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FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS POR PRECIPITACION SALINA

INTRODUCCION
Las molculas de protenas pueden reaccionar unas con otras, tambin con iones de carga
opuesta y con agua por ser sta un dipolo, ya que una protena tiene muchos grupos
correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente
(dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto,
interaccin protena-protena, protena-agua, protena-in.
La solubilidad de una protena depende del balance relativo entre las interacciones
protena-disolvente, lo cual tiende a mantenerla en solucin y de las interacciones
protena-protena, las cuales hacen que la protena se agregue y precipite. La fuerza inica
de las soluciones es de particular importancia para especificar cual de estos tipos de
interacciones predomina.
Las protenas son solubles en un medio acuoso debido a que sus aminocidos que
contienen grupos hidroflicos, expuestos sobre a superficie de la protena, interactan con
las molculas de agua del medio, formando una capa de solvatacin.
Cualquier compuesto que interfiera con estas interacciones entre los grupos laterales de
los aminocidos hidroflicos de la protena y las molculas de agua, reducir la solubilidad
de la protena. A medida que las interacciones de la protena con el agua decrece, las
interacciones entre protena-protena se vuelven mas importantes, y la protena se agrega,
y precipita de la solucin.
Si la interaccin protena-protena es grande y la interaccin protena-agua es pequea, la
protena ser insoluble. Si la interaccin protena - agua es alta, entonces la protena
tender a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condicin que aumente la
interaccin protena-protena o disminuya la interaccin protena-agua disminuye la
solubilidad de las protenas (le quita la capa de solvatacin).
Un variado nmero de mtodos bioqumicos pueden ser utilizados para reducir las
interacciones hidroflicas y propiciar la precipitacin selectiva de protenas, tales como:
Fraccionamiento de protenas por precipitacin con sales.
Precipitacin selectiva con un solvente orgnico que reduce el agua de hidratacin y
tambin reduce la constante dialctica de la solucin. El fraccionamiento con etanol es
comnmente utilizado para separar fracciones de protenas del plasma sanguneo.
Precipitacin selectiva utilizando polmeros no-inicos como el polietilenglicol, el cual
opera reduciendo la disponibilidad de las molculas de agua, as como interactuando con
algunas protenas de la mezcla.
En el fraccionamiento por salado, grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a
una solucin de protenas, disminuye la interaccin protena-agua porque le quita la capa
de solvatacin, predominar la interaccin protena-protena y se producir la precipitacin.
La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es igual para cualquier
protena, lo que permite usar sta propiedad para la separacin y purificacin de protenas
particulares a partir de mezclas complejas.
Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran
solubilidad. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de
protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de
agua, por encima del punto de precipitacin, permite solubilizar nuevamente las protenas.
Si este proceso se lleva a cabo a baja temperatura (alrededor de 4C), las protenas
precipitan sin que se desnaturalicen. Luego, las protenas precipitadas pueden separarse
mediante centrifugacin y posteriormente pueden ser re-disueltas en una solucin buffer y
dializada por varias das para eliminar el sulfato de amonio.
El mtodo de precipitacin con sulfato de amonio es uno de los ms utilizados para
preparar fracciones crudas de inmunoglobulinas a partir del suero.
La concentracin de sulfato de amonio a la cual los anticuerpos precipitan vara entre las
especies, pero suele rondar el 50% de saturacin.

Las protenas del suero se dividen en 2 grandes grupos: albumina y globulinas (alfa, beta y
gamma). Ejemplos de globulinas son el fibringeno, los anticuerpos, y las protenas
transportadoras de metales como la transferrina. Todas tienen en comn el grado de
hidratacin, por lo que precipitan cuando la concentracin de sal esta en torno al 50%.
En la actualidad la precipitacin de protenas con sulfato de amonio se usa como un primer
paso dentro de los protocolos de separacin de protenas de materiales biolgicos.
PROCEDIMIENTO
La albumina puede ser separada de las globulinas ya que la albumina precipita solamente
si la solucin esta saturada al 100% con sulfato de amonio, mientras que las globulinas lo
hacen a un 50% de saturacin.
1. Aadir 500 L de plasma.
2. Aadir 500 L de solucin saturada de sulfato de amonio. El sulfato de amonio debe ser
aadido lentamente para asegurar que la concentracin local en el sitio donde cae la gota
no exceda la concentracin de la sal deseada, evitando as la precipitacin instantnea de
la albmina junto con la fraccin de globulinas precipitada. Agite continuamente la solucin
evitando la formacin de burbujas y espuma.
3. Mantenga la muestra precipitada durante 30 minutos a 4C.
4. Resuspenda la fraccin de globulinas precipitada agitando moderadamente durante 5
minutos.
5. Centrifugue la mezcla a 10.000 g durante 15 minutos a 4C.
6. Traspase cuidadosamente el sobrenadante que contiene la fraccin de albmina a otro
eppendorf y resuspenda la fraccin de globulinas precipitada en un volumen de PBS igual
al de la muestra original (0,5 ml).
7. Mida absorbancia a 280 nm de cada una de las dos fracciones obtenidas y realice
electroforesis en acetato de celulosa.
8. Compare los resultados obtenidos con los del suero sin fraccionar.
PREPARACION DE DISOLUCIONES
Disolucion saturada de sulfato de amonio
1. Diluya 500g de sulfato de amonio (grado para anlisis) en 500 ml. de agua destilada.
2. Caliente la mezcla a 50C con agitacin continua, hasta que la sal se disuelva
completamente y filtre rpidamente mientras la solucin est an caliente. Deje enfriar la
solucin durante varias horas o durante la noche a temperatura ambiente mientras el
sobrenadante se satura. En este proceso se formaran cristales y estarn presentes en el
envase mientras est saturada la solucin. El contenido de sulfato de amonio en la
solucin saturada depende de la temperatura (d=1.2450 a 25C).
3. El pH de esta solucin es aproximadamente 5 y debe ser ajustado a pH 7.2 aadiendo
amonio para evitar la adicin de iones extraos.
Buffer PBS
Dissolve the following in 800ml distilled H2O: 8g of NaCl, 0.2g of KCl, 1.44g of Na2HPO4 y
0.24g of KH2PO4. Adjust pH to 7.4 with HCl. Adjust volume to 1L with additional distilled
H2O. Sterilize by autoclaving.