DETERMINACINDELAACTIVIDADDELACATALASA

FelipeMoraRestrepo
femorare@unal.edu.co
Biologa
BrandomCamiloMosqueraCadena
bcmosquera@unal.edu.co
Biologa
UNIVERSIDADNACIONALDECOLOMBIA
Bogot14deSeptiembredel2015

1.Hiptesis

Se llevarn a cabo procesos para determinar la actividad enzimtica en funcin del pH, la
concentracin de la enzima, la concentracin del sustrato y respecto a la presencia de
inhibidores, por tanto se espera obtener datos que correspondan con lo esperado segnla
literatura.

2.DatosyResultados

Setrabajaronlossiguientesreactivosconsusrespectivasconcentraciones:
ConcentracindeKMnO4:
0,005M
ConcentracindeH2O2:
0,05M
ConcentracindeNaCN:
0,05nM

Tabla#1.EfectodelpHsobrelaactividadenzimtica

Tubo

KMnO4
gastados
(mL)

H2O2
mL

Micromoles
deKMnO4
gastados

Micromoles
H2O2
iniciales

Micromoles
H2O2
Residuales

Micromoles
H2O2
descompuestas

Micromoles
descompuestas/
min/mLenzima

5,90

2,0

30

100

75

25

10,0

8,50

2,0

42

100

105

7,50

2,0

38

100

95

2,0

7,40

2,0

37

100

92

3,2

8,05

2,0

40

100

100

0,0

7,50

2,0

38

100

95

2,0

6,50

2,0

32

100

80

20

5,0

8,10

2,0

40

100

100

0,0

7,00

2,0

35

100

88

12

4,8

Grfica#1.ActividadenzimticaenfuncindelpH

Tabla#2.Efectodelaconcentracindelsustrato

Tubo

KMnO4
gastados
(mL)

Micromol
esde
KMnO4
gastados

H2O2
mL

Micromole
sH2O2
iniciales

Micromoles
H2O2
Residuales

Micromoles
H2O2
descompuesta
s

Micromoles
descompuesta
s/min/mL
enzima

2,10

10,50

0,5

25

26

4,65

23,25

1,0

50

58

6,70

33,50

1,5

75

84

7,30

36,50

2,0

100

91

0,9

Tabla#3.Efectodelaconcentracindelaenzima(Datostomadosdelgrupo12)

Tubo

KMnO4
gastados
(mL)

Micromoles
deKMnO4
gastados

H2O2
ml

Micromol
esH2O2
iniciales

Micromoles
H2O2
Residuales

Micromoles
H2O2
descompues
tas

Micromoles
descompuesta
s/min/mL
enzima

1,75

8,75

2,0

100

22

78

31,2

1,25

6,25

2,0

100

16

84

16,8

1,50

7,50

2,0

100

19

81

10,8

1,25

6,25

2,0

100

16

84

8,4

8,25

41,25

2,0

100

103

Grfica#2.Actividadenzimticaenfuncindelaconcentracindelaenzima

Tabla#4.Efectodeinhibidoressobrelaactividadenzimtica(Datostomadosdel
grupo2)

Tubo

KMnO4
gastados
(mL)

Micromoles
deKMnO4
gastados

H2O2
ml

Micromoles
H2O2
iniciales

Micromoles
H2O2
Residuales

Micromoles
H2O2
descompuestas

Micromoles
descompuestas
/min/mLenzima

1,70

2,0

100

20

80

8,0

1,00

2,0

100

12

88

8,8

2,70

14

2,0

100

35

65

6,5

Grfica#3.Actividadenzimticaenfuncindelacantidaddeinhibidor

3.Clculos
Muestradeclculos:

ConversindemLdereactivoamicromoles:

((CantidaddelreactivomL)*(1L/1000mL))*(concentracindereactivoM(moles/L))=
molesdereactivo
molesdereactivo*(micromol/1*10^6moles)=micromolesdereactivo

Ejemplo:

(KMnO4gastados(mL)*
(1L/1000mL)))
*
ConcentracindeKMnO4=molesdeKMnO4
molesdeKMnO4*(1micromol/1*10^6moles)=micromolesdeKMnO4

(5,90mLKMnO4*1L/1000mL)*0,005M=3*10^5mol
3*10^5molKMnO4*(1/1*10^6)=30micromolKMnO4

HallarlacantidaddeH2O2residual
Teniendoencuentaquelareaccinquesellevaacaboenlatitulacines:

PorlocualparacalcularcuntasmicromolesdeH2O2sedescompusieron,serealizael
siguienteclculo

MicromolesdeKMnO4gastados*(5*10^6micromolesdeH2O2/2*10^6micromolesde
KMno4)=MicromolesdeH2O2

Ejemplo:

30micromolKMnO4*(
5*10^6micromolesdeH2O2/2*10^6micromolesdeKMno4)=75

HallarlacantidaddeH2O2descompuesto

CantidadinicialdeH2O2CantidadresidualdeH2O2=cantidaddeH2O2decompuesto

Ejemplo:

100micromolKMnO475micromolKMnO4=25micromolKMnO4

Hallar
Micromolesdescompuestas/min/mLenzima

(Micromolesdescompuestas/tiempotranscurrido)/mLdeenzima=
Micromoles
descompuestas/min/mL


Ejemplo:

(25micromolH2O2/5minutos)/0,5mLenzima=10micromol/(minmL)

4.Discusinderesultados

Segn la grfica de la actividad enzimtica en funcin del pH, se observa como a un ph

cercano a 4, trabaja con ms eficiencia la enzima. Sin embargo la grfica correspondiente
debera poseer forma de una campana, en la cual se debera observar claramente el pH
ptimo, que no necesariamente debe ser igual al pH intracelular. En nuestro caso la
actividad enzimtica de la catalasa no presenta un patrn claro, yaquesusupHptimoes
el mismo en el cual se comenz la prueba y no nos permite ver que pasa con la enzima a
pHinferiores.
[1]

[3]

En la prueba de efectodelaconcentracindelsustratoenlaactividadenzimtica, losdatos

no permitieron elaborar una grfica para ver el comportamiento de la enzima, ya que al
momento de realizar los clculos, los resultados mostraron incoherencias al dar ms
micromoles de sustrato que lo que se tena inicialmente. De todas formas, segn la
literatura, las enzimas en funcin de la concentracin del sustrato deben presentar una
grficaconcomportamientohiperblico,dondelavelocidadaumentaamedidaqueaumenta
el sustrato y luegolavelocidadse mantieneestable apesardequeseaumenteelsustrato.
[1]

En la grfica correspondiente a la actividad enzimtica enfuncindelaconcentracindela

enzima,seveuncomportamientoinversamenteproporcional,sinembargoesteresultadoes
ilgico, ya que a mayor cantidad de enzima, debera aumentar su velocidad enzimtica, lo
cual debe verse representado como una funcin lineal, esdecir,directamenteproporcional.
[1]

La actividad enzimtica en funcin de la cantidad de inhibidor presenta uncomportamiento

ligeramente inverso, por lo cual a mayor cantidad de inhibidor, menor actividadenzimtica.
Sin embargo el comportamiento debera ser mucho ms marcado ynounapequeacurva,
sinounalnearectaconpendientenegativa
[1]

5.Cuestionario

En la prctica usted estudi algunos factores que afectan la actividad de la

enzima, qu otros factores tendra que evaluar para completar el estudio
cinticodelacatalasa?

Latemperaturaylapresenciadecofactoresenzimticos.
Las temperaturas extremasafectanlavelocidaddelareaccindebidoalanaturalezadelas
protenas, aunque se puede hablar de temperaturas donde la actividad de la enzima es
mxima.

La presencia adecuada de cofactores enzimticos ayuda tambin a que se lleve a cabo la

reaccin,pueslaenzimasinestosnopuedefuncionar.
[2]

Realice una comparacin entre la accin de la catalasa con la accin de la

peroxidasa

Tanto lacatalasacomolaperoxidasatienenuncomportamientosimilarencuantoa laforma

del crecimiento de actividad enzimtica. Cuando la concentracin del sustrato es variable,
ambas presentan un crecimiento aparentemente parablico y llegan a un mximo de
actividad enzimtica, pero hay una diferencia significativa y es que el mximo de actividad
enzimticadelacatalasa(40mM)essuperioraldelaperoxidasa(10mM).
[3]

Cal es el papel del H2SO4 en esta prctica?Por qu no se aplicaaltiempo

conlosdemsreactivos?

El H2SO4 se utiliza para desnaturalizar la enzima alterando el sitio activo de la enzima.
EstoselograbajandoelpHporaccindelcidosulfrico.
[4]

Se podra sustituir el cido sulfrico por otro reactivo como el hidrxido de

sodio(NaOH)?Justifiquesurespuesta

Si se podra sustituir ya que generalmente las enzimas se desnaturalizan a pH extremos,
por lo cual al agregar NaOH, el pH aumentara drsticamente logrando desnaturalizar la
enzimahaciendoquedetengasuactividadenzimtica.
[5]

Qu pruebas adicionales tendra que realizar para determinar si esta es una

enzimamichaelianaoalostrica?Justifiquesurespuesta

No se requieren de ms pruebas adems de la de actividad enzimtica en funcin de la
concentracin del sustrato. Esto se debe a que las enzimas michaelianas siguen un
crecimiento hiperblico en el cual las molculas se modifican en mayor o menor medida
segn sea la concentracin del sustrato, mientrasquelasalostricassiguenuncrecimiento
sigmoidal (en forma de S) a causa de sus interacciones con sus mltiples subunidades y
sitiosactivos.
[6]

6.Conclusiones

Desafortunadamente los resultados no fueron los esperados en ninguna prueba,

esto pudo ser resultado de errores experimentales ya que tocaba tener mucho
cuidado conlascondicionesenlasquesedebamantenerlaenzima(principalmente
en frio), ademas de que en la prueba para ver la velocidad de la enzima enfuncin
del pH, cadagrupomanejunamuestradecatalasadiferente,lo quesignificabaque
cada parte de la prueba presentaba condiciones diferentes para cada tubo y no
permitirealizarcomparacionesprecisas.

7.Bibliografa

1. Academia, Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de la catalasa,

consultadoatravsde:
http://www.academia.edu/7135676/EFECTO_DEL_PH_Y_TEMPERATURA_SOBRE_LA_A
CTIVIDAD_DE_LA_CATALASA
2. Universidad Nacional Abierta y a Distancia, Factores que afectan la actividad
enzimtica,consultadoatravsde:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/200002/MODULO%20SISTEMAS%20METABOLIC
OS%20NUTRICIONALES/leccin_8_factores_que_afectan_la_cintica_enzimtica.html
3. Castro JA, Baquero LE, Narvez CE, Catalasa, Peroxidasa y Polifenoloxidasa de
pitayaamarilla(Acanthocereuspitajaya),consultadoatravsde:
http://www.redalyc.org/pdf/3090/309026667004.pdf
4. PortafolioelectronicoBiologa,CatlisisdeEnzimas,consultadoatravsde:
https://sites.google.com/site/portafolioelectronicobiologia/home/laboratorio2catalisisdeenz
imas
5. Curso de Biomolculas, Regulacin de la actividad enzimtica, consultado a travs
de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph
6. CursodeBiomolculas,Actividadenzimtica,consultadoatravsde:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#e