BIO RAD MULTIDISCOS* GRAM POSITIVOS CAT. 71080180 MULTIDISCOS* GRAM NEGATIVOS CAT. 71080280 MULTIDISCOS* COMBINADOS CAT. 71080380 MULTIDISCOS* GRAM NEGATIVOS II CAT. 71080580 MULTIDISCOS* GRAM POSITIVOS II CAT. 71080480 Agente de diagnéstico para el estucio “in vitro” de la sensibilidad bacteriana a 12 antimicrobianos NSTRUCTIVO coo (BEI Indicacién de la Prueba Los fendmenos de transferencia genética y la aparicin de mutantes en las _bacterias gram-positivas y gram-negativas, han dado jugar a la aparicién de cepas resistentes a uno © varios antimicrobianos; tanto en la poblacién general como en el ambiente hospitalario han incrementado tal fenémeno. Esto lleva a la necesidad de conocer el patrén de susceptibllidad de las cepas aisladas en los casos clinicos frente a los antimicrobianos disponibles, teniendo en consideracion que tal patrén varia ampliamente, dependiendo del género, la especie y atin del sitio donde se aisla el microorganismo. Entre los grupos de bacterias que presentan patrones variables de susceptibilidad se encuentran las enterobacterias, bacilos gram negativos no fermentadores, estafilococos, enterococos y Pseudomonas. El andlisis de sensibilidad a los antimicrobianos se lleva a cabo de acuerdo al tipo de animocrobiano disponible. Las._—combinaciones. de antimicrobianos que tiene los Multidiscos* grampositivos, Multidiscos* gramnegativos, Muttidiscos* combinados, Mulicisoos* grampositivos Il, Multidiscos* grammegativos 1! incluyen tanto las sustancias que han sido usadas desde hace algunos afios y cuya utilidad permanece vigente (penicilina, ampicilina, gentamicina) como antimicrobianos de reciente introduccin en nuestro medio (ceftriaxona, cefepime, cefuroxima, levofloxacina, enoxacina netilmicina). Las pruebas de susceptibilidad in vitro. pueden ser cuantitativas (se mide la minima concentracién capaz de inhibir el eedesarrollo de las bacterias) o semicuantitativas (las cepas se clasifican en resistentes o sensibles). Para propésitos practicos, las pruebas semicuantitativas de difusion en agar proporcionan la informacion suficiente para servir de guia en el tratamiento. La aparicion de microorganismos resistentes a uno 0 varios de los agentes antimicrobianos, tanto en la poblacién general como en el ambiente hospitalario, hacen necesario conocer el patron de sensibilidad a los antibidticos que tienen las cepas aisladas de casos clinicos. Los microorganismos de crecimiento _ lento, anaerobios obligados y capnofilicos (que requieren de una atmésfera de CO,) no deben probarse por el método de difusién con discos, que se han uniformado para _probar microorganismos aerobios 0 facultativos de crecimiento rapido. Si se desean pruebas de susceptibilidad para estos microorganismos, que no requieren de antibiograma son:_S. pyogenes, S. pneumoniae, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, C._diphteriae, A._israeli, _H. influenzae, B_ pertussis, B. melitensis y otros organismos que tienen un patron de susceptibilidad definido. Fundamento de la prueba: Esta prueba se fundamenta en que al colocar un disco impregnado con determinada cantidad de antimicrobiano, sobre un medio sdlido innoculado con bacterias, el antimicrobiano difundira formandose un gradiente de concentracién, el cual inhibiré 0 permitira el crecimiento de la bacteria. Una vez que se coloca el disco de papel filtro en contacto con el ba a a ee medio de cultivo, el antibidtico difundira hacia el interior. La difusion sera la misma cuando se coloque un disco individual (Unidisco*), el Multidisco*, 0 un disco adherido a cualquier otro soporte; el factor critico ser que el disco contenga la cantidad correcta de cada antimicrobiano (ver tabla 1). Contenido de los equipos: El estuche de Multidiscos* Gram Positivos CAT. 71080180 contiene 50 multidiscos, con 12 antimicrobianos y una bolsa con silica gel como desecante. Cada multidisco contiene aproximadamente: Ampicilina AM 10g Cefalotina CF 30 ug Cofotaxima c™ 30 ng Ceftazidima CAZ 30 ug Cefuroxima XM 30 ng Dicloxacilina DC. 1g Eritromicina E 15 ng Gentamicina GE 10g Pefloxacina PEF Sug Penicilina PE 10U Tetraciclina TE 30 ug Trimetoprim- SXxT 25 ug Sulfametoxazol EI estuche de Multidiscos* Gram Negativos CAT. 71080280 contiene 50 multidiscos, con 12 antimicrobianos y una bolsa con silica gel como desecante. Cada multidisco contiene aproximadamente: Amikacina AK 30 ng Ampicilina AM 10 ug Carbenicilina cB 100 ug Cofalotina CF 30 ngCefotaxima cm 30 ng Ceftriaxona CRO 30 ug Cloranfenicol cL 30 ug Gentamicina GE 1049 Netiimicina NET 30 ng Nitrofurantoina NE 300 ng Pefloxacina PEF 5g ‘Trimetoprim- SXT 259 ‘Sulfametoxazol El estuche de Multidiscos* combinados CAT. 71080380 contiene 50 multidiscos, con 12 antimicrobianos y una bolsa con silica gel como desecante. Cada multidisco—_contiene aproximadamente: Amikacina AK 30 ug ‘Ampicilina AM 1049 Cefalotina cr 30 ug Ceftriaxona CRO 30 ug Cloranfenicol Gls 30 19 Dicloxacilina oc Tug Enoxacina ENX 1049 Eritromicina E 159 Gentamicina GE 109 Netilmicina NET 30 ug Penicilina PE 10U Trimetoprim- SxT 25g Sulfametoxazol El estuche de Multidiscos* Gram Positivos II CAT. 71080480 contiene 50 multidiscos, con 12 antimicrobianos y una bolsa con silica gel como desecante. Cada multidisco contiene aproximadamente: Ampicilina AM 10 ng Cefalotina cr 30 ng Cefotaxima crx 30 ng Cefepime FEP 30 ng Cefuroxima ck 30 ug Dicloxacilina oc tug Eritromicina E 15 ug Gentamicina GE 10g Levofloxacina LEV 5ug Penicilina PE 10U Tetraclicina TE 30 1g Trimetoprim- SXxT 25 ug Sulfametoxazol El estuche de Multidiscos* Gram Negativos Il CAT. 71080580 contiene 50 multidiscos, con 12 antimicrobianos y una bolsa con silica gel como desecante, Cada multidisco contiene aproximadamente: Amikacina AK 30 ng Ampicilina AM 10ug Levofloxacina Lev 5ug Cefalotina CF 30 ug Cefotaxima CTX 30 ng Ceftriaxona CRO 30 ng Cloranfenicol cL 30 119 Gentamicina GE 1049 Netilmicina NET 30 ng Nitrofurantoina NE 300 9 Cefepime FEP 30 ug Trimetoprim- SXT 25 ug Sulfametoxazol Material y equipo necesario adicional: 4. Pinzas estériles. 2. Hisopos estériles. 3. Tubos de ensaye estériles. 4. Solucién salina estéril. 5. Cajas de Petri estériles. 6. Medio de cultivo de Mueller-Hinton.7. Vernier, compas de calibracion, regla o plantilla disefiada para medir los halos de inhibicion. Procedimiento de la prueba: 1. Preparar el medio agar de Mueller-Hinton de acuerdo a las instrucciones del fabricante, el pH final a temperatura ambiente deberé estar enire 72 7.4, este medio favorece el crecimiento de casi todos los microorganismos para los que son més importantes las pruebas de susceptibilidad. 2. Colocar 25 ml. de! medio en cajas de Petri (de plastico o de vidrio) de 90 mm@ 0 60 ml en caja de 140 mm@, de tal forma que la profundidad sea de 4mm (esta opcién es recomendable). Las placas deberén guardarse en el refrigerador (2 a 8 °C) en bolsas de pldstico, para disminuir la pérdida de agua por evaporacién antes de usarse; las placas se colocarén en una incubadora a 36 °C por 30 minutos para eliminar la humedad excesiva. Para microorganismos exigentes puede agregarsele al medio sangre de borrego, de caballo 0 de otro animal, desfibrinada al 5%. 8. Tocar con una asa 4 0 § colonias aisladas del mismo tipo morfolégico e inocular en 4 0 5 mi de medio de cultivo, pudiendo ser caldo Mueller-Hinton 0 caldo soya tripticasa; se incuba a 35 °C hasta que aparezca una turbidez ligera (generalmente entre 2 a 5 horas). La turbidez se ajusta con solucion salina estéril o caldo estéril hasta tener una densidad comparable con un estandar de sulfato de bario. El esténdar se prepara mezciando 0.5 mi de BaCl, 0.048 M (1.175% peso/volumen de BaC!, 2H;0) con 99.5 ml de H,SO, al 1% viv (0.36 N), que es la mitad de la densida estandar No. 1\ de MacFarland, (se denomina a menudo estandar 0.6 de MacFarland) el esténdar corresponde a aproximadamente 108 microorganismos/ml. La suspensién ajustada del indculo no debe permanecer mas de 15 a 20 minutos antes de proceder a sembrarla en la caja de Petri. La suspensién ajustada del inéculo no debe permanecer mas de 1 a’20 minutos antes de proceder a sembrarla en la caja de Petri. 4, Para inocular el agar se utiliza un his6po esteril de algodén el cual se humedece con la suspensién, se quita el exceso de caldo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo por arriba del nivel del caldo; se estria el medio en tres direcciones sobre la totalidad de la superficie de agar, para obtener un inéculo uniforme. Se efectiia un ultimo bartido del hisopo sobre el reborde de la caja de Petri y el agar. Cuando el inéculo ha secado (de 3a 5 minutos) se procede a colocar los discos. 5. Los discos se toman con pinza estéril y se colocan en el medio en un tiempo menor de 15, minutos, después de haber inoculado la placa; los discos deberdn presionarse ligeramente para asegurar un contacto con la superficie, debera prevenirse una sobreposicion de las zonas de inhibicién con una distribucién adecuada de los discos y con un limite no menor de 15 mm de los bordes de la placa. 6. Después de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petri e incubar a 35°C sin agregar CO,,. El tiempo de ineubacién es de 16 a 18 horas. En situaciones de urgencia clinica se podrén efectuar lecturaspreliminares a las 5 0 6 horas de incubacién pero deberdn ser reincubadas hasta completar las 18 horas. 7. La medicién de los halos de inhibicién se hace con compases de calibracion, vernier, regla o plantilla disefiada para este propésito, Por el fondo de la caja, la cual se ilumina con luz feflejada. Cuando se utiliza medio adicionado con sangre, la lectura se efectia sobre la Superficie del agar. El punto final de todos los sistemas de lectura sera hasta la completa inhibicién del crecimiento, determinada visualmente, ignorando colonias tenues o muy Pequefias que puedan ser observadas con Minuciosidad. Las colonias grandes que aparecen entre la zona clara de inhibicion pueden ser variantes resistentes 0 bien un inéculo mezclado, por lo que se recomienda Verificar la pureza de éste con un frote y tincion de Gram, o mejor con reidentificacion completa. En el caso de las sullas 0 mezcla de sulfatrimetoprim, el microorganismo puede crecer a través de varias generaciones antes de que ocurra la inhibicién; en este caso, un ligero crecimiento (90% de inhibicion) se descarta y se mide el margen de crecimiento abudante: El velo 0 swarming que produce Proteus spp también se descaria. Intrepretacin de los resultados: Las cepas se clasificaran en Resistentes (R), Intermedias (I), 0 Sensibles (S), dependiendo del diémetro del halo de inhibicién (incluyendo los 6 mm del disco), de acuerdo a la siguiente tabla. TABLA 1 Diémetro de halo de inhibicién en mm ‘Agente Contenido Ro ‘Anlimieroblano del disco Amikacin Enlorobacteriacese 20ug <1 15-16 Ampiciina tong Enterobacteracoae <1 Staphylococcus app 528 Eniorooooeus 90 zis Streptococcus spp - Catvenetina 100 9 Enterobacteriacaae <19 Pecudomonas aeruginosa 13 Celalotina Enterobacteriaceae 30g = 14 Cefepime 5 song <4 Cefotaxima a 30ng 214 Ceftazidima fi 30mg <4 Cetrraxona + Ong < 13 Cefuroxima, Si B0ug x14 Cloranfenieat —* ng <12 Dicloxzciina tHe Staphylococcus spp 10 11512 Enoxacina Enterobacteriaceas 10g <14 15417 Etromicina 1519 Enterococcus spp ug <1 14-22 Gertamicna Entorobacteriaceae 1019 =12 13-14 Levofloracina = Sug 13 1446 Netilmcina ” ng 212 1914 Nivoturantoina RSn9 <14 15.16 Pettoracina Sug <4 1520 Penictina 10U ‘Apiciina 1049 Staphylococcus spp < + Enterococcus pp ee 1N. gonorhoeae 528 27-46 Streptococcus spp — Totcicita Enterobacteraceae 309 <14 15-48 Trimetoprim-Sullametoxazol 25g <10. 11-15 R=Rosistente [= Intermedio Sz Sensible 220 218 347 224 319 216Situaciones especiales: La técnica de Bauer-Kirby se diseié para probar la sensibilidad antimicrobiana para microorganismos aerobios no exigentes y de crecimiento moderadamente rapido, algunos patégenos comunes no estan dentro de esta categoria, por lo cual el método debe modificarse para adaptarse a microorganismos tales como: N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae, _S._pneumoniae, Staphylococcu aureus meticilina resistente. Recomendaciones: 1.Los Multidiscos estén disefiados para probarse segin el método de difusién en discos de papel de filtro de Baeuer-Kirby, con las modificaciones recomendadas por Food and Drug Administration (FDA) y el National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS). La FDA (5) recomienda las siguientes caracteristicas del papel filtro: * Se deben utilizar discos de color blanco con un diémetro aproximado de % de pulgada (6.5 +0.5 mm). * El peso del papel blanco debe ser de 30 mg +4 por centimetro cuadrado. + El papel no debe contener ningun material que inhiba o aumente la actividad de cualquier antimicrobiano, para lo cual se determina el pH que no debe ser mayor de 0.3 unidades en relacién con el pH de agua destilada usada para determinario. + La capacidad de absorcion de agua destilada debe ser de 2.5 a 3.0 veces su peso seco. 2,Debe ponerse cuidado en la interpretacién de los resultados y en el reporte de los mismos, ya que se trata de pruebas basicamente cualitativas, que sirven de guia en la terapéutica, pero que no siguen una estricta correlacion con la actividad de los antibisticos “in vivo". Posibles fuentes de error y limitacién de la prueba: 1. Uso de otro medio que no sea el de Mueller-Hinton (MH). Preparacién inadecuada del medio MH, sobre todo falta de control de pH. Conservacién inadecuada de las placas de Petri con el medio Mueller-Hinton. Almacenamiento inadecuado de los discos antibioticos. Inéculo inadecuado por error en el ajuste de la densidad del microorganismo en el caldo. No eliminar el exceso de liquido del hisopo antes de inocular las cajas. Preparacién 0 almacenamiento inadecuado del esténdar de referencia para turbidez. Tiempo inadecuado entre la preparacién del inéculo y la inoculacién. Tiempo inadecuado en la aplicacién de los discos después de la inoculacién de la placa. 10.Tiempo inadecuado en la incubacién de la placa después de la colocacién de los 0s. 11. Temperatura diferente de 35 °C 0 el uso de una atméstera con aumento de CO, en la incubacién. 12.Lectura de resultados antes de 16 0 18 horas. © @ Nona vn18.No leer cuidadosamente los limites de las zonas de inhibicién. 14.Cuttivos mixtos. 16.Aplicacién del procedimiento. a microorganismos de crecimiento lento 0 anaerobios. 16.No utilizar cepas de calidad controlada 0 no anotar los resultados de la prueba de control. 17.Error de transcripcién al _anotar los resultados de pruebas individudles. 18. Trabajar de acuerdo a las buenas précticas de laboratorio. 19.Apegarse al instructivo de uso 20.Trabajar en condiciones de esterilidad, en presencia de mechero 0 en campana de flujo laminar. 21.Con pinza estéri, presionar ligeramente los multidiscos para asegurar el contacto con la superficie del medio de cultivo. 22.Las placas de Petri deben incubarse solo en osicién horizontal. 23.Reactivo para diagnéstico in vitro exclusivamente. Duracién y almacenamiento: La fecha de caducidad para cada equipo se encuentra impresa en la parte exterior, la temperatura recomendada para conservacién es de2a8°C, Control de calidad: Las cepas control utilizadas para medir la eproductibiidad de esta técnica son Staphylococcus aereus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922 que deberan incluirse en la prueba diaria. La FDA también recomienda el uso de las cepas de, ATOC27853 susceptible a Gentamicina y Carbenicilina. Deben emplearse: siempre en las. mismas condiciones que las cepas problema. Bibliogratia: 1. Performance Standars for Antimicrobial Disk susceptibility Test; Approved Standar, 8 edition, Suplemental Tables pp 20-53, 2003, 2. Barry Al. Thornsberry C. Susceptibility test Diffusion test Procedures. En: E. Lennette (Ed,) Manual of Clinical Microbiology 4 th. Ed. American Society for —_ Microbiology. Washington, D.C. pp 978-987. 1985 3. Giono Cerezo Silvia: Prueba de Bauer Kirby para sensibilidad a los _antimicrobianos. Infectologia Ill (7): 325. 1983. 4, Raphael Stanley §. Lynch's. Medical Laboratory Technology. Ed. W:B. Saunders. USA 1983, pp 434-440. 5. Code of Federal Regulations, USA, vol. 21, 1980, pp. 697, 706-707, Fabricado por: BIO RAD, S. A. Av. 11 de Enero de 1861 No. 58 Col. Leyes de Reforma C.P. 09310 México, D-F. * Marca Registrada. BIO-RAD Reg. No. 85076DSSA Reg. No. 85075DSSA Reg. No. 86508DSSA Reg. No. 1025R2006SSA Reg. No. 1026R2006SSA