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ELISA DuoSet TGF-1

Diluire il Capture Antibody in PBS (la madre 480g/ml e va diluito fino a 4g/ml
120 volte)
Riempire con 100l di anticorpo i pozzetti da utilizzare
Sigillare la piastra e lasciare in incubazione a O.N. a Room T
Aspirare i pozzetti e lavare con 150l Wash Buffer (0.05% Tween in PBS pH7.27.4) per 3 volte
Aggiungere 150l di Block Buffer(5% Tween in PBS pH7.2-7.4, filtrato)
Incubare almeno 1h a room T
DURANTE LINCUBAZIONE PROCEDERE CON LATTIVAZIONE DI TGF-1
o Per ogni 40 l di Campione aggiungere 10 l di HCl 1N
o Vortexare
o Incubare 10 a Room T
o Aggiungere 10 l di NaOH 1.2 N + HEPES 0.5 M
o Vortexare
DURANTE LINCUBAZIONE PROCEDERE CON LA PREPARAZIONE DEI
CAMPIONI E DELLE STANDARD
o Preparare la STANDARD 4000 pg/ml diluendo 16.6 l di madre in
483.4 l di Reagent Diluent e trasferire 200 l di questa
soluzione nel primo pozzo
o In ogni pozzo della standard tranne il primo mettere 100 l di
Reagent Diluent
o Trasferire 100 l dal pozzo prima per tutti i pozzi della standard
tranne il bianco (dove rimangono 100 l di Reagent Diluent)
o Nei pozzi dei campioni mettere 60 l di Reagent Diluent
o Aggiungere al primo (1:5) 15 l di campione attivato
o Trasferire 15 l dal primo pozzo al successivo e cos via fino
allultimo (1:625)
Aspirare i pozzetti e lavare per 3 volte
Aggiungere 50l di campione o di standard
Incubare 2h a room T
Aspirare i pozzetti e lavare per 3 volte
Aggiungere 50l di Detection Antibody (la madre 4,5g/ml e va diluito fino a
75ng/ml 60 volte)
Incubare 2h a room T
Aspirare i pozzetti e lavare con 150l Wash Buffer (0.05% Tween in PBS pH7.27.4) per 3 volte
Aggiungere 50l di Streptavidina-HRP(diluire la madre 1:40)
Incubare 20 a room T al buio
Aspirare i pozzetti e lavare per 3 volte
Aggiungere 50l di Substrate Solution (TMB)
Incubare 20 a room T al buio
Aggiungere 25l di Stop Solution (H2SO4 2N) e picchiettare gentilmente per
miscelare
Leggere a 450nm (se possibile impostare la correzione della lunghezza donda,
settarla a 540nm o 570nm; in caso contrario sottrarre alla lettura a 450nm quella a
540nm o 570nm)