Citoqumica

Carlos Alberto Gonzlez Muller

Concepto
Estudio de los mtodos que con ayuda de la
microscopa permite identificar y localizar compuestos o
radicales qumicos.
Se provocan reacciones que con las sustancias o
radicales qumicos forman productos insolubles que son
coloreados.

 Una limitacin de la citoqumica es el procesamiento

que ha recibido la muestra y limitan los mtodos
citoqumicos aplicables.

Principios bsicos
Para que una prueba sea vlida:
Los compuestos no deben ser difusibles: No hay problema con
las macromolculas pero hay que insolubilizar con la fijacin
cuando hay pequeas sustancias
El producto debe ser insoluble
El mtodo debe ser especfico para sustancia analizada

Principales sustancias: Iones

Hierro: Se demuestra por la reaccin con la mezcla de
ferrocianuro de potasio y cido clorhdrico que producen
un precipitado azul oscuro ferrocianuro frrico
Fosfatos: Se demuestran con la reaccin de nitrato de
plata. El fosfato de plata, en la fase siguiente es
reducido por la hidroquinona. La plata reducida se
deposita en forma de precipitado negro.

Principales sustancias: Lpidos

Se localizan por colorantes que disuelven rpidamente
las grasas.
Los tejidos se sumergen en soluciones alcohlicas
saturadas de colorantes muy liposolubles y dbilmente
solubles en alcohol.
Por ejemplo: Sudan IV, Sudan negro

Principales sustancias: cidos

nucleicos
ADN: Se estudia con la reaccin de Feulgen. Se basa en
la hidrlisis del ADN por el cido clorhdrico con el fin de
extraer las bases purnicas y dejar libres los grupos
aldehdicos de la dexosirribosa. En presencia del
reactivo de Schiff va un compuesto insoluble de color
rojo
ARN: Se utiliza la afinidad con colorantes bsicos,
tindose intensamente con el azul de toluidina o de
metileno.

Principales sustancias: Protenas

Se basa en la identificacin de aminocidos.
Se utiliza por ejemplo la reaccin de
diaminoazobenceno, y reaccin de Sakaguchi (arginina).
Esta ltima tcnica se puede utilizar para detectar las
protenas bsicas como histonas y protaminas

Principales sustancias: Polisacridos

En el organismo se encuentran unidos o no a protenas.
Los primeros constituyen las glucoprotenas
El nico polisacrido no unido a protena en nuestro
organismo es el glucgeno que se puede evidenciar por
la reaccin de Schiff
Este producto reacciona luego con la fucsina decolorada
(reactivo de Schiff) dando un compuesto de adicin
coloreado e insoluble.
Las glucoprotenas y proteoglicanos reaccionan
enrgicamente con el Alcian blue
Las glucoprotenas neutras pueden identificarse con el

Principales sustancias:
Catecolaminas
El formaldehido produce con las catecolaminas
productos fluorescentes

Principales sustancias: Enzimas

Cuando la enzima es lbil se utilizan cortes de tejido congelado, no fijado
En la mayora se busca producir un precipitado fuertemente coloreado
Fosfatasa cida: Uno de los mejores mtodos es la tincin de Gomori. Consiste en
incubar cortes fijados en glicerofosfato de sodio y nitrato de plomo en una
solucin tamponeada a pH 5. Por accin de la enzima se produce la hidrlisis del
glicerofosfato, liberando iones fosfato de plomo insolubles que se precipita donde
hay actividad. En la segunda fase se procede a una inmersin de los cortes en
una solucin de sulfito de aminio que transforma el precipitado incoloro en un
precipitado negro.
Deshidrogenasas: Se incuba cortes de tejido no fijado en un sustrato adecuado,
transfirindolo a otro compuesto qumico soluble y dbilmente coloreado del tipo
tetrazol. El tetrazol se reduce a un compuesto intensamente coloreado e
insoluble: el formazn

Principales sustancias: Peroxidasa

Se incuba cortes de tejido fijados en 3,3-diaminobencidina en presencia de agua oxigenada, sta es
reducida, produciendo un compuesto insoluble
coloreado

Enfermedades hematolgicas
El examen microscpico cuidadoso de
extendidos de sangre perifrica con tenidas de
Romanowsky y extendidos de mdula sea son
fundamentales en el diagnstico hematolgico.
La microscopa sola puede proveer un
diagnstico definitivo de leucemia mieloide
aguda (LMA) y sndromes mielodisplsicos (SMD)
y un diagnstico citolgico provisional de
leucemia linfoblastica aguda (LLA)

Inmunocitoqumica
Mieloperoxidasa (MPO)/ Sudan negro b (SBB):
Esencial en leucemia aguda a menos que la
diferenciacin mieloide se obvia;
esencial en SMD a menos que el diagnstico de
RAEB-t haya sido establecido por una lmina
teida con Romanowsky;
til en la transformacin aguda de la leucemia
granuloctica crnica

MPO
Es la ms sensible y especifica para las leucemias mieloides
Tie fuertemente a los neutrfilos (patrn granular difuso),
otros granulocitos variablemente

Tincin positiva: Neutrfilos, eosinfilos, monocitos

(variable), LMA- M1, M2, microgranular M3
Tincin negativa: Linfocitos, LLA

Sudan negro B
Tie lpidos en granulocitos
Util en especmenes en fresco
No til en pacientes con deficiencia de mieloperoxidasa
Tincin positiva: Neutrfilos, monocitos (variable), LMAM1, M2, M3
microgranular
Tincin negativa: LLA

Inmunocitoqumica
Esterasa no especfica (NSE)/ Esterasa
combinada (CE):
Esencial en leucemia aguda si se
sospecha de LMA M2, M4 o M5

NSE
Tambien conocida como alfa-naftil acetato, alfa-naftil
butirato
Tincin positiva: Monocitos (inhibido por fluoruro de
sodio), LMAM4,M5, clulas T maduras (gotas
citoplasmticas),
carcinomas, eritrocitos
megaloblsticos, focalmente
en LMA-M7
Tincin negativa: LMA-M0, M1, M2, M3, LLA (usualmente)

Inmuncitoqumica
Fosfatasa alcalina neutroflica (NAP):
til en leucemias mieloides crnicas si el
anlisis citogentico no est disponible;
a veces til en el diagnstico de otros
desrdenes mieloproliferativos;
til en el diagnstico de PNH que se
desarrolla en la anemia anaplsica

 Histrica la puntuacin de NAP fue de valor para diferenciar estados

reactivos de los desrdenes mieloproliferativos, tales como LMC,
policitemia rubra vera, etc.
Procedimiento
Mejor realizado en lminas de sangre en fresco, sin el uso de anticoagulates
Las muestras con EDTA pueden ser utilizadas pero con resultados menos
satisfactorios
El extendido debe ser hecho, secado al aire, fijado y luego teido todo
dentro de 30 minutos.
La actividad positiva de la fosfatasa alcalina (NAP) se indica por la presencia
de grnulos azul brillantes en el citoplasma neutrfilo (los ncleo se tien
de color rojo)

Puntuacin:
0: Negativo, sin grnulos visibles
1: Dbil positivo, algunos grnulos
2: Positivo, poco-moderado numero de grnulos
3: Fuertemente positivo
4: Muy fuerte

Inmunocitoqumica
Fosfatasa cida tartrato resistente
(TRAP):
til en el diagnstico de leucemia de
clulas peludas pero no esencial si esta
disponible inmunofenotipo detallado y/o
la biopsia es caracterstica

TRAP
TRAP se encuentra en la leucemia de clulas peludas, otras
fosfatasas cidas se encuentran en los glbulos rojos, la prstata,
los lisosomas de los glbulos blancos
Es sensible y relativamente especifica para la leucemia de clulas
peludas
Tincin positiva (normal): Linfocitos B de la zona marginal
Osteoclastos
Tincin positiva (enfermedad):Tricoleucemia, linfoma de clulas del
manto (57%), linfoma de zona marginal esplnico (algunos), linfoma
primario mediastinal de clulas B (54%), CLL/SLL
(41%), clulas
gigantes en tumor de clulas gigantes de hueso y tejidos blandos

BAAF ganglio- tricoleucemia

Sangre perifrica - Tricoleucemia

Utilidad de la citoqumica

Enfermedades renales
Se puede utilizar tinciones como mucina o melanina para
identificar los depsitos metastsicos cuando el tipo de tumor
primario es ya conocido.
Con los tumores primarios renales tambin, las tinciones
citoqumicas pueden contribuir, por ejemplo la tincin de hierro
colidal de Hale para distinguir un oncocitoma de un carcinoma
cromfobo de clulas renales.
Ambos tumores son positivos con esta tincin pero lo importante
es el patrn de tincin: en el cromfobo la marcacin es
citoplasmtica y compromete la mayora de clulas neoplsicas.
En el oncocitoma la tincin es variable siendo totalmente
negativo en entre 16 a 25% y su patrn es luminal

Hierro coloidal de Hale

Para tumores renales el PH debe estar entre 1,5 a 2,0
El carcinoma de clulas clara y papilar renales tienen
focal, en forma de gotitas, dispersa marcacin

Efusiones
La histoqumica puede ayudar a distinguir entre mesotelioma y
adenocarcinoma.
En el mesotelioma se busca la presencia del cido hialurnico y la falta de
mucosustancia neutras que se producen en el adenocarcinoma
Los bloques son tiles para este propsito
El Alcian blue o el hierro coloidal pueden demostrar la presencia de vacuolas
citoplasmticas, en el lumen tubular, o espacios dentro de grupos de clulas
mesoteliales
Los carcinoma productores de mucina contienen por lo general material que tie
con Alcian blue o hierro coloidal el cual no es removido por hialuronidaza
La reaccin de PAS puede ser positivo en clulas mesoteliales benignas o
malignas propias de la presencia de glucgeno citoplasmtico. Despus del
tratamiento con diastasa, la reaccin es negativa en el mesotelioma, mientras
permanece positiva en presencia de mucina epitelial de adenocarcinoma

Efusiones
La melanima citoplasmtica en las clulas de melanoma
puede ser confirmada por el mtodo Fontana-Masson.
Las tinciones argentafines y / o argirofilas destacan las
hormonas polipeptidicas, aminas activas, o precursores
de aminas en el citoplasma y sugieren una
diferenciacin neuroendocrina
La mucicarmina demuestra la presencia de mucina y
favorece adenocarcinoma

Patologa mamaria
Carcinoma secretor de la mama
Ocurre en las tres primeras dcadas es encontrado
tambin en prebures y ancianas
Caractersticas citologicas: Estructuras en forma de uva
con estructuras mucous globulares que consisten de
clulas vacuoladas que contienen grandes inclusiones
citoplasmticas de un producto secretor
Citoqumica: difusa positividad para mucina con tincin
de Alcian blue y PAS diastasa resistente

(A) PAS positive secretory material in ductular lumina and, as globular structures, in
intracytoplasmic vacuoles (arrows). (B) Positive immunostain for S100 antibody, (C)
Positive immunostain for E-cadherin, (D) Metastasis to sentinel lymph node. (Original
magnification: A 400X; B and C 200X; D 100X).

PAS positive
and
diastase
resistant
secretion
(PAS
400).

Tumor cells showing vacuolated and abundant granular eosinophilic cytoplasm (H and E).
Left upper: Tumor cells showing eccentrically placed nuclei (H and E)

Carcinoma rico en lpidos

Tincion con Oil-rojo-O positiva en las vacuolas lpidas en
casi todas las clulas. La tincin debe realizarse en
lminas secadas al aire
No se observa tincin con PAS, Alcian y PAS-D
Con Sudan IV la tincin fue rojo-naranja

Carcinoma de clulas claras (rico en glucgeno)

Debido a la variabilidad citomorfolgica del carcinoma
de clulas claras, la demostracin de glucgeno es
esencial para un diagnstico definitivo
Abundante material citoplasmtico granular PAS
positivo que es sensible a la digestin de diastasa
Una reaccin PAS diastasa puede ser hecha sobre un
preparacin estndar teida con Pap

Fig 1/2: Infiltrating nests of atypical cells with abundant clear cytoplasm
Fig 3: PAS+ granules
Fig 4: PAS staining is removed by diastase

Carcinoma apocrino
Carcinoma raro 1 a 4% de todos los carcinomas de la
mama
Las clulas tumorales tienen bordes distinguibles,
abundante citoplasma acidofilo con granulos
eosinfilos, nucleos vesiculares excntricos con nuclolo
prominente

Tracto respiratorio
Tumor de clulas granulares
Es un tumor mesenquimal benigno que se asume
proviene de las clulas provenientes de Schwann
Puede aparecer en muchos rganos, protruye al lumen
bronquio / trquea y puede confundirse con carcinoma
Los grnulos son PAS positivo y diastasa resistente

Tumor de clulas claras

Tumor benigno raro localizado en la periferie de los
pulmones
Citoqumica: El abundante glucgeno de las clulas
puede ser verificado por PAS

Lesiones oseas
La fosfatasa alcalina (ALP) es til para demostrar la
diferenciacin osteoblastica de las clulas tumorales en
aspirados de osteosarcoma, como las clulas tumorales
de todos subtipos de osteosarcoma contienen
abundante ALP citoplasmtica
La fuerte positividad confirma el diagnstico de
osteosarcoma y lo distingue de carcinoma metastsico
o melanoma maligno y linfoma anaplasico de clulas
grandes de hueso de un osteosarcoma de alto grado.
La tincin de ALP en histicitoma fibroso maligno esta
predominantemente localizada en las clulas alargadas

 PAS: Muestra la presencia de glucgeno citoplasmtico

en condrosarcoma de clulas claras

BAAF
Las tinciones ms frecuente son
PAS para la deteccin de glucgeno
PAS diastasa y Alcian blue para deteccin
de mucina
Metenamina de plata (Grocott) para la
deteccin de hongos
Tincin de Ziehl Nielsen para bacilos
acido alcohol resistentes

Grocott en
ganglio
linftico
paciente
con
cryptococcu
s

Muchas gracias