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ELISA Hepcidin

Diluire lo STANDARD con 1 ml di Standard Diluent, lasciare 10 a RT e


agitare delicatamente (non far fare schiuma). Cos si ottiene la stock solution
(600 ng/ml)
Preparare le seguenti soluzioni:
Detection Reagenta A e B: diluire (1:100) la stock con le
rispettive Assay Diluent (calcolare che ne servono
rispettivamente 50 e 100 l per pozzo)
Wash Solution: diluire 20ml con 580 ml di acqua (diluire da 30x a
1x)
Diluire la stock solution aggiungendo 2 ml di Standard Diluent (200 ng/ml) e
preparare le diluizioni seriali per la standard come segue:
n

1
2
3
4
5

Conc.
200
ng/ml
66.67
ng/ml
7.41
ng/ml
2.47
ng/ml
0 ng/ml

1:5
1:25
1:12
5
1:62
5

STANDA
RD

2 ml

1 ml

150 l

75 l

150 l

75 l

150 l

75 l

150 l

75 l

Preparare le diluizioni seriali dei campioni come segue:


Con
c.

Standard
Diluent

PBS
120
l
160
l
160
l
160
l

Campio
ne
30 l
40 l
40 l
40 l

Preparare i pozzi del bianco, della standard e dei campioni (tutti in doppio) e
rimettere a -20C il resto. Aggiungere 50 l delle varie soluzioni (bianco,
standards e campioni) nei rispettivi pozzetti.
Aggiungere 50 l di Detection Reagent A in ogni pozzo e agitare gentilmente
la piastra.
Coprire con la membrana sigillante e lasciare 1 h a 37C
Aspirare il detection reagent e lavare 3 volte con 350 l di Wash Solution
lasciando agire 1 minuto il lavaggio e dopo lultimo asciugare bene sbattendo la
piastra su della carta assorbente.
Aggiungere 100 l di Detection Reagent B in ogni pozzo e agitare
gentilmente la piastra.

Coprire con la membrana sigillante e lasciare 30 a 37C


Aspirare il detection reagent e lavare 5 volte con 350 l di Wash Solution
lasciando agire 1 minuto il lavaggio e dopo lultimo asciugare bene sbattendo la
piastra su della carta assorbente.
Aggiungere 90 l di Substrate Solution in ogni pozzo(diventano blu) e agitare
gentilmente
Coprire con la membrana sigillante, proteggere dalla luce e lasciare 15-20 a
37C (non superare i 30)
Aggiungere 50 l di Stop Solution in ogni pozzo(diventano gialli) e agitare
gentilmente (il colore deve essere omogeneo)
Rimuovere eventuali gocce dacqua e impronte dal fondo della piastra e
assicurarsi che non ci siano bolle sulla superficie del liquido
Leggere a 450nm immediatamente