde valor 1 a 14, donde el 7 indica
neutralidad (es decir, igual nmero de protones y grupos OH-), un valor menor
a siete indica acidez y uno mayor, basicidad.
El valor del pH del organismo no permite
fluctuaciones muy
amplias dentro
de
la
escala. En el caso especfico de la sangre,

el pH se encuentra alrededor del 7.40, pero
no puede ir ms all de 7.0 ni de 7.7, ya
que ambos casos son generalmente fatales.

Por tanto, la regulacin debe hacerse de
forma muy
cercana.
Para lograr esto, el organismo
recurre a las llamadas soluciones buffer. El sistema buffer de ms importancia

en el organismo es el de CO2 / bicarbonato.
16
Las soluciones buffer son soluciones que se resisten a cambiar de pH por
adicin de protones (H+) o grupos hidroxilo (OH-). Estas soluciones generalmente

estn formadas por cidos o bases dbiles (parcialmente ionizados) con la
presencia de una sal del mismo anin que el cido o base fuerte. La capacidad
de resistir a estos cambios, o capacidad buffer, depende de la concentracin del

cido conjugado y de la base conjugada. Una caracterstica nica para cada
sistema buffer es su valor de pK, que no es ms que el logaritmo negativo de
su constante de disociacin. Cuando el pH del medio es igual al pK del buffer

estudiado, se dice que el buffer se encuentra en su capacidad mxima.
EL SISTEMA
AMORTIGUADOR
QUE SE
APLICA
EN CLNICA
ECUACIN DE HENDERSON HASSELBACH LA CUAL DICE QUE:
ES LA
pH de la sangre
Sustituyendo
En donde 6.1 es el valor del pK del cido carbnico

El cido carbnico (H2CO3) se calcula multiplicando la concentracin del
pCO2 (presin parcial de bixido de carbono) * la constante 0.03 que
convierte los mmHg del CO2 en mEq/l
pH = 6.1 + log del bicarbonato/pCO 2
pH = 6.1 + log de 24 mEq/L / 40 mmHg
pH = 6.1 + log de 24/1.2
(40 por 0.03 = 1.2 mEq/L)
(24/1.2 = 20 y logaritmo de 20 = 1.3)
pH = 6.1 + 1.3 = 7.4
17
PreLaboratorio
En su trabajo de Pre-Laboratorio, conteste claramente las siguientes preguntas:
1. Soluciones buffer o amortiguadoras:
a. Cmo se definen?
b. Cules son sus principales caractersticas?
c. Cul es su papel dentro del organismo?
d. Cules son los principales sistemas buffer que se encuentran en el
organismo?
e. Qu significa la pK de una solucin buffer?
2. Investigue sobre el potencimetro:
a. Qu es y para qu se usa?
b. Cmo se encuentra diseado?
c. Cmo se calibra?
d. Cmo se maneja y qu cuidados debe tenerse al manejarlo?
Materiales
a. Reactivos
Hidrxido de sodio, NaOH, solucin 1M
Fosfato dicido de potasio, KH2PO4, solucin 0.05M
Fosfato cido de potasio, K2HPO4, solucin 0.05M
b. Cristalera
Baln aforado de 50 mL
Pipeta volumtrica de 1 mL
Beacker de 100 mL
c. Instrumentacin
Medidor de pH, o potencimetro
18
Procedimiento
I. Preparacin de las muestras.
- Usando las soluciones que se le facilitan en el laboratorio, prepare las
muestras siguiendo las indicaciones del cuadro siguiente.
Para mayor
facilidad, utilice balones de 50 mL, transfiera el volumen menor usando
pipeta volumtrica y afore con el volumen mayor. Rotule claramente cada

muestra para evitar confusiones.
Muestra
K2HPO4 0.05M (mL)
20
30
45
49
50
KH2PO4 0.05M (mL)
50
49
45
30
20
II.
Lectura.
- Obtenga el valor del pH para cada una de las muestras. Siga claramente
las instrucciones del docente de laboratorio y asegrese de se r supervisado

al momento de tomar las lecturas de su muestra. Procese la informacin
que obtuvo como se indica en la seccin de Observaciones importantes.
- Calibracin del potencimetro:

o Retirar la tapa del potencimetro. o Retirar el tapn de plstico que
est en el sensor. o Introducir el sensor del potencimetro en el buffer
pH 7. o Presionar la tecla ON/OFF. o Seguidamente presionar la tecla
CAL y se escuchara un Beep, esperar a que en la pantalla indique
7.0 y sonara Beep
o Retirarlo del Buffer pH 7. o Lavar el sensor con agua destilada y
eliminar el exceso de agua sin tocar al sensor.
o Introducir el sensor del potencimetro en el buffer pH 4.

o Presionar la tecla CAL y se escuchar un Beep, esperar a que en la
pantalla se indique 4.00 y sonara Beep.
19
o Retirarlo del buffer pH 4. o Lavar el sensor con agua destilada y

eliminar el exceso de agua sin tocar el sensor.
o El potencimetro est listo para leer su muestra. No lo apague.

o Obtenga el valor de pH para cada una de las muestras. o Introducir
el potencimetro en el beacker con la muestra y presionar la tecla
READ y espere el sonido Beep y en la pantalla se le indicara el pH

de la muestra.
III.
Comparacin.
- Coloque en un beacker 50 mL de muestra (un beacker por muestra) y 50
mL de agua en otro beaker.
- Mida el pH de cada solucin.

- Luego de haber medido el pH de cada solucin, aadir 5 gotas de NaOH
al 2.5%
- Vuelva a medir el valor de Ph de cada solucin.

Observaciones importantes
Asegrese de anotar claramente dentro del cuadro que prepar para datos,
en su cuaderno los valores de pH para todas sus muestras.

Para cada muestra, calcule los siguientes parmetros:
1. [HPO4-2] usando la informacin del volumen de K2HPO4 que agreg en la

muestra, utilizando la siguiente formula
Concentracin original * Vol. adicionado = [HPO4-2] * Vol. Total

2. [H2PO4-] usando la informacin del volumen de KH 2PO4 que agreg en la
muestra
Concentracin original * Vol. adicionado = [H 2PO4-] * Vol. Total
3. El logaritmo de la relacin de las dos concentraciones usando la siguiente
ecuacin
Haga una grfica en donde se muestre en el eje x el valor de la relacin

de concentraciones obtenidas en el inciso anterior, en el eje y el valor
20
obtenido para cada muestra. Obtenga una regresin lineal entre estos datos
y el valor que obtenga para el intercepto ser su valor del pK. (Se
recomienda revisar su manual de BQI)
Busque en la literatura el valor terico para el pK de disociacin de la siguiente
ecuacin y calcule el porcentaje de error de su experimento.
Anexo
Investigue lo siguiente
1. Capacidad buffer o de amortiguacin:
a. Qu significa?
b. Qu sucede cuando se excede?
c. Qu significa rango buffer o de amortiguacin y cul es su relacin
con el pK?
d. Por qu una solucin buffer no puede actuar de la misma manera

en todas las situaciones (a varios valores de pH?
2. D un ejemplo de un buffer o amortiguador mdico y describa su funcin.

Bibliografa de referencia
1. Department of Biochemistry, University of Minnesota.
Labotatory Manual
for Biochemistry 5025. 1998. Consultado el 23 de junio, 2005. Modificado

el 23 de diciembre, 2003. http://www.natureandscience.net/labmanual.htm
2. Kaplan, L. A. y A. J. Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry.

Theory, Analysis, Correlation.
4. Edicin. Mosby, Inc. pg. 38-39
3. Devlin, T. (ed) 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations.

5 Edicin. Estados Unidos. Wiley-Liss. Pginas 12-13.
21
R EALIZADO POR: D R. OCHAETA
LICDA . NANCY DEL CID
PRCTICA NO. 2
SEPARACIN
E IDENTIFICACIN DE
PROTENAS
EN
SUERO
PLASMA
Introduccin
Las protenas estn compuestas por carbono, oxigeno, hidroge no y
nitrgeno. La mayora de ellas contienen adems azufre y algn fsforo.

Las protenas
proporcionan estructuras, catalizan reacciones celulares y
llevan a cabo multitud de tareas. Su papel central en la clula queda reflejado
en el hecho que la informacin gentica se expresa en forma de protenas.

Existe para cada protena un segmento de ADN que codifica la informacin que
especifica su secuencia de aminocidos.
Para el estudio de las protenas es necesario que estas se encuentren en
estado puro, existen varias tcnicas para poder separarlas como la precipitacin
por adicin de sales y precipitacin por adicin de aniones y cationes.
Luego
de la separacin por medio de la precipitacin es necesaria una purificacin ms

profunda a travs de la cromatografa.
Durante esta prctica el estudiante podr poner en prctica la precipitacin
de protenas
plasmticas y de huevo; as mismo podr identificar la presencia
de protenas en soluciones de varios alimentos a travs del reactivo de Biuret.

Objetivos
Que el estudiante:
1. Describa que es la sangre y sus constituyentes.
2. Describa cada una de las fracciones que constituyen a las protenas del
plasma con base a su origen, concentracin y funcin
3. Conozca e interprete la diferencia entre suero y plasma.
4. Explique cmo se encuentran constituidas las inmunoglobulinas, y las
diferentes caractersticas de cada una de ellas.
22
Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparacin de soluciones.
2. Conozca la forma correcta de utilizar un potencimetro.
3. Aprenda la aplicacin de curvas de calibracin de un aparato simple.
4. Aplique su conocimiento matemtico en la obtencin e interpretacin de
grficos en el laboratorio.
Antecedentes
Las protenas plasmticas son un grupo de ms de 100 molculas distintas
con caractersticas y funciones muy diversas
La sangre es considerada como un tejido que circula por un espacio
virtualmente cerrado, que son los vasos sanguneos. Est constituida por una
fraccin celular (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y un lquido llamado plasma,

en el que se encuentran suspendidos los constituyentes de la fraccin celular
adems de nutrientes, metabolitos, hormonas, clulas, electrolitos, protenas,

factores de la coagulacin, sistema del complemento, entre otros. El volumen de
la sangre es de aproximadamente el 8% del peso corporal total, del cual el 55%
est constituido por el plasma y el 45% por clulas sanguneas.
- Protenas del plasma
La sangre normal circulante contiene en su plasma alrededor de 7 a 7.5
g/100mL de protenas totales siendo su fraccionamiento el siguiente:
Albmina
4.3 g/100 mL
(3.5 5.5)
Globulina
2.4 g/100 mL
(2.0 3.6)
Fibringeno
0.3 g/100 mL
(0.2 0.6)
7.0 g/100 mL
(5.7 9.7)
o Albmina
Esta fraccin de las protenas del plasma es la ms abundante, es
sintetizada en el hgado. Tiene un peso molecular aproximado de
23
69,000. La estructura primaria de la albmina est constituida por 610

aminocidos dispuestos en una sola cadena peptdica. La estructura
secundaria parece ser solo una, la cual esta plegada sobre si misma,
formando capas que se pueden desplegar bajando el pH y volverse
a plegar cuando se sube el pH. La albumina en el organismo cumple
con varias funciones como por ejemplo: transporte de co mpuestos

orgnicos y recambio de nutrientes y metabolitos.
o Globulina
Es una mezcla de varias protenas las cuales se han podido separar

por mtodos especiales de laboratorio, uno de ellos es la electroforesis
son la cual se obtienen fracciones de globulinas conocidas como 1,

2 y . Las globulinas 1, 2, al asociarse a carbohidratos forman
gluco y mucoprotenas. Todas las globulinas al asociarse a fracciones
de lpidos (TAG, colesterol libre y esterificado, fosfolpidos), forman las

llamadas lipoprotenas.
Algunas globulinas se unen a metales para transportarlos por el

plasma, como la
Siderofilina o Transferrina para el hierro, la
Ceruloplastina para el cobre. Los pesos moleculares de las globulinas
cubren una gama muy amplia, desde cerca de 40,000 hasta algo ms
de 1 milln.
El sitio principal de su sntesis es el hgado, con
excepcin de las gamma globulinas que se sintetizan en el sistema

retculo endotelial.
Gamma Globulinas: tambin llamadas Inmunoglobulinas (Ig), tienen

actividad de defensa actuando como anticuerpos. Cada molcula de
Ig est formada por 4 cadenas polipeptdicas (2 pesadas llamadas H
y 2 livianas llamadas L) las que estn unidas por puentes disulfuro.

Se conocen 5 clases de inmunoglobulinas: IgA, IgG, IgD, IgM e IgE.
o Fibringeno
Es una protena que est presente en el plasma humano a una
concentracin de 0.3g por 100 mL. La molcula de fibringeno es

un dmero que consta de 2 mnomeros constituidos de 3 cadenas
24
polipeptdicas cada uno enlazados por puentes disulfuro. La presencia
de hidratos de carbono en la molcula tiene algn significado en el

mecanismo de la coagulacin.
- Plasma y suero
El plasma se obtiene cuando, inmediatamente despus de extraer la sangre,
se le agregan anticoagulantes como oxalato, citrato, EDTA, o heparina y se

centrifuga. Si se recoge sangre sin anticoagulante y se deja que est coagule,
el lquido que se separa se llama suero.
El suero carece de clulas y de
factores de la coagulacin incluyendo la protena fibringeno, pues sta ha sido

transformada en fibrina insoluble en el proceso de la coagulacin.
Una de las tcnicas de precipitacin se basa en la baja solubilidad que tienen

las protenas en disoluciones salinas concentradas, la sal que ms se ha utilizado
es el Sulfato de Amonio, (NH4)2SO4.
El hecho de que una protena se disuelva
en un medio acuoso se debe a su capacidad de formar puentes de hidrgeno.

Con el agua a mayor cantidad de puentes de hidrgeno mayor solubilidad. La
accin de la sal es liberar el agua unida a la protena por puentes de hidrgeno,
lo cual provoca su precipitacin.
El reactivo de Biuret se utiliza para la determinacin de protenas, peptidos
cortos y otros compuestos con dos o ms en laces peptdicos.
La prueba se
basa en la reaccin del sulfato de cobre con compuestos que tengan dos o ms
enlaces peptdicos, en un medio alcalino. La reaccin final produce un complejo
color violeta, cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de enlaces

peptdicos presentes.
Materiales
a. Reactivos
Solucin 0.1M de Oxalato de sodio
Solucin de hidrxido de sodio al 10%
Solucin saturada y semisaturada de sulfato de amonio
Cristales de sulfato de amonio
25
Reactivo de Biuret
Suero y Plasma oxalatado
Agua destilada
b. Cristalera
Tubos de ensayo
Tubos de centrifuga
c. Equipo
Gradillas para tubos de ensayo
Pipetas pasteur
Pipetas de 1 mL y de 5 mL
Esptula
Centrfuga
Procedimiento
I. Presencia de Fibringeno
- Colocar 1 mL de plasma oxalatado en un tubo de centrifuga, agregarle 1
mL de una solucin semisaturada de sulfato de amonio y mezclarlos.
- Observe el fibringeno que se precipit.

- Centrifugue el tubo con su contenido durante 5 minutos, descartar todo el
sobrenadante.
- Al sedimento agrguele 1 mL de agua destilada, mzclelo completamente.

- Agrguele 1 mL de solucin al 10% de hidrxido de sodio y 1 mL de
reactivo de Biuret.
- Observe el color que se desarrolla.

II. Separacin de Globulinas
- Tomar 1 mL de suero y colocarlo en un tubo de centrifuga, agregarle 1
mL de una solucin saturada de sulfato de amonio y mezclarlos.
- Observe el precipitado.
26
- Centrifugar durante 10 minutos.

- Pasar el sobrenadante a otro tubo de centrifuga limpio (este se utilizara en
el apartado III).
- Al sedimento agregue 1 mL de agua destilada y mzclelo.

- Agrguele 1 mL de solucin al 10% de hidrxido de sodio y 1 mL de
reactivo de Biuret.

III. Separacin de Albmina
- Al sobrenadante del inciso anterior, agrguele unos cristales de sulfato de
amonio y agtelo suavemente hasta que se disuelva (si es necesario
agregue un poco ms).
- Observar el precipitado que se forma.

- Agrguele 2.5 mL de solucin al 10% de hidrxido de sodio y 1 mL de
reactivo de Biuret.

Anexo
Investigue lo siguiente:
1. Describir la funcin de por lo menos tres protenas plasmticas que se
incluyen dentro de las globulinas.
Bibliografa
1. Quesada Mora, Silvia. Manual de experimentos para Bioqumica. San Jos
Costa Rica. EUNED.
2007. 148 p.
2. Departamento de Bioqumica, Universidad Autnoma de Mxico. Programa

acadmico, objetivos del curso, contenido temtico y manual de practicas
de Laboratorio, Biologa y Biologa Molecular. 2004. Consultado en enero
2010. Reimpreso 2006.
27
R EALIZADO POR: LICDA . N ANCY
DEL
C ID
PRCTICA NO. 3
C OAGULACIN
SANGUNEA
Introduccin
El organismo dispone de un sistema de seguridad que le permite detener una
hemorragia o prdida de sangre debido a la rotura de la pared vascular, a este

mecanismo se le conoce como hemostasia o coagulacin sangunea.
Existen diferentes pruebas para poder evaluar este proceso como el tiempo de
sangra, tiempo de coagulacin, tempo de protrombina, tiempo de tromboplastina

parcial, entre otras.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Conozca las pruebas de coagulacin y la importancia de cada una de
ellas.
2. Conozca que se evala en cada prueba.

3. Conozca la forma adecuada de realizar cada una de las pruebas.
Antecedentes
Antecedentes: Fases de la hemostasis:
1. VASOCONSTRICCIN: es la disminucin de la luz del vaso sanguneo,
como un mecanismo de defensa, llevado a cabo por el estmulo directo
del sistema nervioso simptico sobre el msculo liso de la pared del

vaso sanguneo.
2. AGREGACUN PLAQUETARIA: es el proceso que se desencadena
cuando una plaqueta se adhiere al factor de Von,Willebrand unido a la
28
colgena del vaso sanguneo, est plaqueta libera tromboxano A2, lo cual
atrae a otras plaquetas. Las plaquetas que se van agregando emiten
pseudpodos y sustancias que activan a otras plaquetas para que sigan
unindose hasta formar el cogulo plaquetario.
3. COAGULACIN SANGUNEA: tradicionalmente se le divide en 3 fases:
intrnseca, extrnseca y comn. La va intrnseca comprende los factores
XII, XI, IX y VIII, adems de la calicreina (que existe inicialmente como

precalicreina) y el ciningeno de alto peso molecular. La va intrnseca
se inicia con el contacto con una superficie patolgica como la exposicin
de las cargas negativas en el endotelio lesionado. La va extrnseca se

inicia con la activacin del factor VII y el factor tisular (factor III), tanto
la va intrnseca como la extrnseca convergen en la activacin del factor

X que inicia la va comn la cual comprende la conversin de la
protrombina en trombina y la conversin de fibringeno en el cogulo de
fibrina como se observa en el siguiente esquema:
29
Dos pruebas de coagulacin nos sirven para evaluar la va intrnseca y
extrnseca. Por medio del tiempo parcial de tromboplastina (TPTP), evaluamos

la va intrnseca, su valor normal es de 30 a 40 segundos. Con esta prueba
monitorizamos a las personas que estn siendo tratadas con heparina y tambin
refuerza el diagnstico de enfermedades como las hemofilias tipo A (deficiencia
del factor VIII), hemofilia tipo B (deficiencia del factor IX) y hemofilia tipo C
(deficiencia del factor XI), y de la enfermedad de von Willebrand. Con el tiempo
de protrombina (TP: valor normal de 10 a 15 segundos), monitorizamos a las
personas que estn siendo tratadas con warfarina un inhibidor competitivo de la
vitamina K (la vitamina K es necesaria para que se d la gamma-carboxilacin

de los factores II, VII, IX y X), est prueba tambin est alargada. anormalmente
en la deficiencia de vitamina K y en las hepatopatas graves. Actualmente cada

vez que mandamos hacer un tiempo de protrombina el laboratorio nos informa
del INR que significa razn normalizada internacional, esta razn fue propuesta
por la OMS en 1982. Al inicio la INR se calculaba asi: INR = TP del pac. / TP
controlISI. El exponente ISI significaba ndice de sensibilidad internacional, como
se hace muy difcil elevar al exponente, se trat de que este exponente se
aproximara a la unidad y como cualquier nmero elevado a un exponente 1 no

se modifica entonces actualmente solo se utiliza
INR = TP del pac / TP control y su valor normal va de 0.8 a 1.2
30
- Tiempo de sangra:
El tiempo de sangrado mide la fase primaria de la hemostasia: la interaccin de
las plaquetas con la pared del vaso sanguneo y la formacin del tapn
hemosttico. El tiempo de
sangrado constituye la mejor prueba para detectar
alteraciones de la funcin plaquetaria y es uno de los principales estudios en

los trastornos de la coagulacin. Se hace una pequea herida en el lbulo
auricular o en
con
el antebrazo y se anota el tiempo de sangrado y la velocidad
que se forma el cogulo plaquetario. La duracin del sangrado de un
capilar depende de la calidad y cantidad de plaquetas y de la vasoconstriccin.

Valor de referencia: 2 9 minutos. Esta prueba se altera principalmente en la
enfermedad de Von Willebrand (el valor de esta prueba puede pasar los 25
minutos).
Tiempo de coagulacin:
Es el intervalo requerido para que la sangre venosa se coagule en condicin
controlada; es una medicin del tiempo requerido para la formacin de las

primeras trazas de trombina que bastan para formar un coagulo visible. Valor de
referencia: 5 a 8 minutos. Esta prueba casi no se hace actualmente, porque la

informacin que proporciona tiene poco utilidad clnica.
31
Pre-laboratorio
De la coagulacin investigue lo siguiente:
1. A qu conocemos como fibrina?
2. Qu son las plaquetas?
3. A que se refiere cuando se habla de la va intrnseca y extrnseca de la
coagulacin
4. Qu tipo de anticoagulante debe de usarse en pruebas de coagulacin?

Materiales
a. Reactivos
Reactivo para Tiempo de Protrombina (TP)
Agua Destilada
Control Normal para TP
Control Patolgico para TP
b. Cristalera
Tubos de ensayo
Laminas porta-objeto
c. Equipo
Gradillas para tubos de ensayo
Micro pipeteador automtico 200L
Micro pipeteador automtico 50 L
Bao de Mara a 37C
d. Otros
Papel mayordomo
Cronometro
Lancetas
32
Procedimiento
I. Tiempo de Protrombina (TP)
- Luego de recolectada y separada la sangre
- Calentar el reactivo de TP a 37C
- Colocar 50 L del control normal de TP en un tubo e incubarlo a 37C en
el bao de Maria durante 2 minutos.
- Aadir con fuerza 100 L del Reactivo de TP al tubo del inciso 3) y

cronometrar hasta la formacin de hilos de fibrina.
- Repetir el inciso 3) y 4) para el control patolgico y la muestra.
MUESTRA
TIEMPO EN
INR
SEGUNDOS
Control Normal
--
Control Patolgico
--
Muestra No. 1
Muestra No. 2
II. Tiempo de Sangra
- Se utiliza la zona que esta 15 a 20 mm por encima de la porcin grasa
redonda del lbulo de la oreja.
- Calentar la oreja.
- Desinfectar el rea a puncionar.

- Colocar una lmina portaobjetos detrs del pabelln de la oreja (esto con
la finalidad de darle firmeza a la puncin que se ejecutar).
- Usando una lanceta, se perfora el lbulo de la oreja mediante un golpe

firme. La herida deber ser lo suficientemente posible profunda para que
fluya libremente la sangre sin apretar con el dedo.
33
- Activar el cronmetro inmediatamente

- A intervalos de medio minuto, recoger la cota de sangre que se forma en
la oreja con un pedazo de papel mayordomo
- Cuando el papel ya no absorba nada, detener el cronometro. - Reportar el

tiempo transcurrido en minutos y segundos.
Anexo
Investigue lo siguiente
1. Clnicamente cual es el comportamiento del TP, cuando hay administracin
de anticoagulantes en un paciente, explique el por qu.
2. Cuantos factores de la coagulacin existen, mencione cada uno de ellos
Bibliografa
1. Prez Folgar, JR, Fernndez Ch., JG. Manual de Prcticas de Laboratorio

de Hematologa Bsica. Guatemala. USAC. 2002. 102 p.
2. Ficha tcnica NEOPLASTINE CI PLUS. Diagnostica Stago, Francia.
34
D RA . DORA INS
MAZARIEGOS C ORDERO
MODIFICADO
POR:
LICDA .
NANCY
D EL C ID
(2011)
PRCTICA NO. 4
FUNCIN
RENAL:
DETERMINACIN DE
CREATININA
Introduccin
La prueba que se usar en el laboratorio es un mtodo colorimtrico de punto
final para la deteccin de creatinina en suero u orina.
El principio del mtodo
se basa en que la creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un
complejo de color rojo. La intensidad de color es proporcional a la concentracin

de creatinina en la muestra, lo cual permite su cuantificacin con el uso de
estndares de creatinina de concentracin conocida.
Objetivos
Que el estudiante
1. Realice un mtodo espectrofotomtrico para determinacin de analitos en
muestras biolgicas.
2. Practique la preparacin de curvas de calibracin con estndares de

concentracin conocida.
Alcance
Que el estudiante
1. Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones.
2. Aprenda a realizar clculos de concentracin por interpolacin usando
curvas de calibracin
3. Interprete resultados clnicos.
35
Antecedentes
Los niveles de creatinina srica y la excrecin urinaria son una funcin de la
masa muscular en personas normales, y muestran muy poca respuesta a cambios
en la dieta.
La creatinina deriva de la deshidratacin no enzimtica de la
creatina en msculo esqueltico. La cantidad de creatina por unidad de masa
muscular es constante, y por lo tanto la tasa de deshidratacin de creatina es

constante tambin-.
Por lo tanto la concentracin de creatinina srica es muy
estable, con variaciones diarias de menos del 10%.

La creatinina es un compuesto sumamente difusible y se elimina del
organismo casi exclusivamente por filtracin renal: Es filtrada libremen te en el

glomrulo y no es reabsorbida en los tbulos. Por estas propiedades, la tasa de
depuracin de creatinina puede ser usada como estimacin de la funcin
glomerular.
Su determinacin en suero y la tasa de depuracin de creatinina
endgena constituyen parmetros importantes para el diagnstico de diversas

afecciones renales.
La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el picrato
alcalino para formar un complejo de color rojo.
La intensidad del color se
cuantifica con un espectrofotmetro, a una longitud de onda de 510 nm, y por

interpolacin (comparacin) con la absorbancia de un estndar o curva estndar
se obtiene la concentracin de la muestra que se analiza.
Como otros
compuestos de la muestra tambin reaccionan con la muestra, para eliminar la

interferencia se agrega cido, el cual destruye el complejo picrato -creatinina pero
no los otros complejos. La concentracin de creatinina se calcula por diferencia
entre la absorbancia (intensidad de color) antes y despus de agregar e l cido.

Pre-laboratorio
1. Qu es la creatinina?
2. Investigue las patologas que presentan alteraciones de los valores de
creatinina srica y urinaria.
36
3. Haga los clculos necesarios para obtener 1 mL de una muestra de orina
diluida para cada una de las siguientes diluciones: 1:2, 1:50, 1:100 y 1:200
de la muestra de orina.
Materiales
a. Reactivos
Muestras de suero y orina de 24 horas diluida 1:50
Solucin salina, NaCl al 0.9%
Estndar de creatinina, 2.0 mg/dL
Solucin de cido pcrico 41 mmol/L
Solucin de buffer alcalino, pH 12.4
Reactivo de trabajo: Prepare en frasco de plstico mezcla a partes
iguales de cido pcrico y buffer alcalino.
Solucin stop, cido actico al 20%
b. Instrumentacin
Espectrofotmetro, lectura a 510 nm
Celdas para espectrofotmetro
Bao de agua a 37C
Reloj o timer
Micropipetas de 2 a 20 L, 10-100
Puntas para micropipeta
c. Cristalera
Tubos Eppendorf de 1.5 mL
Tubos de vidrio
37
L, 200-1000
Precauciones
Los reactivos utilizados son txicos y corrosivos. Maneje todas las soluciones
con cuidado. Evite derrames y el contacto directo con la piel y mucosas.
Toda muestra biolgica debe tratarse como potencialmente infecciosa, por lo
cual debe cumplirse con las normas de bioseguridad adecuadas. De be usarse

guantes en todo momento, as como ser cauteloso durante la manipulacin.
Procedimiento
Seguir el siguiente esquema de pipeteo en cada tubo de ensayo debidamente
identificados:
Blanco
Estndar
Muestra de
Muestra de
Suero
orina
Estndar
--
10 L
--
--
Muestra Suero
--
--
10 L
--
Muestra Orina
--
--
--
10 L
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Reactivo
de
Creatinina
Mezcle e incube por 10 min en bao a 37C
Dentro de los 15 minutos despus de retirarlo del bao, leer e l
estndar y las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de
onda de 510 nm. Llevando el equipo a cero con el Blanco
Stopper
50 L
--
50 L
50 L
Mezclar y dejar los tubos 5 minutos a temperatura ambiente y volver

a leer las muestras, llevando a cero con el blanco.
38
Calculo de resultados
Creatinina en suero (mg/dL)= (Abs 1- Abs2)* F

F= 2.0 mg/dl
Abs. Estndar
Creatinina en orina (g/24 horas)=
Abs1-Abs2
0.020 g/L * 50 *
Vol en L
Abs. Estndar
Depuracin de Creatinina Endgena (D.C.E)=

La creatinina tiene la ventaja de que es un compuesto endgeno, por lo
tanto lo forma nuestro propio cuerpo. La creatinina se sintetiza por la
deshidratacin de la creatina-P (un reservorio de energa), la cual es

sintetizada a partir de 3 aminocidos: glicina, arginina y metionina.
Si existe por ejemplo 1 mg de creatinina por mililitro de plasma y se
filtran 125 o 130 ml de plasma cada minuto, en la orina aparecen 180

mg de creatinina en cada minuto, esto significa que aparecieron 50 mg
de creatinina ms de lo que podra esperarse si la creatinina solo se
hubiera filtrado, sin embargo la creatinina tambin es secretada en los

tbulos de la nefrona y por eso cada minuto realmente se depura la
creatinina de 180 ml de plasma y no 130 ml como en el caso de la

inulina que solo se filtra.
La UREA, es otro compuesto que en alguna oportunidad tambin se uso
para medir tasa de filtracin glomerular. Si en el plasma existen 20 mg

de urea por cada 100 ml y se filtran 130 ml de plasma cada minuto,
entonces se filtran 26 mg de urea cada minuto, pero en la orina de cada
39
minuto solo aparecen 12.22 mg, quiere decir que el resto (26-12.22=13.78
mg) se
reabsorbi, por lo tanto, del 100 % de urea que se filtr se
reabsorbi el 53 %, en los tbulos y se excret
el 47 %
La velocidad del filtrado glomerular o tasa de filtracin glomerular en una

persona adulta sana es de 125 ml por minuto, en las mujeres se debe
de considerar un 10 % menos. Para la eliminacin de creatinina corregida

con la superficie corporal, la TFG es para los hombres adultos de
a 137 ml/min y para las mujeres de 88 a 128 ml/min.
97
TFG = U (mg/dl) x V (ml/24 h) / P (mg/dl x 1440 min x 1.73/A

TFG = tasa de filtracin glomerular
U
= concentracin de creatinina urinaria
= volumen de orina eliminada en 24 horas (1440 minutos)
P
A
= concentracin de creatinina en el plasma

= Area de superficie corporal de la persona a quien se investiga
Los valores normales de creatinina en orina y plasma son:

Los hombres tienen un valor de creatinina urinaria de 0.8 a 2.4 g/da
Las mujeres tienen un valor de creatinina urinaria
de 0.6 a 1.8 g/da
La diferencia consiste en que la creatinina en la orina esta en relacin a
la masa muscular y los hombres tienen ms masa muscular que las

mujeres.
La creatinina en plasma para hombres y mujeres es menor o igual a

1.2 mg/dl
D.C.E. (ml/min)= Creatinina en orina de 24 horas (g/24 horas) * 694 mL/min

Creatinina en suero (mg/L)
40
Valores de referencia
Suero:
Hombres 0.64 - 1.04 mg/dL

Mujeres
Orina:
0.57 - 0.92 mg/dL
Hombres 1.0 2.0 g /24 horas

Mujeres
0.8 1.8 g /24 horas
Depuracin de creatinina: 80-140 mL/min

1.
Ficha tcnica Creatinina Directa.
864101004.
Wiener Lab, Rosario,
Argentina
2.
Kaplan, L. A. y A. J. Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry.

Theory, Analysis, Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc.
41
R EALIZADO POR: LICDA . GABRIELA CIFUENTES MODIFICADO
POR:
LICDA .
NANCY
DEL C ID (2011)
PRCTICA NO. 5
FUNCIN
RENAL:
D ETERMINACIN DE N ITRGENO
DE
U REA
Introduccin
La concentracin de urea ser cuantificada espectrofotomtricamente, en
donde la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, presente en la muestra, en
amonaco (NH3) y anhdrido carbnico (CO2). El amonaco formado se incorpora

al -cetoglutarato por accin de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con
oxidacin paralela de NADH a NAD+.
ureasa
Urea
+ H2O
2 NH3 + CO2
GIDH
NH3 + NADH + H + 2-oxoglutarato
I-glutamato + NAD+ +
H2O
Objetivos
Que el estudiante
1. Realice la prueba de determinacin de nitrgeno de urea.
2. Use los valores obtenidos para evaluar la condicin del
paciente.
Alcance
Que el estudiante
1. Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones.
42
Antecedentes
La urea se forma en el hgado con la ayuda del CO2, y constituyen el
producto final del metabolismo de las protenas. La cantidad de urea excretada
est directamente relacionada con la ingesta de protenas en la dieta, aumentada

en estados febriles, diabetes, y actividad de la glndula adrenal.
El test de Nitrgeno de Urea mide la porcin de nitrgeno de la urea, y es
usada como ndica de funcin glomerular. Sus niveles se aumentan en necrosis

tisular, catabolismo proteico.
Sus niveles se correlacionan mejor con la
sintomatologa de uremia que los niveles de creatinina.
Su aumento es signo elemental de insuficiencia renal orgnica, pero hay que
tener en cuenta que no todo aumento significa nefropata, pues tambin se eleva
por causas extrarrenales.
Niveles altos se encuentran en uremia aguda, glomerulonefritis aguda, anuria
traumtica, choque hemoltico
post-transfusional, nefrosis, esclerosis renal,
hidronefrosis, tuberculosis renal, pielonefritis y rin poliqustico.

Cuando el aumento obedece a causa extrarrenal, es fenmeno agudo o
subagudo, pero reversible a veces en pocas horas, como sucede en la
deshidratacin aguda, donde por la maana se puede encontrar en 40 mg/dL y

en la tarde estar dentro de la normalidad.
Igual ocurre en los vmitos intensos, diarreas, sudoracin profusa, quemaduras
extensas, infecciones que ocurren por protelisis tisular aumentada, en el coma
diabtico, en el post-operatorio inmediato, insuficiencia suprarrenal y en la agona,

donde intervienen factores de hipotensin.
Pre-laboratorio
1. Mencione 3 patologas que se asocien a la alteracin del nitrgeno de urea
y mencione los sntomas de cada una de ellas.
Materiales
a. Reactivos
Muestra de suero
43
Reactivo de trabajo, el cual consta de una mezcla de buffer y

enzimas (2oxoglutarato, NADH, ureasa y glutamato
deshidrogenasa)
Estndar con una concentracin de 0.60 g/L
b. Instrumentacin
Cronometro
Micropipetas de 2 a 20 L, 10-100
L, 200-1000

Gradilla
c. Cristalera
Tubos de vidrio
Procedimiento
Seguir el siguiente esquema de pipeteo en cada tubo de ensayo, debidamente
identificados:
Estndar (S) Muestra 1 (Mx1)
Muestra 2 (Mx2)
Estndar
--
10 L
--
Muestra Suero 1
--
--
10 L
Muestra Suero 2
--
--
--
1 mL
1 mL
1 mL
Reactivo de trabajo
Mezclar (sin invertir) y disparar un cronometro

A los 60 segundos exactos medir la absorbancia de los tres tubos, la cual ser la
ABS1 para las muestras y S1 para el estndar.
Continuar con la incubacin

Medir nuevamente la absorbancia a los 120 segundos (60 segundos despus de la
primera lectura) la cual ser la ABS2 para las muestras y S2 para el estndar.
44
Urea (g/L) = f * (ABS1 ABS2)
En donde f =
0.60 g/L
(S1 S2)
Para la determinacin del Nitrgeno de Urea: divida el resultado de la Urea /

2.14
Nota: para el reporte de sus resultados, deber de calcular la concentracin
de Nitrgeno de Urea en mg/dL.
Urea = 15 39 mg/dL
Nitrgeno de Urea = 7 20
mg/dL
Anexo:
Investigue sobre la reaccin de Berthelot modificada
Bibliografa
1. Ficha tcnica Urea Cintica. 861237005. Wiener Lab. Rosario,
Argentina
2. ngel, Gilberto
y ngel, Mauricio. Interpretacin Clnica del
Laboratorio. 7. Edicin. Editorial Mdica Panamericana. 2006.

Bogot.
45
D RA . DORA INS
MAZARIEGOS C ORDERO
PRCTICA NO. 6
D ETERMINACIN
ENZIMTICA DE CIDO RICO
Introduccin
La concentracin de cido rico ser cuantificada espectrofotomtricamente
a travs de la reaccin de cido rico catalizada por uricasa, aco plada a la
formacin de un complejo de color.
La uricasa cataliza la reaccin del cido
rico presente en la muestra, para formar alantona y perxido de hidrgeno

(H2O2).
El H 2O2 formado reacciona por la actividad cataltica de la peroxidasa
con cido 3,5-dicloro-2hidroxibencensulfnico (DCHBS) y 4-aminofenazona

(PAP) para producir un complejo rojo-violeta de quinoneimina que se cuantifica
en el espectrofotmetro con una longitud de onda de 520 nm.
uricasa
cido rico + O2 + 2H2O
Alantona + CO2 + H2O2

peroxidasa
2 H2O2 + DCHBS + PAP
Quinoneimina + HCl + 4H2O
Objetivos
Que el estudiante
1. Se introduzca a los mtodos enzimticos para
determinaciones clnicas.
2. Estudie las patologas asociadas con cido rico
elevado.
Alcance
Que el estudiante
1. Contine familiarizndose con la aplicacin de mtodos espectrofotomtricos
para determinacin de analitos en muestras biolgicas.
46

Antecedentes
El cido rico es el mayor producto del catabolismo de los nuclesidos
de purina.
Las purinas provenientes de la dieta se convierten a cido rico
directamente. Sin embargo la mayor parte de las purinas que se excretan como
cido rico en la orina proviene de la degradacin de cidos nuc leicos
endgenos.
Un 75% del acido rico excretado por los seres humanos es
excretado por la orina, el resto es secretado al tracto gastrointestinal, donde se

degrada a alantona y otros compuestos por las enzimas bacterianas.
El manejo renal es complejo y ocurre en 4 pasos: (1) filtracin glomerular;
(2) reabsorcin de 98-100% en el tbulo proximal convolucionado; (3) secrecin

hacia el lumen en la porcin distal del tbulo proximal; y (4) nueva reabsorcin
en el tbulo distal.
La filtracin neta de cido rico es de 6 a 12% de la
cantidad filtrada.
La hiperuricemia se define como concentraciones de cido rico en sangre
mayor a 6.0 (mujeres) o 7.0 mg/dL (hombres). La manifestacin clnica extrema
de hiperuricemia ocurre en forma de gota, cuando el urato monosdico precipita

de los fluidos sobresaturados. Los depsitos de urato son los responsables de
los sntomas La artritis gotosa puede asociarse con cristales en fluido articular,
y depsitos de cristales en los tejidos que rodean la articulacin.
Cuando los
depsitos ocurren en tejido blando, producen una respuesta inflamatoria intensa

mediada por leucocitos polimorfonucleares y macrfagos.
La gota primaria se asocia con hiperuricemia esencial debido a la
sobreproduccin metablica de purinas o excrecin disminuida de cido rico.

La
gota
secundaria es
resultado
de
hiperuricemia asociada a
causas
identificables. La falla renal aguda o crnica puede producir retencin renal de

cido rico.
Algunos medicamentos, en particular diurticos p ueden ser la
causa de la falla. La acidemia orgnica por aumento del cido acetoactico en
diabticos, o la acidosis lctica pueden interferir con la secrecin tubular del

urato.
En clulas tumorales, el rpido recambio de cidos nucleicos puede
tambin inducir hiperuricemia.
47
El nivel de cido rico en la sangre se incrementa gradualmente con la
edad, aumentando un 10% entre los 20 y 60 aos de edad.
Las mujeres
muestran un aumento considerable despus del inicio de la menopausia,

alcanzando niveles similares a los reportados en hombres.
Un acercamiento a la interpretacin de valores de cido rico srico es

considerar el grado de hiperuricemia en relacin con el riesgo de desarrollo de
gota.
Hombres con valores de cido rico por encima de 9.0 mg/dL tienen
alrededor de 150 veces ms riesgo de tener artritis gotosa que el grupo de

hombres con valores menores a 6.0 mg/dL. La excrecin de cido rico
Los mtodos que involucran reacciones enzimticas tienen
mayor
especificidad que otros mtodos colorimtricos debido a que el sustrato reacciona

especficamente con la enzima utilizada.
La uricasa cataliza la oxidacin del
cido rico a alantona, con produccin de H 2O2.
En este procedimiento se
utiliza un sistema de peroxidasa acoplado con molculas aceptoras de electrones

que producen un cromgeno, o molcula coloreada. Se reducen la interferencias
con metabolitos como bilirrubina o cido ascrbico usando molculas complejas,

como el fenol substituido de la aminofenazona.
Prelaboratorio
1. Investigue en que situaciones se pide anlisis de cido rico.
2. Haga un cuadro de causas de hiperuricemia.
3. Cules son los diferentes mtodos para la identificacin de cido rico?
4. Investigue cuales son los valores normales de cido rico en sangre y en
orina de 24 horas
Materiales
a. Reactivos
- Estndar de cido rico, 8
mg/dL - Solucin de reactivo
48
enzimtico Buffer fosfato, pH

7.0, 50 mmol/L
4-aminofenazona, 0.3 mmol/L

DCHBS
4 mmol/L
Uricasa > 200 U/L

Peroxidasa>1000 U/L
b. Cristalera
Tubos de vidrio de 10 mL
c. Instrumentacin
Bao de agua a 37C
Micropipetas de de 2 a 20 L, 20-200
L, 200-1000
Puntas para micropipeta azules y amarillas
Procedimiento
1. Prepare una dilucin 1:11 de la muestra de orina.
Blanco
Estndar
Muestra
Suero
Muestra Orina
Estndar (S)
Muestra de
Muestra de orina
Suero (Mx1)
(Mx2)
--
20 L
--
--
--
--
20 L
--
--
--
--
20 L
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
diluida
Reactivo
de
Acido Urico
Mezcle e incube a temperatura ambiente por 20 min o 5 min en el bao de mara.
Mida la absorbancia en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 520 nm
49
Para medir la absorbancia, transfiera 1 mL a la celda espectrofotomtrica

Mida en el siguiente orden: Estndar, muestra suero y muestra orina frente al Blanco antes de 15
min.
Acido rico en suero (mg/dL): Abs de Mx1
* Concentracin del Estndar
Abs de S
Acido rico en orina (mg/24 horas):
Abs de Mx2
* Concentracin S * 11 * Vol
Abs de S
Suero:
Hombres: 3.4 a 7.0 mg/dL
Mujeres: 2.4 a 5.7 mg/dL
Orina:
250 a 750
mg/24
horas
3. Ficha tcnica URIC ACID Liquicolor. 106901E Human, Wiesbaden, Alemania.
4. Burtis, C. y E. Ashwood.
2001.
Fundamentals of Clinical Chemistry.
Edicin. W.B. Saunders Company, Filadelfia, USA. p 422-426.
50
5.
R EALIZADO POR: LICDA . SARA
DRA . D ORA INS
MAZARIEGOS C ORDERO
MODIFICADO
POR:
LICDA . GABRIELA C IFUENTES (2009), LICDA . N ANCY D EL C ID
(2011)
PRCTICA NO. 7
EL ELISA COMO
UN ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO
Introduccin
El ELISA (por el trmino en ingls Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) es
uno de las tcnicas clnicas ms utilizadas para fines de diagnstico humano.

Como su nombre lo indica, est relacionado con el uso de partculas inmunolgicas
unidas a un soporte para la deteccin de la especie que se busca. En la presente

prctica se realizar una simulacin de anlisis de ELISA para la mejor comprensin
de la base qumica e inmunolgica de la prueba.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Simule una prueba de ELISA para una especie especfica, sea esta patgena
o no
2. Diferencie entre ELISA directo, ELISA tipo sndwich y ELISA indirecto
Alcance
El estudiante
1. Reconocer el esquema de cada uno de los tres tipos diferentes de ELISA
que existen
2. Podr describir la base inmunolgica de una prueba de ELISA

3. Explicar el por qu la especificidad del anlisis de ELISA
51
Antecedentes
El
radio
inmmunoensayo (RIA, por sus siglas en

ingls) y el ensayo inmunoadsorbente
ligado a una enzima (ELISA, por sus

siglas en ingls) son ensayos que
involucran
la
unin
directa
de
un
anticuerpo para la determinacin de un
antgeno o anticuerpo buscado, aunque

la forma de deteccin final en ambos
procedimientos es diferente.
radioinmunoensayo generalmente se
Figura 1: Placa de ELISA, con anlisis
El
terminado.
utiliza para la medicin de hormonas en sangre y tejidos, mientras que el ELISA

se usa frecuentemente en diagnsticos virales (como HIV).
Para ambos mtodos,
se requiere la preparacin de un antgeno o anticuerpo conocido puro (o ambos)

para lograr estandarizar la prueba. Estandarizar la prueba significa asegurar que
la prueba funcionar bien y de la misma forma para la muestra de cualquier

paciente, siempre y cuando sea el mismo tipo de muestra.
En el ELISA directo se mide o detecta la presencia de un antgeno especfico
en la muestra, mientras que en el ELISA indirecto se mide o detecta la presencia

de un anticuerpo especfico.
Una versin modificada del ELISA directo, llamada
ELISA tipo sndwich, mejora la sensibilidad del anlisis, cuando se requiere, usando
un anticuerpo de captura para el antgeno que se busca. En cualquier caso, el
ELISA se lleva a cabo en placas de 96 pozos de material plstico especial, como
la que se muestra en la Figura 1.
Mientras que el radio inmunoensayo la deteccin se realiza midiendo la cantidad
de radiacin que permanece en el pozo de la placa, en el ELISA se realiza por
una reaccin que convierte un sustrato incoloro a una sustancia coloreada dentro
del pozo, usando para ello una enzima unida a un anticuerpo. El cambio de color
puede verse directamente en la placa, haciendo que la recoleccin de datos sea
ms fcil, a la vez que evita los riesgos del manejo de material radioactivo.
por ello que esta tcnica es la preferida por encima del RIA.
PreLaboratorio
52
Es
Antes de llegar al laboratorio, investigue:

1.
Qu aplicaciones diagnsticas importantes tiene el ELISA?
2.
Qu significa un anlisis de tamizaje (o, en ingls, screening test)
3.
Explique de qu depende la especificidad de un anlisis de ELISA.
4.
En qu consiste el ELISA directo, indirecto y tipo sanwich?
Materiales
a. Reactivos
- Calibrador 1
- Enzima conjugada
- Calibrador 2
- Sustrato
- Muestra1
- Solucin de lavado
- Muestra 2
- Solucin STOP
b. Otros
- Placa para ELISA
Procedimiento
1. Se le dar una tira con pozos inactivos para ELISA
2. Seguir el siguiente esquema de pipeteo para una prueba de ELISA
Pozo
Calibrador 1
A1
B1
C1
20L
Calibrador 2
20L
Muestra 1
20L
Muestra 2
Conjugado
D1
20L
200L
200L
200L
200L
Mezclar e Incubar por 10 minutos a T ambiente

Lavar con 400L cada pozo (repetir 3 veces)
Substrato
100L
100L
100L
100L
Incubar por 5 minutos a T ambiente, en oscuridad

STOP
100L
100L
100L
Mezclar cuidadosamente
53
100L
Anexo
Investigue qu pruebas clnicas se realizan con ELISA.
Adems, investigue qu
otros tipos de ELISA existen adems de los tres ya mencionados.

1. The Biology Project.
febrero,
ELISA Activity.
1998.
Pgina consultada el 25 de
2007.
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html
2. Janeway, C. A. et al. 2001. Inmunobiology. 5a Edicin. Garland Science

Publising, New York.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&dep
th=10
54
DRA . D ORA INS
MAZARIEGOS C ORDERO
MODIFICADO
POR:
LICDA . N ANCY
DEL
CID (2011)
PRCTICA NO. 8
D ETERMINACIN C UALITATIVA DE TIROXINA Y TRIIODOTIRONINA
Introduccin
En la presente prctica se llevar a cabo una prueba de ELISA para determinar
la presencia de tiroxina total en muestras desconocidas. Esta prctica pretende
ilustrar al estudiante sobre cmo se lleva a cabo una determinacin sencilla usando
la tcnica de ELISA, enfatizando los cuidados que debe tenerse para asegurar el
resultado obtenido.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de T4
total en muestras desconocidas.
2. Reconozca los cuidados que debe tenerse durante todas las etapas de la
realizacin de una prueba de ELISA
Alcance
Que el estudiante:
1. Explique el esquema de la tcnica de ELISA utilizado.
2. Demuestre la forma correcta de utilizar una micropipeta.
3. Indique la importancia de realizar correctamente los lavados durante una
determinacin por tcnica de ELISA
4. Conozca la forma correcta de manejar una muestra clnica para asegurar su
integridad y la calidad de los resultados obtenidos
5. Practique las precauciones indicadas durante el manejo de muestras clnicas.
55
Antecedentes
Tiroxina T4 total Tetraiodotironina
La Tiroxina es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Ms
del 99% de T4 en la sangre est unida reversiblemente a las protenas

plasmticas (principalmente a Globulina unida a Tiroxina, TBG), quedando
una parte muy pequea libre, que es la porcin que controla los procesos
metablicos.
Es parte integrante del perfil tiroideo, el cual se emplea en el diagno stico

de toda afeccin tiroidea y su dosificacin aislada, debe de interpretarse con
reservas. Sin embargo, en el recin nacido, su dosificacin permite

diagnosticar precozmente el hipotiroidismo congnito y evitar el retraso
mental.
Niveles elevados de T4 han sido encontrados en hipertiroidismo debido a

enfermedad de Grave y de Plummer as como en tiroiditis aguda y subaguda.
Bajos niveles de T4 han sido asociados con cretinismo, mixedema,

enfermedad de Hashimoto y algunas anormalidades genticas.
Triiodotironina T3 total
Es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Ms del 99% de
T4 en la sangre est unida reversiblemente a las protenas plasmticas. La
concentracin de T3 es mucho ms baja que la de T4, pero su potencia
metablica es mucho ms alta. Al igual que la T4, la T3 representa una

herramienta muy valiosa para el diagnstico de enfermedad tiroidea.
PreLaboratorio
Antes de llegar al laboratorio, investigue:
1. Qu significa el trmino ELISA competitivo?
2. Para la realizacin de T3 y T4 se utilizar un ELISA de tipo competitivo,
hacer un esquema de este tipo de ELISA.
Materiales
a. Reactivos
Calibradores
56
Enzima Conjugado-antignico
Solucin de lavado
Reactivo Sustrato
Solucin STOP
Muestra desconocida para T3 y T4
b. Instrumentacin
Tiras de micropocillos
Micropipetas de 10 a 100 L, 100-1000 L
Puntas para micropipeta azules y amarillas
Procedimiento
1. Se le proporcionarn las muestras a utilizar para el anlisis. En este caso,
debe usarse muestras de suero o plasma (Cul es la diferencia?), que se
haya obtenido usando EDTA o heparina como anticoagulantes.
No debe
usarse muestras hiperlipidmicas o hemolizadas (Qu quiere decir esto y

por qu?).
2. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente ante s de usarse.

Para obtener resultados reproducibles, es importante agregar los reactivos
en el mismo orden y con el mismo tiempo en todos los pocillos.
Determinacin de T3
Pozo
Calibrador 1
A1
B1
C1
D1
E1
50L
Calibrador 2
50L
Calibrador 3
50L
Muestra 1
50L
Muestra 2
Conjugado
50L
100L
100L
100L
100L
100L

57
Substrato
100L
100L
100L
100L
100L

STOP
50L
50L
50L
50L
50L
Mezclar cuidadosamente e interpretar

Determinacin de T4
Pozo
Calibrador 1
A1
B1
C1
D1
E1
25L
Calibrador 2
25L
Calibrador 3
25L
Muestra 1
25L
Muestra 2
Conjugado
25L
100L
100L
100L
100L
100L

Substrato
100L
100L
100L
100L
100L

STOP
50L
50L
50L
50L
50L

- Se le darn diferentes calibradores (por mesa se utilizarn 3), los cuales
tienen una concentracin conocida de T3 o T4.
- Calibradores para T3
o A = 0 ng/mL
o B = 0.50 ng/mL
o C = 1.00 ng/mL
o D = 2.50 ng/mL
o E = 5.00 ng/mL
o F = 7.50 ng/mL
58
- Calibradores para T4
o A = 0 g/mL
o B = 2.0 g/mL
o C = 5.0 g/mL
o D = 10.0 g/mL
o E = 15.0 g/mL
o F = 25.0 g/mL
- Deber de tener en cuenta que prueba est realizando su mesa, si T3 o T4.

- Deber de conocer cuales calibradores est utilizando su grupo de trabajo.
Interpretacin de resultados
Los resultados se interpretaran de la siguiente manera:
- Anotar la intensidad de color de sus calibradores y de sus muestras por medio
de cruces, siendo de menor (+) a mayor (+++) intensidad.
- Los calibradores le servirn para que pueda comparar estos contra su muestra
y as saber la concentracin de cortisol presente en sus muestras.
Anexo
Investigue brevemente qu condiciones mdicas pueden dar origen a niveles
alterados (elevados o disminuidos) de la hormona T4 y T3. Existen otras pruebas

que deben acompaar a stas?
1. Kaplan, L. A. y A. J. Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry.
Theory, Analysis, Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc. pg. 827-848
2. Inserto del producto. T4
Prueba ELISA para la determinacin cuantitativa
de Tiroxina Total (T4) en suero o plasma humanos.
59
R EALIZADO POR: LICDA . GABRIELA CIFUENTES

MODIFICADO
POR:
LICDA . N ANCY
DEL
CID (2011)
PRCTICA NO. 9
D ETERMINACIN C UALITATIVA
DE CORTISOL POR EL MTODO DE
ELISA
Introduccin
El cortisol es el principal glucococorticoide secretado por la corteza suprarrenal
humana y el esteroide ms abundante en la sangre perifrica.
Estudios han
demostrado que todo el cortisol secretado deriva del colesterol circulante en

condiciones
basales
como
resultado
de
la
estimulacin
aguda
con
adrenocorticotropina (ACTH).
Objetivos
Que el estudiante:
1. Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de
cortisol en muestras desconocidas.
2. Reconozca los puntos crticos en la realizacin de una prueba de ELISA.

Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparacin de una placa de ELISA.
2. Explique el esquema de la tcnica de ELISA competitivo y pueda reconocer
las diferencias que existen entre cada tipo de ELISA.
Antecedentes
El cortisol, tambin llamado hidrocortisona o componente F, es un esteroide de
21 carbonos y es el glucocorticoide ms importante en el humano. Es formado y

secretado por la corteza suprarrenal. El 90% del cortisol est ligado a la protena
plasmtica transcortina, mientras que alrededor del 7% est unida a la albumina.

El resto de forma libre (alrededor de un 3%) es la forma biolgicamente activa del
cortisol, el cual puede determinarse en muestras de suero, plasma, saliva y orina.
60
Regulacin de la Secrecin de Cortisol

La secrecin del cortisol est determinada por el ndice de secrecin de ACTH
por parte de la adenohipfisis bajo la estimulacin del factor de liberacin de

corticotropina (CRF) procedente del hipotlamo.
El ndice de secrecin de ACTH
presenta el balance entre las influencias estimuladoras del sistema nervioso central
y las inhibidoras del cortisol circulantes sobre la hipfisis o los centros hipotalmicos.
El descenso del cortisol plasmtico no unido a protenas produce un aumento en

la secrecin de ACTH y un ascenso inhibe dicha secrecin. Sin embargo, pueden
producirse variaciones diarias de los niveles de ACTH en el plasma en ausencia
de toda variacin de los niveles plsmaticos de cortisol (Enfermedad de Addison),

por lo que la periodicidad circadiana parece ser secundaria a la periodicidad en la
secrecin de ACTH.
Esta secrecin puede comenzar a concentracin cero de
cortisol en plasma o a una alta concentracin de cortisol o ACTH, por lo que es
dudoso que el concepto usual de un mecanismo cerrado de retroaccin negativa

cumpla alguna funcin en la regulacin minuto a minuto de la secrecin de cortisol
en el hombre.
En el hombre, el ndice de secrecin de ACTH d ha calculado en unos 10g/da
y la concentracin plasmtica, entre las 6 y las 9 de la maana, en 20100pg/ml.

Las concentraciones plasmticas de ACTH y cortisol, muestran en individuos
normales no sometidos a estrs, variaciones cclicas constantes en un periodo de
24 horas.
En sujetos que tienen un ciclo sueo-vigilia normal, los niveles
plasmticos son el resultado de una serie de episodios secretorios distintos y son
ms elevados entre la 6 y las 9 de la maana, para descender lentamente hasta
alcanzar valores prximos a cero cerca de medianoche. La se crecin episdica

de cortisol y ACTH representa una serie de impulsos de amplitud y duracin
variable; durante estos episodios, el ndice de secrecin de cortisol puede variar

hasta 10 veces. Los impulsos de secrecin guardan correlacin generalmente con
la concentracin plasmtica de ACTH. No obstante, algunos individuos muestran
escasa correlacin entre la ACTH detectable por inmunoensayo o bioensayo y el

cortisol plasmtico.
El ritmo circadiano depende del esquema sueo -vigilia, y es
independiente de la ingestin de alimentos, del ejercicio o de la luz.
61
El acto
inmediato de dormirse o despertarse no es el determinanate directo de la actividad
suprarrenal, y el aumento de ACTH que se produce a diario antes del despertar

es
probablemente
una
respuesta
subconsciente de dich despertar.
condicionada
debida
la
anticipacin
Pre-Laboratorio
1. Qu significa la frase proceso de retroacoplamiento negativo?
2. Que tcnica analtica funciona mejor para la medicin de hormonas y por
qu?
3. Cul es la importancia de realizar una prueba de cortisol?
4. Haga un esquema para ejemplificar lo que sucede al realizar un ELISA
COMPETITIVO
Materiales
a. Reactivos
Muestra desconocida
Calibradores para cortisol
b. Equipo
Solucin de conjugado
Micropipetas de 2 a 20L
Solucin de lavado (diluida)
Solucin de sustrato
Micropipetas
Solucin STOP
de
100
1000L
Cloro 5%
Puntas para micropipetas
Alcohol 70%
Pocillos para ELISA
Procedimiento
Se le proporcionarn las muestras a utilizar para el anlisis, que pueden ser suero
o plasma obtenido con EDTA.
No debe usarse muestras hiperlipidmicas o
hemolizadas, ni deben contener azida de sodio. Todos los reactivos debern de
62
estar a temperatura ambiente antes de ser utilizados.
Para obtener resultados
reproducibles, es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con el

mismo tiempo.
Pozo
Calibrador 1
A1
B1
C1
D1
E1
20L
Calibrador 2
20L
Calibrador 3
20L
Muestra 1
20L
Muestra 2
Conjugado
20L
200L
200L
200L
200L
200L

Substrato
100L
100L
100L
100L
100L

STOP
100L
100L
100L
100L
100L
Mezclar cuidadosamente
Se le darn diferentes calibradores, los cuales tienen una concentracin
conocida de cortisol, identificados de la siguiente manera:
A = 0 ng/mL
B = 20 ng/mL
C = 50 ng/mL
D = 100 ng/mL
E = 200 ng/mL
F = 400 ng/mL
G = 800 ng/mL
- Deber de conocer cuales calibradores est utilizando su grupo de trabajo.

63

y as saber la concentracin de cortisol presente en sus muestras.
Anexo
1. Investigue brevemente qu condiciones mdicas pueden dar origen a niveles
alterados de cortisol
2. Qu pruebas complementarias deben acompaar al cortisol para dar un

diagnostico ms certero?
3. Menciones los efectos que tiene el cortisol sobre:

a. El metabolismo de los carbohidratos
b. El metabolismo de las protenas
c. El metabolismo de las grasas
4. Investigue la funcin del cortisol en el estrs y la inflamacin

Bibliografa
1. Kaplan, L.A. y Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry. Theory
Analysis Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc. Pag 827-848.
2. Lehninger Albert L. Bioquimica; las bases moleculares de la estructura y

funcin celular. 2. Edicin. Ediciones Omega, S.A. Pag. 832-834
3. Ficha tcnica CORTISOL. 55050 Human, Wiesbaden, Alemania
64
R EALIZADO POR: LICDA . N ANCY DEL
CID
PRCTICA N O. 10
D ETERMINACIN CUALITATIVA
DE
FSH Y LH
Introduccin
Entre las gonadotropinas hipofisiarias conocidas estn la hormona folculo
estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), las cuales son hormonas
glocoprotenicas encargadas de regular los ciclos sexuales.
Objetivos
Que el estudiante:
1. Realice una prueba de ELISA de tipo sandwich para detectar la presencia
de FSH y LH en muestras desconocidas.
2. Reconozca los puntos crticos en la realizacin de una prueba de ELISA.

Alcance
Que el estudiante
1. Adquiera destreza en el manejo y preparacin de una placa de ELISA.
2. Explique el esquema de la tcnica de ELISA de tipo sandwich y pueda
reconocer las diferencias que existen entre cada tipo de ELISA.
Antecedentes
Hormona Foliculo Estimulante (FSH)
Es una hormona glicoproteica de aproximadamente 35.5 kD, secretada por
la glndula pituitaria. Fisiolgicamente esta hormona acta en los testculos

y en los ovarios, donde induce la espermatognesis (en el hombre) y la
esteroidognesis (en la mujer) respectivamente. Todos los ciclos menstruales

tienen un patrn caracterstico
de secrecin de FSH.
Mientras la
concentracin disminuye con el progreso de la fase folicular, el valor ms
elevado se observa cerca del momento de la ovulacin, es decir, alrededor
65
de la mitad del ciclo.
La utilidad clnica y diagnostica de la medicin de
FSH para la evaluacin de la homeostasis que regula la fertilidad a travs

del eje hipotalmico-hipfisiario-gonadal ha sido bien establecida.
Hormona Luteinizante (LH)
Es una hormona glicoproteica de aproximadamente 30 kD, sintetizada en la
hipfisis.
Fisiolgicamente esta hormona acta en las gonadas donde es
esencial para su desarrollo y funcin. Durante la primera fase del ciclo
menstrual, la LH estimula el desarrollo del folculo de Graaf. La ovulacin

se induce por los valores ms altos de LH. La utilidad clnica y diagnostica
de la medicin de LH para la
para la evaluacin de la homeostasis que
regula la fertilidad a travs del eje hipotalmico-hipfisiario-gonadal ha sido

bien establecida. La determinacin de LH es indispensable para monitorear
pacientes sometidas a procedimientos de fertilizacin in vitro.
Pre-Laboratorio
1.
Cul es el principio del ELISA tipo sandwich?
2.
Qu relacin existe entre la hormona FSH y LH?
Materiales
a. Reactivos
Muestra desconocida
Calibradores para FSH y LH
Solucin de conjugado
Solucin de lavado (diluida)
Solucin de sustrato
Solucin STOP
Cloro 5%
Alcohol 70%
b. Equipo
66

Puntas para micropipetas
Pocillos para ELISA
Procedimiento
Se le proporcionarn las muestras a utilizar para el anlisis, que pueden ser suero
o plasma obtenido con EDTA.
No debe usarse muestras hiperlipidmicas o
hemolizadas, ni deben contener azida de sodio. Todos los reactivos debern de

estar a temperatura ambiente antes de ser utilizados.
Para obtener resultados
reproducibles, es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con el

mismo tiempo.
Pozo
A1
Calibrador 1
B1
C1
D1
E1
20L
Calibrador 2
20L
Calibrador 3
20L
Muestra 1
20L
Muestra 2
Conjugado
20L
200L
200L
200L
200L
200L

Substrato
100L
100L
100L
100L
100L

STOP
100L
100L
100L
100L
100L

1. Se le darn diferentes calibradores (por mesa se utilizarn 3), los cuales
tienen una concentracin conocida de FSH o LH.
2. Calibradores para FSH
A = 0 UI/L
B = 5.0 UI/L
67
C = 10.0 UI/L
D = 25.0 UI/L
E = 50.0 UI/L
F = 100.0 UI/L
3. Calibradores para LH
A = 0 UI/L
B = 5.0 UI/L
C = 25.0 UI/L
D = 50.0 UI/L
E = 100.0 UI/
F = 200.0 UI/L
4. Deber de tener en cuenta que prueba est realizando su mesa, si FSH o

LH.
5. Deber de conocer cuales calibradores est utilizando su grupo de trabajo.

y as saber la concentracin de FSH o LH presente en sus muestras.
Anexo
1. Investigue brevemente qu condiciones mdicas pueden dar origen a niveles
alterados de FSH y LH
2. Qu pruebas complementarias deben acompaar a la FSH y LH para dar

un diagnstico ms certero?
68
Bibliografa
1. Kaplan, L.A. y Pesce, S. C. Kazmierczak. 2003 Clinical Chemistry. Theory
Analysis Correlation. 4. Edicin. Mosby, Inc. Pag 827-848.
2. Lehninger Albert L. Bioquimica; las bases moleculares de la estructura y
funcin celular. 2. Edicin. Ediciones Omega, S.A. Pag. 832-834
3. Ficha tcnica FSH 53020 Human, Wiesbaden, Alemania

4. Ficha tcnica LH 53010 Human, Wiesbaden, Alemania
69
DRA . D ORA INS
MAZARIEGOS C ORDERO
PRCTICA N O. 11 D ETERMINACIN DEL LMITE DE
DETECCIN DE UNA PRUEBA
CUALITATIVA
PRUEBA
DE EMBARAZO
Introduccin
La prueba que se usar en el laboratorio es una prueba rpida de deteccin de
hCG en orina o en sangre como indicador de embarazo.
En esta prctica se
determinar el lmite de deteccin de la prueba, que se utiliza como cualitativa.

Objetivos
Que el estudiante
1. Realice una cromatografa inmunolgica para la deteccin de hCG
2. Determine el lmite de deteccin de una prueba cualitativa de deteccin de
hCG como prueba temprana de embarazo.
Alcance
Que el estudiante
1. Se inicie en el manejo de muestras de suero, aplicando todo sus conocimientos
de bioseguridad
2. Aprenda el uso de las micropipetas
3. Relacione cada muestra con la realidad personal de un paciente
Antecedentes
La gonadotropina corinica humana (hCG) es una hormona glucoproteica
producida por la placenta en desarrollo poco despus de la fertilizacin.
En el
embarazo en un ser humano, la hCG puede detectarse tanto en orina como en
suero a partir de los 7-10 das de la concepcin. Los niveles de hCG continan
aumentando muy rpidamente superando las 100 mUI/mL tras la primera falta y
alcanzando el mximo en torno a 100,00 a 200,000 mUI/mL a las 10 a 12 semanas
de embarazo. La aparicin de hCG en la orina y el suero poco despus de la
70
concepcin y su rpido aumento posterior durante el principio de la gestacin hacen

de esta hormona un marcador ideal para la indicacin temprana del embarazo
La prueba de embarazo en tarjeta es una prueba rpida que detecta

cualitativamente la presencia de hCG en una muestra de orina o suero con una
sensibilidad de 25 mUI/mL.
La prueba utiliza una combinacin de anticuerpos
monoclonales y policlonales para detectar selectivamente los niveles elevados de

hCG en orina o suero.
interferencias
Con este nivel de sensibilidad, la prueba no muestra
cruzadas con
otras
hormonas glucoproteicas estructuralmente
relacionadas, tales como la FSH, la LH y la TSH a niveles fisiolgicos altos.
Esta prueba se basa en un inmunoensayo de flujo cromatogrfico en un solo
paso que permite detectar selectivamente los niveles elevados de hCG. El ensayo
se realiza aadiendo la muestra al pozo de la placa y observando la presencia o
ausencia de bandas en la ventana de resultados. En el pozo de la muestra se

encuentra un conjugado de anticuerpo monoclonal de ratn contra hCG y partculas
coloidales de oro, que migra hacia las lneas de prueba y control.
Si la muestra
contiene hCG, el complejo hCG-antihCG-oro se une al anticuerpo de captura en la

lnea de prueba y se desarrolla un color rosado-vino tinto.
La ausencia de esta
lnea sugiere un resultado negativo. Se incluye una lnea de control, que contiene
anticuerpos policlonales de cabra contra ratn, y debe formarse siempre,

independiente que la muestra contenga hCG o no.
La formacin de color en la
lnea control asegura que la prueba ha sido efectuada correctamente.

Materiales
a. Reactivos
Muestra de suero con contenido de hCG conocido
Prueba rpida de embarazo, placa de reaccin y gotero incluido
Solucin salina (NaCl 0.9%) para diluir
b. Cristalera
Tubo Eppendorf de 1.5 mL
71
Procedimiento
1. Escuche atentamente a su instructor, quien le indicar la forma adecuada
de utilizar una micropipeta y realizar diluciones.
2. Tome la muestra que le corresponda a su mesa (de su compaero de la

izquierda) y realice la dilucin que le haya tocado. Anote en su registro la
concentracin de la muestra que le lleg y la que usted produ jo. Pase su

muestra a su compaero de la derecha.
3. Obtenga una prueba para hCG y rompa la bolsa. No toque las membranas
reactivas con los dedos.
4. Coloque la placa en una superficie nivelada y limpia.

5. Manteniendo el gotero en posicin vertical, agregue 4 gotas (unos 100 L)
de muestra a pozo de la placa marcado con S (SAMPLE).
6. Espere cinco minutos a que aparezcan las lneas correspondientes al control

(siempre debe aparecer) y a la de prueba (aparece nicamente si es
positivo).
7. Compare resultados con sus compaeros de mesa. Entre qu valores se

encuentra el lmite de deteccin?
En esta prctica se estarn manejando muestras de suero humano que se
sabe son positivas para hCG. Toda muestra de esta naturaleza de be tratarse
como potencialmente infecciosa, por lo cual debe cumplirse con las normas de
72
bioseguridad adecuadas. Debe usarse guantes en todo momento, as como

ser cauteloso durante la manipulacin.
Anexo
1. Investigue qu otras pruebas existen con este tipo de principio.
2. Investigue en qu casos, fuera
valores elevado de hCG.
de embarazo normal se pueden observar
1. Ficha tcnica Prueba de Embarazo Instant-View (Orina/Suero) Alfa Scientific
Designs Inc., CA, USA
73

Manual Bioquímica III

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UNIVERSIDAD MARIANO GLVEZ

SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE PROTENAS

COMO UN ANLISIS CUALITATIVO Y

UNA PRUEBA CUALITATIVA

INTRODUCCIN AL TRABAJO DENTRO DEL LABORATORIO DE

tendr implicaciones disciplinarias, sino podra tambin tener serias implicaciones

2. Conozca el trabajo que se espera de l o ella antes, durante y despus

3. Se comprometa con los Laboratorios del Instituto a guardar compostura

tanto en su rendimiento acadmico como en su comportamiento personal,

3. Conozca a cabalidad los aspectos que se tomarn en cuenta en la

Puede encontrar una copia del REGLAMENTO DEL LABORATORIO en el apndice

El faltar al reglamento tiene consecuencias que

pueden llegar hasta el retiro definitivo del laboratorio.

El alumno que no se presente

puntualmente a la puerta del laboratorio, perder el derecho de presentar

El alumno que se presente despus de haberse presentado

las instrucciones para el laboratorio, perder el derecho de ingresar a la

4. De no asistir a una prctica, el alumno pierde automticamente el derecho a

Sin embargo, si el alumno justifica su ausencia (razones

Independientemente que su ausencia sea

justificada o no, es responsabilidad del alumno ponerse al da con el

contenido de la prctica perdida. Existe la opcin de reponer prcticas si

de la prctica para asegurar que el alumno conoce el tema a tratar y el

de un alumno que evidentemente no maneja el conocimiento previo requerido.

Como equipo d e proteccin

deber contar con su respectivo nombre y logo de la

Universidad, anteojos de seguridad y zapatos cerrados. El no cumplir con

7. No llevar consigo bolsas, mochilas ni artculos de uso personal (celulares,

de estas pertenencias, sta se confiscar y se devolver al final de la prctica.

No utilice su telfono mvil como calculadora; lleve la propia. El laboratorio

alumnos durante la prctica. Es responsabilidad del estudiante asegurar sus

Trabajo antes de llegar al laboratorio:

El laboratorio es un lugar donde nunca debe llegarse a improvisar.

necesario asegurar que el estudiante est familiarizado con el tema a tratarse

en el laboratorio, as como con el procedimiento que se seguir. Como ayuda

El Pre-lab es un cuestionario que queda bajo la responsabilidad del estudiante

La resolucin escrita del Pre -Lab deber

entregarse al Instructor antes de empezar la prctica del da.

esfuerzo para aprovechar al mximo el recurso que se tiene en el laboratorio.

Para este propsito, es necesario la realizacin de un examen corto

y que cada uno lleve un cuaderno de laboratorio.

conocimiento con el que se prepar el estudiante para la prctica. El alumno

El cuaderno de laboratorio est diseado para cumplir como evidencia del

valioso de su cuaderno de laboratorio es el contenido. Aunque su presentacin

es importante, no es lo principal en un cuaderno de laboratorio, por lo que el

Cada estudiante debe poseer un cuaderno de laboratorio que cumpla con

puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultneos

Indicar claramente la fecha en que se llevar a cabo la

Indicar claramente el ttulo de la prctica que se llevar a cabo

en el laboratorio y nmero de la misma.

Enumerar de dos a tres objetivos a conseguir durante la

Incluir los presentados en la gua y dos personales

Materiales y Reactivos Enumerar los materiales y reactivos que se requerirn durante

Para los reactivos, es necesario incluir la toxicidad del reactivo

Es de vital importancia incluir los efectos de

exposicin, forma de aplicar primeros auxilios y la forma

Cualquier clculo que sea necesario en la preparacin de

soluciones a usarse o de la muestra en s.

Reacciones qumicas o bioqumicas involucradas en la prctica

Enumerar los pasos a seguir durante la prctica.

indicarse claramente cada paso, incluyendo los pesos

Debe incluirse al final un diagrama

de flujo para hacer ms fcil el seguimiento del procedimiento.