Experiencias con Nematodos Entomopatgenos.

Retos y oportunidades de su uso en Latinoamrica

Editado por:
Adriana Senz Aponte
Pontificia Universidad Javeriana
Juan Carlos Lpez Nez
Centro Nacional de Investigaciones del CafCenicaf
Luz ngela Galindo Leva
Scientia Colombia S.A.S.

Responsable Editorial:
Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnologa para el desarrollo (CYTED). Red de
implementacin de enemigos naturales para el control de plagas y enfermedades en cultivos
hortcolas de importancia en Iberoamrica COBIHO. Cdigo 111RT0418.
Portada:
Huevos con desarrollo de JI. Heterorhabditis sp. SL0708
Adriana Senz Aponte
Diseo y Diagramacin:
Luz ngela Galindo Leva
Primera Edicin:
Bogot D.C. 2011
Editores:
Adriana Senz Aponte, Juan Carlos Lpez Nez y Luz ngela Galindo Leva
Para la presente edicin

Red de implementacin de enemigos naturales para el control de plagas y enfermedades en

cultivos hortcolas de importancia en Iberoamrica COBIHO. Cdigo 111RT0418.
ISBN: 978-958-46-1409-4
Todos los derechos reservados conforme a la ley.
Impreso en Colombia.

Autores
Adriana Ins Rodrguez-Hernndez
Adriana Saenz Aponte

Ph.D. Profesora Investigadora de la Universidad Autnoma del

Estado de Hidalgo. Mxico.
Biloga. Ms.C. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot.
Colombia.

Ana Milena Caicedo

Ingeniero Agrnomo Ph.D. ICA. Manizales, Caldas. Colombia.

Arturo Carabal

Ingeniero Agrnomo Ph.D. ICA. Palmira, Valle. Colombia.

Carolina Mara Jaramillo

Clara Yalexy Delgado-Chica
Gabriela Maciel Vergara
Gerardo Trres
Jaime Eduardo Muz
Jos Joaqun Celeita-Bernal
Juan Carlos Lpez-Nez
Juan Pablo Molina-Acevedo

Estudiante Biologa. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot.

Colombia.
Estudiante Ms.C. Biologa. Pontificia Universidad Javeriana.
Bogot. Colombia.
Ingeniera. Universidad Autnoma del Estado de Hidalgo.
Mxico.
Director Unidad Microscopa Universidad del Cauca. Colombia
Ingeniero Agrnomo Ph.D. Universidad de Palmira, Valle.
Colombia.
Estudiante Biologa. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot.
Colombia.
Microbilogo. Investigador Cientfico I. Disciplina de Recursos
Naturales y Conservacin. Cenicaf. Colombia.
Ingeniero Agrnomo Ph.D Investigador Cientfico. Corpoica.
Turipan. Colombia.

Luis G. Leite

Bilogo. Ph.D. Instituto Biolgico CEIB. Campinas. Brasil

Mabell Orbio

Estudiante Biologa. Universidad del Cauca, Cauca. Colombia.

Miguel Uribe
Mitzi Flores-Ponce
Norberto Chavarra-Hernndez
Paola Andrea Zuluaga
Rafael Montiel Duarte

Estudiante Ingeniera Agronmica. Universidad de Caldas,

Caldas. Colombia.
Estudiante de posgrado. Laboratorio Nacional de Genmica para la
Biodiversidad, CINVESTAV-IPN. Guanajuato, Mxico.
Ph.D. Profesor Investigador de la Universidad Autnoma del Estado
de Hidalgo. Mxico.

Estudiante Ingeniera Agronmica. Universidad de Palmira,

Valle. Colombia.
Ph.D. Investigador del Laboratorio Nacional de Genmica para la
Biodiversidad, CINVESTAV-IPN. Guanajuato, Mxico.

Norberto Chavarra Hernndez, Gabriela Maciel Vergara y

Adriana Ins Rodrguez Hernndez
Cuerpo Acadmico de Biotecnologa
Agroalimentaria. Instituto de
Ciencias Agropecuarias. Universidad
Autnoma del Estado de Hidalgo,
Mxico.
E-mail: norberto@uaeh.edu.mx

Produccin de nematodos

entomopatgenos por mtodos in vitro

Introduccin

Contenido del Captulo

Introduccin

166

Control Biolgico

168

Nematodos como agentes de

control biolgico
Produccin masiva de
nematodos entomopatgenos
Un Mtodo para producir
nematodos entomopatgenos
Referencias Bibliogrficas

171

174

184
188

Desde la antigedad la agricultura ha sido la base de la humanidad,

pero fue hasta los aos 1900s que comenz a constituirse como una
actividad industrial con la introduccin de mecanizaciones y nuevas tcnicas
en las labores de cultivo. Paralelamente a este hecho, surgi el uso de
sustancias qumicas en prctica agrcolas, incluyendo especficamente el
uso de pesticidas qumicos (Harwood, 1990) justificndose esto por
razones como las siguientes: a) los rendimientos en los cultivos eran
mayores, b) la eliminacin de plagas era rpida y poco costosa, y c)
controlaban agentes que causaban enfermedades infecciosas que
posteriormente podan convertirse en epidemias (Ecobichon, 2001).
Estas ventajas hicieron que su uso se intensificara sin una evaluacin de
las consecuencias y riesgos a futuro.
El uso de pesticidas se remonta a tiempos anteriores a la era cristiana
con los sumerios (2500 A. de C.) quienes utilizaban compuestos sulfurados
para el control de insectos, los granjeros chinos trataban las semillas con

compuestos naturales y las civilizaciones griega y romana utilizaban una variedad de fumigantes, aceites y
arsnico como insecticidas. Entre los siglos XVI y XVII surgi la era de los compuestos naturales como
la nicotina y el xido de mercurio, mientras que el xito de los pesticidas sintticos tuvo lugar en 1939
cuando Paul Muller descubri el DDT (difenildiclorotrietano), compuesto usado en sus inicios para
combatir los mosquitos causantes de la propagacin de la malaria y posteriormente en los cultivos agrcolas.
A esto sigui la fabricacin de compuestos organofosforados y organoclorados con mayor potencial
destructivo, algunos de los cuales se encuentran todava en uso (Pretty y Hine, 2005).
La finalidad del uso de pesticidas es eliminar plagas interfiriendo con algunos procesos bioqumicos
y fisiolgicos vitales. Las diferencias entre los pesticidas son bsicamente su persistencia en el ambiente,
toxicidad y sobre todo el espectro que tienen para actuar contra especies sensibles a ellos; sin embargo su
uso causa inevitablemente daos en menor o mayor medida (Bro-Rassmunsen, 1996). Los efectos del uso

Pgina

Chavarria, Vergara y Rodriguez

167

de
pesticidas
qumicos
no
tienen la misma
intensidad en todos
los ecosistemas y
se presentan de
diversas formas:
alterando las
cadenas trficas
debido a la muerte
de uno o ms
organismos que
son fuente de
alimento
para
otros.

Tabla 1. Uso de Pesticidas (ingredientes activos) en EUA y a nivel mundial (Kiely et al., 2004)
Mundial
Tipo

Millones kg
(ingredientes acti-

EUA
%

Millones kg
(ingredientes acti-

Relacin de % utilizado en
EUA y % utilizado a nivel

Ao 2010
Herbicidas (1)

883

36%

542

44%

28%

Insecticidas

615

25%

122

10%

9%

Fungicidas

234.264

10%

74

6%

14%

697

29%

496

40%

32%

2,429

100%

100%

23%

Herbicidas (1)

849

37%

553

46%

30%

Insecticidas

559

24%

105

9%

9%

Fungicidas

215.65

9%

73

6%

15%

Otros (2)
Total

1,234
Ao 2001

667
29%
472
39%
32%
g e n e ra n d o Otros (2)
daos al ambiente Total
2,291
100%
1,203
100%
24%
(1) "Herbicidas" incluye herbicidas y reguladores de crecimiento.
(i.e. daando la
(2) "Otros" incluye nematicidas, fumigantes, rodenticidas, molusquicidas, pesticidas para peces y aves y algucapa de ozono, nos otros pesticidas convencionales adems de qumicos como azufre y petrleo, en ocasiones utilizados cocontaminando los mo pesticidas.
mantos acuferos, la lluvia, el aire y el suelo entre
de libras (Cuadro 1). Los pesticidas utilizados se
otros) provocando enfermedades debido a su
concentran solamente en algunos cultivos de frutas
acumulacin en los tejidos adiposos de animales.
y vegetales, arroz, maz, algodn, trigo, cebada y
Este ltimo punto ha sido motivo de estudios soya, siendo los pases industrializados los mayores
recientes por las evidencias encontradas de efectos consumidores, aunque la demanda crece tambin
secundarios que causa la acumulacin, que varan en los pases en desarrollo, con algunas desventajas
desde ligeras molestias hasta la muerte por intoxicacin, como:
cncer o deficiencias en los sistemas y tejidos.
baja tecnificacin para la aplicacin de
Paradjicamente, la demanda y uso de pesticidas a
qumicos, falta de informacin sobre el uso correcto y
nivel mundial en los ltimos cincuenta aos se
riesgos, y sobre todo el uso ilegal o bien el uso de
increment en gran medida con ventas de hasta 25
productos que actualmente estn prohibidos.
mil millones de dlares anuales en lo que va de este
De ah que cada vez son ms frecuentes los
siglo (Pretty y Hine, 2005). De entre stos, los
herbicidas acumularon 36% de las ventas, mientras reportes sobre trabajadores intoxicados por la
que los insecticidas y funguicidas slo el 25% y exposicin a productos qumicos en pases donde
10% respectivamente de un total de 5,351 millones an no hay una regulacin adecuada para el uso de

Produccin de nematodos entomopatgenos

Pgina

168

pesticidas qumicos (Ecobichon, 2001).

En Mxico, la situacin no es muy
distinta a la del resto del mundo, puesto que
segn datos de la Asociacin Mexicana de la
Industria de Plaguicidas y Fertilizantes
(AMIPFAC), en 1995 el monto de plaguicidas
utilizados fue de 54,678.96 Ton, de las
cuales una parte sustancial correspondi a Figura 1. Volumen de pesticidas usados en Mxico en 1995
(SNIARN, 2008)
insecticidas y herbicidas con 47% y 29%
Debido a que dentro de la idea de sustentabilidad
respectivamente (Figura 1). Los cultivos en que se
utilizaron las cantidades mayores de estos productos el suelo es considerado como un sistema vivo, se
fueron en maz, hortalizas, caa y algodn desarrollaron algunas prcticas agrcolas con enfoque
en la dinmica poblacional para el manejo de la
(SNIARN, 2008).
compleja interaccin husped-plaga-predador
Si bien es cierto que despus de 1950 se
evitando la alteracin del ecosistema. As se cre
increment el uso de pesticidas en el mundo y en
un nuevo concepto que determin las prcticas
general no haba una conciencia sobre los daos
para el control de plagas basadas en la interaccin
causados por su uso, cabe aclarar que algunos aos
ecolgica: el manejo integral de plagas (MIP). El
antes ya se tena la idea de desarrollar una nueva
MIP es un conjunto de estrategias que rene factores
agricultura con prcticas que aseguraran cierta
econmicos, ecolgicos, culturales y biolgicos
estabilidad, lo cual dio lugar al trmino agricultura
donde los productos qumicos solamente son
sustentable que fue usado por primera vez en la
utilizados como ltimo recurso, evitando al mximo
dcada de 1980s bajo dos principios clave:
el dao al ambiente. Dentro del MIP, adems de
La disminucin del uso de pesticidas qumicos las prcticas culturales como la rotacin de cultivos
y la concepcin de la agricultura como un proceso y la planeacin de la siembra-cosecha, existen otras
biolgico y un sistema integral donde el manejo estrategias que resultan eficientes como el llamado
debera ser responsable.
control biolgico de plagas (Harwood, 1990).

Control Biolgico
Una de las definiciones tradicionales del
control biolgico es la manipulacin de parsitos,
predadores y patgenos para mantener las
poblaciones plaga en niveles donde no haya un dao
econmico (Harwood, 1990), sin embargo los
avances biotecnolgicos de los ltimos aos han
permitido la inclusin de nuevos trminos, por lo

cual existen otras definiciones como la de

Gnanamanickam et al (2002): el uso de organismos
naturales o modificados, genes o productos genticos
para reducir los efectos de organismos indeseables
y favorecer a organismos deseables como insectos
benficos y algunos microorganismos. Muy
relacionada con la definicin anterior, es la dictada

Pgina

Chavarria, Vergara y Rodriguez

169

Tabla 2. Caractersticas y ejemplos de los agentes de control biolgico segn Hagler (2000)
Pesticida QuCaracterstica
Predador
Parasitoide
Patgeno
mico (PQ)
Espectro contra plaga

Moderado

Reducido

Reducido

Amplio

Baja

Baja

Media

Alta

Corta (das)
Alto

Corta (das)
Alto

Corta / Moderada
Medio

Larga (Aos)
Bajo

Aplicacin

Difcil

Difcil

Fcil

Fcil

Efectividad

Baja

Baja / moderada

Baja / moderada

Alta

Compatibilidad con PQ

Baja

Baja

Alta

Impacto ambiental

Bajo

Bajo

Bajo

Muy alto

Resistencia por parte de la plaga

Nula

Nula

Bajo

Alta

Ejemplo
Orden

Coleoptera

Diptera

Familia

Carabidae

Phoridae

Enterobacteriaceae

DDT

Disponibilidad comercial
Vida de anaquel
Costo

Nombre comn/cientfico

Scarabaeidae sp.
orugas, huevecillos

Presa

de insecto e
insectos de

Bacillus thuringiensis
hormigas, termitas, larvas de insectos
catarinas, moscas,

pertenecientes al

etc.

orden Lepidoptera

cuerpo suave
por la Oficina de Asesora Tecnolgica del
Congreso Estadounidense en 1995, la cual hace
referencia a las tecnologas basadas en la
biotecnologa para el control de plagas (BBTs
por sus siglas en ingls), las cuales comprenden el
uso de predadores, patgenos, feromonas, derivados
naturales de plantas, reguladores del crecimiento
en insectos e insectos estriles como agentes de
control biolgico (Hagler, 2000). Aunque los inicios
del control biolgico datan de varios siglos atrs, la
era moderna comenz en 1888 cuando se importaron
enemigos naturales del insecto causante del
algodoncillo desde Australia hasta California, en la

todo tipo de
insectos e incluso
algunas especies
de peces y aves

mayor prdida econmica reportada en la industria

de los ctricos causada por una plaga. Desde entonces, el
control biolgico ha sido utilizado algunas veces
con xito y otras veces sin l, en diferentes cultivos
y contra diversas plagas en donde factores como
las condiciones climticas, la adaptacin de los enemigos
naturales al ecosistema (si son introducidos), el
estado del cultivo, la afinidad plaga-predador y el
tipo de control biolgico aplicado tienen influencia
directa en los resultados que se obtienen. En Mxico,
ste comenz en 1940 y se dio con la introduccin
de enemigos naturales para combatir plagas como
la escama algodonosa de los ctricos, la escama

Produccin de nematodos entomopatgenos

purprea, las moscas de la fruta y el pulgn

manchado de la alfalfa, ente otras (Barrera, 2002).
Tipos de Control Biolgico
Existen tres tipos de control biolgico: conservativo, introductivo y aumentativo. El primero
favorece la preservacin del ambiente para que los
enemigos naturales presentes puedan actuar como
agentes de control biolgico (ACB). Algunas estrategias empleadas en este tipo de control son el
establecimiento de cultivos refugio (extensiones
pequeas de cultivo donde no se esparcen pesticidas qumicos), la provisin de alimento y la disminucin del uso de pesticidas qumicos de amplio
espectro. El control introductivo se denomina
tambin control biolgico clsico, puesto que
se introduce accidental o intencionalmente un
ACB forneo a un rea nueva, donde ste se desarrolla y controla a la plaga existente en el lugar.
Son muchas las desventajas que algunos crticos
encuentran en este tipo de control, puesto que
adems de que se altera el ecosistema original,
existe la posibilidad de efectos letales en organismos benficos y sobre todo la amenaza de que el
organismo introducido pueda convertirse en plaga
por no tener enemigos naturales en el lugar donde
se usa. Todo esto puede suceder si no se estudia
con detalle la dinmica que se utilizar a la hora
de aplicar el control. A pesar de ello, tambin
existen algunas ventajas que permiten que actualmente todava est en uso este tipo de estrategia.
El tercer tipo de control es el aumentativo,
que consiste en la liberacin de ACB estudiados
y producidos masivamente en laboratorio para la
supresin de la plaga. Es equivalente a la utilizacin de productos qumicos, pero sin daar al ambiente y puede realizarse por inoculacin o bien

Pgina

170

por inundacin. La inoculacin se vale solo de

pequeas cantidades del ACB, que sobreviven y
se mantienen gracias a la presencia del insecto plaga al cual eliminan gradualmente; mientras que en
el mtodo por inundacin, se aplican grandes cantidades de ACB para asegurar el exterminio casi
inmediato de la plaga, aun cuando el ACB no perdure por mucho tiempo en el cultivo (Hagler,
2000).
Agentes de Control Biolgico
Existen varias clasificaciones de los enemigos naturales, sin embargo una conveniente es la
propuesta por Hagler (2000) de acuerdo al modo
de accin sobre la plaga y algunas otras caractersticas en su desempeo como ACB (Cuadro 2).
Los predadores y los parasitoides son agentes macrobiolgicos mientras que los patgenos se consideran agentes microbiolgicos. Recientemente,
un cuarto grupo ha sido aadido y en l se incluyen los agentes parabiolgicos de control como
son las hormonas, los insectos estriles y los reguladores de crecimiento. Entre los patgenos se
encuentran varios agentes de control biolgico
que actualmente estn disponibles en el mercado,
estos agentes son aplicados con el equipo convencional para la aplicacin de pesticidas qumicos o
bien en los sistemas de irrigacin y su disponibilidad comercial se debe en gran parte a la facilidad
de producirlos en laboratorio y a su inocuidad con
relacin al ambiente y a otros organismos benficos. Las desventajas de estos ACB son: a) su especificidad para infectar ciertas plagas y la resistencia de stas despus de una aplicacin prolongada,
b) corta vida de anaquel y en el campo, y c) sobre
todo las dificultades para su regulacin como productos pesticidas. Es por ello que las investigacio-

Pgina

Chavarria, Vergara y Rodriguez

171

nes hoy en da se desarrollan para maximizar el

desempeo general de estos agentes y sobre todo

para que su uso dentro del manejo integral de plagas sea ms intensivo.

Nematodos como agentes de control biolgico

Existen siete familias de nematodos con potencial biocontrolador: Mermitidae, Tetradonematidae,
Allantonematidae, Phaenopsitylenchidae, Sphaerularidae,
Steinernematidae y Heterorhabditidae; sin embargo, slo
las dos ltimas se han estudiado con ms detalle
(Lacey et al., 2001) y se han producido comercialmente alcanzando ventas de hasta 10 millones USD
(en 1998) (Samish y Glazer, 2001). Los nemtodos
entomopatgenos (NEP) pertenecientes a los gneros Steinernema y Heterorhabditis poseen receptores
qumicos para la bsqueda de insectos husped y se
encuentran asociados simbiticamente con enterobacterias, Xenorhabdus sp. para Steinernema y Photorhabdus luminiscens para Heterorhabditis. Los NEP son
gusanos redondos no segmentados con sistema respiratorio, reproductor y digestivo, adems son patgenos obligados en la naturaleza y han sido utiliza-

dos para controlar un amplio nmero de insectos

plaga (Cuadro 3; Figura 2) mediante inundacin en
el control aumentativo.
Cabe mencionar que la eficacia de los NEP ha
sido comprobada en plagas cuyo estado larvario se
desarrolla en la tierra (principalmente especies de
los gneros Lepidoptera y Coleoptera), aun cuando
tambin se han utilizado en plagas cuya ovoposicin
y/o estado larvario se desarrollan en troncos o en
las hojas de los rboles (Schroer y Ehlers, 2005). El
usarlos como agentes de control biolgico no representa riesgo para los vertebrados, insectos benficos
y en general para el medio ambiente; pueden producirse in vivo e in vitro y son aplicados fcilmente con
equipo convencional, buscan a su presa y la matan
rpidamente (en un lapso entre 24 y 48 h), pueden

Tabla 3. Plagas susceptibles al biocontrol mediante NEP.

Especie
Familia
Lepidoptera
Pyralidae
Noctuidae
Glyphipteridae
Coleoptera
Curculionidae

Scarabaeidae
Diptera
Sciaride

Referencias

Nombre cientfico

Agrocultivo

Pas

NEP

Tryporyza incertulas
Spodoptera depravata
Sagalassa valida

Arroz
Csped
Palma

India
Japn
Colombia

Sc
Sg, Sc
Sc

Kaya et al., 2006

Kaya et al., 2006
Kaya et al., 2006

Aristobia testudo
Cosmopolites sordidus

China
Brasil

Sc
Sc

Kaya et al., 2006

Kaya et al., 2006

Epicometis hirta

Litchi
Pltano
Vid y otros
frutos

Turqua

Hb

Hazir et al., 2004

Lycoriella mali

Setas

Corea

Sc, Hb

Kaya et al., 2006

Sc = Steinernema carpocapsae, Sg = Steinernema glaseri, Hb = Heterorhabditis bacteriophora

Produccin de nematodos entomopatgenos

Pgina

172

reciclarse en el ambiente y son compatibles

con algunos productos qumicos y otros
pesticidas biolgicos, adems de que estn
exentos de registro como pesticidas en algunos pases (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002;
Hazir et al., 2004; Shapiro-Ilan et al., 2006).
En contraparte, las razones por las que su
uso todava no tiene gran impacto son: a) su
reducido rango de accin contra los insectos, b) la poca tolerancia a condiciones estresantes de humedad, radiacin y temperatura, c) corta vida de anaquel, y d) la diferencia de su precio con relacin a los productos qumicos.
Figura 2. Insectos plaga susceptibles al control biolgico
usando NEP. A) Hypera postica Gyllenahl, B) Phyllophaga, C)
Ciclo de vida de los NEP
Icerya purchasi, D) Noctuidae.
Tanto los steinernemtidos como los
los tejidos del insecto y ste muere por septicemia
heterorhabdtidos tienen un ciclo de vida que incluen las siguientes 24 a 48 h. Los IJ se alimentan de
ye huevo, cuatro etapas juveniles (J1 a J4) y una fase
los tejidos del insecto colonizados por la bacteria y
adulta. Bajo ciertas condiciones, la fase J3 se conse convierten en adultos de primera generacin,
vierte en infectivo juvenil (IJ), nica fase que sobremismos que posterior a la fertilizacin dan lugar a
vive fuera del insecto husped y puede mantenerse
huevos que se desarrollan a nematodos J1 y as suen bsqueda de un nuevo insecto, al cual penetra a
cesivamente hasta otra generacin de adultos. Este
travs de sus aberturas naturales (boca, ano, espirciclo ocurre hasta que los nutrimentos se agotan,
culos) liberando la bacteria simbionte, quien infecta
momento en el que los IJ de nueva
induccin comienzan a emerger del
cadver para continuar buscando
otros huspedes (Figura 3) (Neves et
al., 2001; Chavarra-Hernndez y de
la Torre, 2001; Serwe-Rodriguez et
al., 2004). Esta sucesin de estadios
tambin se puede observar en cultivos in vitro, ya sea slidos o lquidos,
donde el ciclo puede comenzar con
la inoculacin de IJ en un medio
previamente inoculado e incubado
Figura 3. Ciclo de vida de Steinernema sp.
con la respectiva bacteria simbionte.

Pgina

173

La diferencia entre steinernemtidos y heterorhabdtidos es su

modo de reproduccin, ya que
mientras
los
adultos de los
primeros
son
Figura 4. Localizacin de la machos y hemvescula bacterial en la parte an- bras en todas las
terior del intestino de Steinerne- generaciones con
de
ma spp. (vista lateral). En el ca- capacidad
so de Heterorhabditis spp., la bac- producir progeteria se encuentra dispersa en nie, los adultos
todo el tracto gastrointestinal heterorhabdti(Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005)
dos de la primera
generacin son hermafroditas y los adultos de las
generaciones subsecuentes son anfimticos, pero
incapaces de reproducirse (Ehlers y Shapiro-Ilan,
2005). Con relacin a la bacteria simbionte, aun
cuando Xenorhabdus y Photorhabdus tienen diferencias entre s como su localizacin dentro del nematodo IJ (Figura 4), el mecanismo mediante el cual
son liberadas dentro del insecto husped y la propiedad de bioluminiscencia, exhiben similitudes en
algunas caractersticas ya que ambas pertenecen a
la familia Enterobacteriaceae, son mviles (poseen
flagelos pertricos), Gram-negativas, aerobias facultativas y no forman esporas. Sin embargo, las dos
caractersticas ms importantes que tienen en
comn, son a) la variacin fenotpica y b) la produccin de inclusiones protenicas cristalinas.
La relacin entre los NEP y su bacteria simbionte es esencialmente mutualista y puede ser dividida en tres fases (Ciche et al., 2006):

Chavarria, Vergara y Rodriguez

Fortica. Fase en la que tanto la bacteria como el nematodo se encuentran fuera del husped;
es decir, el nematodo se encuentra en busca de alimento y al mismo tiempo sirve como vector a la
bacteria y como su proteccin contra el medio ambiente. No existen reportes de que la bacteria haya
sido encontrada en forma libre, sino solamente en
el intestino de los IJ y en insectos husped que han
sido infectados por NEP. El mecanismo de colonizacin del intestino de las fases IJ por la bacteria es
an poco conocido, sin embargo existen dos teoras acerca de ello; la primera es que debido a un
agotamiento en las fuentes de nutrimentos, los J2
disminuyen su funcin digestiva y por lo tanto en
lugar de digerir a la bacteria, la retienen dentro. La
segunda teora se basa en la afinidad de los IJ por
su bacteria simbionte y esto sucede porque si la
bacteria presente en el insecto husped no es la
simbionte especifica del nematodo, ste no la retiene.
Patgena. En esta fase, el complejo nematodo-bacteria es directamente responsable de la
muerte del insecto husped, que es infectado debido a la introduccin de la bacteria, llevada a cabo
por los IJ. Una vez dentro, la bacteria invade y
afecta el sistema inmunolgico del insecto, que en
condiciones naturales impedira la accin de agentes externos por procesos como melanizacin o
encapsulacin (Hazir et al., 2004), mientras que el
nematodo tambin contribuye inhibiendo los mecanismos enzimticos del insecto plaga para reconocer a sus invasores, de ah que la relacin nematodo-bacteria sea mutualista porque ambos organismos necesitan uno del otro para sobrevivir.
Saprfita. Sucede una vez que el insecto ha
muerto; la bacteria y el nematodo se alimentan de

Produccin de nematodos entomopatgenos

los tejidos del hospedero. La bacteria entra en un

estado estacionario de crecimiento y el nematodo
desarrolla su ciclo de vida. Diversos estudios se
han realizado ya que aparentemente la diferenciacin sexual y el proceso de fertilizacin y liberacin
de los huevos tienen que ver con la concentracin
de bacteria y nutrientes en esta fase de la relacin
nematodo-bacteria (por lo menos en Heterorhabditis). Aqu tambin ocurre la migracin de los IJ fue-

Pgina

174

ra del cadver una vez que se han agotado las fuentes de nutrientes.
Las fases mencionadas anteriormente tambin tienen lugar cuando se cultiva a los NEP en
medios artificiales, donde la recuperacin e induccin de los IJ se debe aparentemente a sealizaciones qumicas que la bacteria simbionte produce en
el medio (Johnigk y Ehlers., 1999).

Produccin Masiva de Nematodos Entomopatogenos

Actualmente existen tres mtodos para la
produccin masiva de NEP: in vivo, in vitro slido e
in vitro lquido los cuales se explican brevemente a
continuacin.
Cultivo In vivo
En este mtodo, insectos husped son inoculados con fases IJ, las cuales se desarrollan y completan su ciclo de vida durante dos a tres generaciones, despus de unos das, cuando los nuevos IJ
comienzan a dejar el cadver, se procede a las operaciones de cosecha, sanitizacin, formulacin y
almacenamiento de los mismos. La cosecha se realiza en dispositivos denominados trampa de White que constan de una caja Petri donde existe una
zona elevada (i.e., vidrio de reloj invertido) cubierta
por papel filtro y rodeada por agua (Woodring y
Kaya, 1988; Hazir et al., 2004). Una vez infectadas,
las larvas se colocan en el papel filtro y cuando los
IJ emergen se dirigen hacia el agua donde son cosechados fcilmente evitando contaminaciones.
Los IJ as cosechados pueden pasar a una etapa de
concentracin para eliminar el agua excedente y
posteriormente ser sanitizados con distintas soluciones comerciales, la concentracin puede hacerse

mediante sedimentacin y posterior decantacin o

bien mediante centrifugacin (Shapiro-Ilan y Gaugler, 2002). La formulacin implica procedimientos
que permiten a los NEP reducir su actividad metablica y entrar en un estado de deshidratacin
(anhidrobiosis parcial) debido a la baja humedad
relativa de los agentes inertes usados como el
carbn activado, vermiculita, alginatos, caoln y
poliacrilamida. Estos agentes propician un menor
costo en el almacenamiento y transporte del producto, un mejor manejo y mayor vida de anaquel.
Los NEP tambin pueden formularse en soluciones acuosas pero esto no es muy conveniente porque deben mantenerse en refrigeracin y con agitacin moderada, adems de que hay un mayor riesgo de contaminacin. En la actualidad, se pueden
formular en grnulos dispersables en agua (WDG,
por sus siglas en ingls), mtodo que presenta las
mismas ventajas de los agentes inertes en cuanto a
costo y facilidad de operacin y adems asegura
una mayor vida de anaquel. Para optimizar el proceso de produccin in vivo de NEP, hace algunos
aos se propuso un sistema denominado LOTEK
construido con bandejas y repisas. No obstante
que se requiere de poca experiencia para el mtodo

Pgina

Chavarria, Vergara y Rodriguez

175

in vivo, las desventajas son el costo de los hospederos y el equipo, cuya inversin no es fcil de recuperar a partir de las ganancias obtenidas, adems
la concentracin final de IJ en un cultivo in vivo,
depende de factores como el tamao del insecto
husped, el tamao del inculo de IJ, la forma en
que son inoculados (en suspensin acuosa o incluidos en la comida del insecto husped) y la afinidad con el husped, as como condiciones de
humedad y temperatura (Shapiro-Ilan y Gaugler,
2002). Los IJ obtenidos por este mtodo pueden
aplicarse dentro del cadver del insecto husped,
colocndolo en los cultivos y protegiendo as a los
NEP del medio ambiente mientras encuentran
un nuevo husped.
Cultivo Slido in vitro
Inicialmente el cultivo slido se desarroll
axnicamente (i.e., cultivo puro de nematodos) sin
embargo, se encontr que la inclusin de la bacteria simbionte en el cultivo se traduca en mejores
resultados. Los primeros cultivos slidos se desarrollaron en cajas Petri con medios con sangre de
becerro, alimento para perro y extracto de rin
porcino entre otros ingredientes. En este sistema
bidimensional se inoculaban fases IJ sanitizadas.
Actualmente este procedimiento sigue utilizndose. En 1960, Bedding dise un sistema tridimensional para la produccin de NEP que actualmente se utiliza en algunas empresas pequeas, donde
el medio lquido se esteriliza junto con placas de
espuma de poliuretano como agente inerte en matraces, bolsas de plstico o recipientes de vidrio,
suministrndoles aire mediante bombeo o bien
empleando un dispositivo permeable al aire que
evita la conveccin forzada de aire. En este mtodo, tambin se inocula la bacteria y despus de

Tabla 4. Compaas productoras de nematodos entomopatgenos en

Estados Unidos de Amrica y la Comunidad Europea (Kaya et al.,
2006)
Compaa

Especie a

Formulacin

Mercado

Andermatt Biocontrol,
Sc, Sf, Hm
Grossdietwil, Suiza

Barro

Invernadero,
jardinera
domstica

Asa Jung Laboratory,

Oakland, California, EUA

Barro

Variado

Suspensin,
grnulos
dispersables en
agua, esponja

Variado

Polmero

Jardinera
domstica

Becker UnderSc, Sf,

wood Ames, Iowa, Sg,Sk, Ss,
EUA
Hm

Spray, grnulos
dispersables en
agua

Invernadero,
hongos comestibles

Certis b Columbia,
Maryland, EUA

Suspensin, grnulos
Variado
dispersable en agua

Sc, Sf

BioLogic Willow
Hill, Pennsylvania,
EUA
Bionema, Umea,
Suecia

Sc, Sf

Sc, Sf, Sr

e-nema GmbH,
Sc, Sf, Hb
Raisdorf, Alemania
Hydrogardens,
Colorado Springs, Sc, H sp
Colorado, EUA
Integrated Biocontrol,
Hb, HiGreendale, Indiana,
,Hmar
EUA
Koppert, Berkel en
Sf, Hb
Rodenrijs, Holanda
M & R Durango,
BayWeld, Colorado, Sc, Sf, Hb
EUA
Nematec, San
Ramon, California, Hb
EUA
Owiplant, Owijska,
K/Poznania,

Barro, polmero

Invernadero,
vivero, hongos
comestibles y
jardinera
domstica

Esponja

Invernadero

Pasta, esponja

Ctricos, csped

Barro

Invernadero,
csped

Esponja

Variado

Wool nematode

N/A c

Barro

Invernadero,
hongos comestibles

Sc, Steinernema carpocapsae; Sf, S. feltiae; Sg, S. glaseri; Sk, S. kraussei; Sr,
S. riobrave; Ss, S. scapterisci; Hb, Heterorhabditis bacteriophora;Hi, H. indica;
Hm, H. megidis; Hmar, H. marelatus; H sp., Heterorhabditis species.
a

En 2005, Certis vendi el rea productora de nematodos a Becker

Underwood.

N/A, No disponible

Produccin de nematodos entomopatgenos

Pgina

176

Tabla 5. Instituciones pblicas y privadas productoras de nematodos entomopatgenos para el control

de insectos plaga en Mxico reportadas en 1999 (Tamz-Guerra et al., 2001)
Entidad Federativa
Sinaloa

D.F.

Compaa

Especie a

Biosol S.A. de C.V. (Culiacn, Sinaloa)

Sf

Agrobiosol de Mxico S.A. de C.V (Culiacn, Sinaloa)

Sc

Koppert de Mxico S.A de C.V (Mxico, DF)

Sf

Chiapas
Laboratorio de produccin de OB, CIICA (Chiapas)
a Sf= Steinernema feltiae, Sc=Steinernema carpocapsae, Sg= Steinernema glaseri
algunas horas de incubacin se inoculan los IJ. La
recuperacin del producto se realiza lavando la
espuma de poliuretano hasta que todos los IJ
hayan migrado o bien por centrifugacin, la cual, al
igual que en el cultivo in vivo, incrementa el costo
del producto. Las desventajas de este mtodo son
que el escalamiento afecta directamente el desarrollo de los cultivos, ya que se dificulta la medicin
en lnea de parmetros como el pH y el oxgeno
disuelto a la vez que el muestreo no es representativo debido a la poca uniformidad en la distribucin de los NEP (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005).
Cultivo lquido in vitro
El cultivo en medio lquido ha sido hasta
ahora la forma ms conveniente para la produccin de NEP a gran escala, llevada a cabo comercialmente en la actualidad por compaas en Estados Unidos de Amrica y algunos pases de la Comunidad Europea, principalmente (Cuadro 4). En
Mxico, existen pocas compaas productoras de
NEP como agentes de control biolgico y los

Sg, Sf

mtodos que utilizan para producirlos son confidenciales (Cuadro 5).

Al igual que en el cultivo slido, el cultivo
lquido se desarroll inicialmente de forma axnica
en matraces y posteriormente de forma monoxnica, al cultivar ambos organismos juntos. El primer
experimento con biorreactor se patent en Estados
Unidos de Amrica por Pace et al. (1986) y desde
entonces, diversos trabajos se han desarrollado para la mejor adaptacin del cultivo lquido de NEP
en biorreactores. Este proceso no resulta tan sencillo como lo es el cultivo in vivo, ya que dentro del
biorreactor los NEP se encuentran en un medio
junto con burbujas y partculas, inmersos en un
proceso de mezclado que se relaciona directamente
con su desarrollo, alimentacin y cpula, cuya finalidad es obtener la mayor concentracin de fases
IJ. Uno de los factores que afectan el cultivo lquido es la viscosidad del medio, por lo que algunos
de los retos ms importantes en este sistema son a)
proveer suficiente oxgeno para ambos microorganismos sin daarlos, b) evitar al mximo el estrs
hidrodinmico, c) reducir la espuma generada por
la agitacin y/o aireacin, y d) incrementar la

Pgina

177

Chavarria, Vergara y Rodriguez

Figura 5. Variables implicadas en el cultivo monoxnico lquido de NEP.

cpula (para el caso especfico de Steinernema spp.)
Estos problemas se han minimizado mediante el
diseo y mejora de los biorreactores utilizados,
adems de la investigacin detallada sobre el ciclo
de vida de los NEP en cultivo lquido (ShapiroIlan y Gaugler, 2002). Durante el cultivo lquido,
que puede durar desde dos hasta cuatro semanas,
es imprescindible mantener condiciones de rigurosa asepsia ya que cualquier contaminacin puede
ser catastrfica para el proceso. Tanto la composicin del medio como la cantidad de bacteria presente son factores que influyen en el cultivo lquido. Se han usado diversos medios de produccin
que incluyen una fuente de carbono (i.e., glicerol o
glucosa), protenas animales o vegetales, extracto
de levadura y una fuente de grasas.
Entre los diferentes ingredientes usados para
la formulacin de medios se encuentran harina de
soya, yema de huevo, leche en polvo, extracto de

hgado, aceite de maz, aceite de canola y manteca,

y ms recientemente algunos ingredientes no convencionales como lactosuero y aguamiel, entre
otros (Pace et al., 1986; Friedman et al., 1991; IslasLpez et al., 2005; Espino-Garca, 2005). El tipo y
cantidad de la fuente lipdica utilizada parece ser un
componente clave en el desarrollo y virulencia de
los NEP, por lo que un incremento en la concentracin de este componente se relaciona con un
mayor rendimiento, probablemente debido a la necesidad nutrimental de esteroles en los NEP (AbuHatab y Gaugler, 2001; Yoo y Gaugler, 2000).
Existen reportes de que Steinernema no es capaz de
desarrollarse en medios sin lpidos, mientras que
en el caso de Heterorhabditis, su bacteria simbionte
es capaz de proveerle todos los nutrimentos. En
general se recomienda la adicin de lpidos en cualquier cultivo de NEP (sea slido o lquido).
Por otra parte, la cantidad del inculo tanto

Produccin de nematodos entomopatgenos

bacteriano como de fases IJ puede ser variable. Para las especies de Heterorhabditis, el inculo de nematodos es alto debido a que nicamente los adultos hermafroditas de primera generacin son los
que procrean a los individuos que al final del cultivo sern IJ, mientras que los adultos unisexuales
no producen progenie, al menos en cultivo lquido.
Entre los parmetros que favorecen al cultivo
lquido de los NEP estn el pH, la concentracin
de CO2, la temperatura y la agitacin/aireacin,
aun cuando no se ha logrado la total comprensin
de la interaccin de estos parmetros para la obtencin de cultivos lquidos exitosos (Figura 5).
El pH inicial del medio vara entre 5.5 y 7
pero algunos autores recomiendan ajustarlo a 8.
Una vez que se inicia el cultivo es perjudicial tratar
de ajustar el pH, puesto que la bacteria es capaz de
mantenerlo superior a 7 hasta que finalice el cultivo (un valor de pH inferior a 6.5 puede ser daino
para los nematodos). El pH puede variar con la
concentracin de dixido de carbono, y aunque
este efecto no se ha reportado porque la medicin
de CO2 disuelto no es frecuente durante los cultivos, se ha encontrado que a mayores concentraciones de este gas al inicio del cultivo monoxnico, se
incrementa el porcentaje de recuperacin de las
fases IJ (Gaugler y Han, 2000). La temperatura de
incubacin de la bacteria se hace entre los 28 y 30
C y el desarrollo del cultivo monoxnico, entre los
22 y 25C.
Cultivo de NEP en biorreactor
Los biorreactores utilizados para este fin, son
los convencionalmente usados en la industria o
bien con algunas modificaciones o rediseo para
un mejor desarrollo del cultivo, bajo esfuerzo de
corte y sobre todo para un suministro adecuado de

Pgina

178

oxgeno; la agitacin y aireacin son de suma importancia y junto con la geometra del biorreactor
determinan la disponibilidad de los nutrientes y
oxgeno para ambos microorganismos as como las
condiciones para la cpula y desarrollo de los
NEP. En steinernemtidos, la cpula se realiza, si
el macho que es de menor tamao que la hembra
se enrolla alrededor de ella y este evento determina, junto con otros factores ya mencionados, el
rendimiento final del cultivo. Aunque la agitacin
con impulsores de paletas o propelas, provee un
mezclado eficiente para procesos en la industria
qumica o en cultivos de clulas bacterias y hongos,
se ha reportado que en el cultivo de NEP las hembras pueden sufrir ruptura mecnica si la velocidad
en la punta del impulsor excede de 1 m s-1 (Pace et
al., 1986). Para la velocidad de aireacin, se han
probado diferentes condiciones que van desde 0.05
volmenes de aire volumen de medio minuto
(vvm) hasta 1 vvm en reactores de diferentes tamaos, buscando que al momento de la inoculacin
de fases IJ la concentracin de oxgeno sea al menos del 20% de saturacin. Una aireacin excesiva
a menudo provoca gran produccin de espuma, lo
cual puede controlarse adicionando antiespumantes convenientes.
Autores como Pace et al. (1986) y Ehlers
(2001) han reportado concentraciones desde
23,000 hasta 95,000 IJ/mL (Cuadro 6) en reactores
agitados mecnicamente, sin embargo debido a los
esfuerzos cortantes imperantes en estos sistemas,
se ha optado por usar reactores con agitacin
neumtica, principalmente de los llamados Air-lift.
La Figura 6 muestra algunos de los diferentes tipos
de reactores Air-lift utilizados para el cultivo monoxnico de NEP. Las concentraciones logradas

Pgina

179

con estos sistemas van desde 40,000 hasta ms de

200,000 IJ/mL para Steinernema carpocapsae mientras
que para Heterorhabditis indica se han alcanzado concentraciones de 500,000 IJ/mL; sin embargo, en

Chavarria, Vergara y Rodriguez

este ltimo caso (Ehlers y Shapiro-Ilan, 2005) no

se menciona el tipo de agitacin ni la concentracin inicial de nemtodos empleada.

Figura 6. Distintos diseos de reactores Air-lift utilizados para la produccin de NEP a nivel laboratorio.
Los reactores i) a iii) (VL=0.5 L) han sido reportados por Neves et al. (2001), mientras que iv) se trabaj a
VL=4.4 L y probando dos
Algunos Aspectos de Ingeniera Bsica
de Reactores Air-Lift
Las columnas de burbujeo o reactores Air-lift,
patentados por Lefrancois, Mariller y Mejane en
1955, son un diseo alternativo a los tanques con
agitacin mecnica, los cuales se han usado durante aos en diferentes procesos industriales (Znd et
al., 2004). Los Air-lift no incluyen partes mviles y
la alimentacin de aire se hace desde la base de una
columna delgada que constituye el cuerpo del
tanque, algunas veces se utiliza una seccin cnica
en la parte superior de esta columna, que incrementa el rea de intercambio del gas. En estos reactores, los sensores se colocan en a) la tapa, b) en

donde termina la seccin cnica, o c) en un anillo

situado en la parte inferior del tanque (Allman,
1999). Los Air-lift involucran cuatro zonas durante
su operacin: en la zona de ascenso o riser, tiene
lugar la mayor cantidad de transferencia de masa
gas-lquido y es donde el lquido aireado fluye en el
mismo sentido de la inyeccin del gas. Al trmino
de esta zona, se encuentra la zona de desaceleracin o separador de gas, porque es aqu donde el
gas sube y sale por el venteo del tanque mientras
que el lquido, ya sin burbujas de gas o con baja
concentracin de stas, fluye a contracorriente del
gas por la zona de descenso o downcomer, para
ser aireado nuevamente en la zona inferior (Znd et

15

60,000

32

120,000

500,000

20

10

H. bacteriophora

H. bacteriophora

H. megidis

S. carpocapsae

S. carpocapsae

S. carpocapsae

S. carpocapsae

S. feltiae

5000

3000

750

500

500

24

332

195

120

20

2,000

Neumtica

Mecnica

Neumtica

Neumtica

Neumtica

Mecnica

Mecnica

Agitacin

Tipo de

Ehlers y Shapiro-Ilan,
2005

Columna de burSurrey y Davies,1996

bujeo

Ehlers et al., 1998

Sanjuan-Galindo, 2006

Recirculacin
interna
Turbina kapplan^

Mota y Neves, 2005

Neves et al., 2001

Recirculacin
externa

Recirculacin
externa*

Friedman et al., 1991

Pace et al., 1986

Referencia

Propela marina

Impulsor usado/tipo de recirculacin

^ Se utiliz un cilindro para implementar la recirculacin interna

180

- Datos no reportados

25

0.5

16

reproduccin
(FR=CT/C0)

Factor de

(C0; IJ/mL)

Conc. inicial

Pgina

* Se utiliz un reactor con recirculacin externa pero con una modificacin en el downcomer

20

193,406

15

12

110,000

97,500

10

Duracin del
Vol. de
Especie de
proceso (das) operacin (L) nemtodo usada

40,000

(CF; IJ/ mL)

Conc. final

Cuadro 6. Rendimientos de nemtodos entomopatgenos obtenidos en cultivos lquidos en biorreactores con distinto tipo de agitacin
Produccin de nematodos entomopatgenos

Pgina

181

al. 2004). Estos sistemas se han utilizado en el tratamiento de aguas residuales, en la produccin de
biomateriales y en fermentaciones de clulas sensibles al estrs hidrodinmico. Las ventajas de su uso
son el bajo consumo de energa, facilidad de construccin, operacin y mantenimiento, permiten
conservar condiciones aspticas por largo tiempo y
las caractersticas hidrodinmicas imperantes pueden modificarse en funcin de cambios en su geometra (i.e., tipo de recirculacin, tipo del draft, accesorios adicionales, modo de operacin, tipo del
difusor, etc.).
Algunos de los parmetros que describen
tanto la hidrodinmica como el funcionamiento de
los reactores tipo Air-lift son el hold-up (i.e., fraccin de retencin de gas), la velocidad del lquido
en cada zona del reactor y el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (kLa) (Wen et al.,
2005), los cuales se explican a continuacin.
Hold up (fraccin de retencin de gas). Es el
aumento del volumen en la fase lquida en proceso
a causa de la inyeccin de gas, introduccin de un
slido o ambas; este parmetro es de suma importancia para el diseo del reactor ya que determina
la altura del mismo y consecuentemente el mximo
volumen de trabajo, as como el tiempo de residencia del gas en el lquido, que en combinacin con el
tamao de burbuja, determina el rea interfacial
gas-lquido disponible para la transferencia de masa. El valor del hold up, vara en las distintas zonas
del reactor como consecuencia del proceso de
mezclado donde tienen lugar la ruptura y coalescencia de las burbujas. El hold up puede determinarse por varios mtodos (los ms comunes son
expansin de volumen y conductancia) y tanto en
la fase slida como en la lquida o ambas. En la

Chavarria, Vergara y Rodriguez

literatura se han reportado algunas correlaciones

para determinar el hold up total en un reactor Airlift, entre ellas la de Molina-Grima et al. (1997):
g =

Ar gr + Ad gd

(1)

Ar + Ad

Donde,
g = Hold up total
Ar = rea seccin transversal del riser
gr = Hold up en el riser
Ad = rea seccin transversal del downcomer
gd = Hold up en el downcomer
Velocidad del lquido: Determina el tiempo
de mezclado (i.e., lapso de tiempo que transcurre
hasta que las condiciones en el reactor se vuelvan
estables a partir de un cambio en la alimentacin),
reflejado en variables de respuesta como son pH,
temperatura, coloracin y conductancia. Una vez
medida experimentalmente la velocidad del lquido
y obtenido el valor del hold up, es posible calcular
la velocidad superficial del lquido, la cual a su vez
permite determinar la prdida de energa por friccin del medio con las paredes mediante la Ecuacin 2 (Molina-Grima et al., 1997):
Ef = 2CrU Lr (U Lr + U gr )

hD
(U Lr Ar )
dr

(2)

Donde,
Ef = Prdida de energa por friccin
Cr = factor de friccin
hD = altura de la dispersin
Ar = rea seccin transversal del riser
ULr =Velocidad superficial del lquido
Ugr = Velocidad superficial del gas
dr = dimetro del riser

Produccin de nematodos entomopatgenos

Pgina

El factor de friccin Cr se puede deducir a

partir de la ecuacin de Blasius (Ecuacin 3 para
downcomer y riser; Ecuacin 4, para riser solamente) (Wen et al., 2005; Molina-Grima et al.,
1997):
Cr = 0.0791 Re Hi

0.25

(3)

LU Lr d r

Cr = 0.0792
(1 - - ) )
gr
sr
L

0.25

(4)

Donde el nmero de Reynolds est definido como:

Re Hi =

HiVLi Di
Hi

(5)

Donde,
i = cada una de las zonas del reactor (i.e. riser,
downcomer)
Hi,, L= densidad promedio del lquido (kg/m3)
VLi, ULr= velocidad del lquido en cada una de las
zonas i del reactor (m/s)
Di, dr= dimetro en cada una de las zonas i del reactor (m)
Hi, L= viscosidad promedio (Pa s)

Por lo tanto:
Re =

sidad no es un factor limitante, mientras que valores pequeos indican lo contrario. Por otra parte,
este parmetro puede utilizarse como criterio para
el escalamiento de procesos donde la viscosidad
juega un papel determinante en las transferencias
de masa, oxgeno y/o momento.
Coeficiente volumtrico de transferencia
de masa (kLa). Es quiz el parmetro ms importante en una fermentacin aerobia (sin importar el
tipo de aireacin), puesto que determina la capacidad del sistema para transferir oxgeno a los microorganismos (Quintero, 1990). La Ecuacin 8 describe el flux de transferencia de oxgeno en procesos de este tipo.
Na = k L a(C * C L )

Donde,
Na = Flux de transferencia de O2
kL = Coeficiente de transferencia de O2 en la fase
lquida
a = rea interfacial por unidad de volumen
C* = Concentracin de saturacin de O2

El nmero de Reynolds es la relacin entre

las fuerzas de inercia y las fuerzas viscosas
(Ecuaciones 6 y 7), por lo que expresa la magnitud
de los factores que favorecen el flujo de un fluido y
de aquellos que se oponen a ste (Mataix, 1982).
inercia
L L

=
vis cos idad

182

(6)

(7)

As, valores altos de Re indican que la visco-

CL = Concentracin de O2 en el seno del lquido

El kLa puede variar durante el transcurso de
cada fermentacin y puede ser determinado experimentalmente por diferentes mtodos: a) mtodo
dinmico, b) oxidacin de sulfito, y c) consumo
biolgico del oxgeno. Especficamente hablando
del kLa en reactores Air-lift, Znd et al. (2004) propusieron la Ecuacin 9 para calcular el coeficiente
global de transferencia de oxgeno.

Pgina

Chavarria, Vergara y Rodriguez

183

P
k L a = 1.27 x10 G
VL

0.925

(9)

Donde,
L gU gr
PG
=
V 1+ ( A / A )
d
r
L

(10)

PG = Potencia debida a la aeracin

VL = Volumen de trabajo del reactor
L = densidad del lquido
g = aceleracin de la gravedad
Los tres parmetros hidrodinmicos anteriormente descritos, estn directamente relacionados
con las condiciones de operacin, la geometra del
reactor y con las propiedades fisicoqumicas del
medio lquido, de las cuales, la viscosidad es una de
las ms importantes. sta ltima es la propiedad
fsica de los fluidos de resistirse a fluir (Bird et
al., 1987) y constituye la constante de proporcionalidad entre el esfuerzo unitario cortante y la variacin de la velocidad de cizalla en las capas de un
fluido (Ecuacin 11)
=

d
dy

(11)

La Ecuacin 11 (ecuacin de Newton para la

viscosidad) es generalizada y se cumple en los fluidos donde el esfuerzo cortante es proporcional al
gradiente de velocidad; sin embargo, existen fluidos en donde la relacin esfuerzo cortante
gradiente de velocidad no es proporcional por lo
cual se denominan no Newtonianos (Figura 7).
La mayora de los fluidos lquidos utilizados
industrialmente son no Newtonianos y los caldos

Figura 7. Curvas de flujo tpicas de algunos materiales.

de fermentacin incubados en biorreactores no
son la excepcin, adems de que la viscosidad de
stos a menudo es importante y cambia con el
tiempo debido a las complejas reacciones bioqumicas que tienen lugar durante estos procesos
(Lpez y Lpez et al., 2000). Por otra parte, la reologa -ciencia que estudia el flujo y la
deformacin- se encarga de estudiar a los fluidos
no Newtonianos, entre otros sistemas, de manera
tal que es posible inferir cul es el comportamiento
de estos fluidos bajo diversas condiciones de proceso, ajustando los datos obtenidos en pruebas experimentales a modelos reolgicos que relacionen
las variables involucradas (i.e. velocidad de cizalla,
esfuerzo de corte). Uno de los modelos ms usados para describir el comportamiento de los fluidos no Newtonianos es el de Ostwald de Waele o
Ley de la Potencia (Ecuacin 12) ya que es sencillo

Produccin de nematodos entomopatgenos

y se aplica tanto en anlisis tericos como en clculos de ingeniera aun cuando solamente describe la
zona lineal del comportamiento reolgico, motivo
por el cual es necesario manejar con cautela las extrapolaciones que puedan hacerse del ajuste con
este modelo (Barnes et al., 1999).
= K

n 1

(12)

Donde,
Donde,
= viscosidad
K=ndice de consistencia
n=ndice
de comportamiento al flujo
.

= cizalla

Pgina

184

Reologa en caldos de fermentacin para la

produccin de NEP
Referente al cultivo de NEP, poco se ha investigado con respecto a condiciones hidrodinmicas, parmetros reolgicos y viscosidad en los caldos de fermentacin involucrados. Sin embargo,
algunos autores han evaluado el comportamiento
reolgico del cultivo monoxnico en matraz agitado y en biorreactor Air-lift (Chavarra-Hernndez et
al., 2003; Sanjuan-Galindo, 2006) usando precisamente el modelo de Ostwald de Waele. La determinacin de la viscosidad y su evolucin en sistemas biolgicos es muy importante porque afecta
directamente las condiciones hidrodinmicas y de
oxigenacin imperantes en el reactor. Por lo tanto,
la viscosidad es un parmetro que debe considerarse durante el diseo de procesos y la eleccin de
las condiciones de operacin para lograr productividades convenientes.

Un Mtodo para Producir NEP Mediante Cultivo Sumergido en

Biorreactor Air-lift
Materiales y mtodo sugeridos.
Especmenes
NEP. Fases IJ de Steinernema spp. se propagan en cultivo in vivo, usando larvas de Galleria
mellonella o en cultivo in vitro lquido (medio de
produccin para NEP, MA-10) a nivel frasco agitado orbitalmente. Los IJ obtenidos, se lavan y sanitizan con solucin 0.2 % v/v Thimerosal para luego enjuagarse 3 veces con agua destilada estril.
Las fases IJ as sanitizadas se mantienen en suspensin acuosa (200,000 IJ/mL) en botellas para cultivo de tejidos (rea=90 cm2, VT=250 mL y VL=30
mL) con tapa permeable al aire a temperatura ambiente y agitacin de 80 rpm durante 2 h cada 8

das hasta el momento de su utilizacin. Se estran

cajas de NBTA con suspensin de NEP para descartar presencia de microorganismos contaminantes.
Bacteria simbionte. La bacteria simbionte se aisla fragmentando fases IJ de Steinernema spp. recin
recuperadas de trampa de White, en 10 mL de medio STB (Caldo de soya tripticaseina) previa sanitizacin superficial con hipoclorito de sodio al 7%.
Esto se hace por duplicado en cajas Petri (D=5
cm) las cuales se incuban a 28C, y despus de 48
h, se estran cajas de NBTA (Agar Azul de Bromotimol - Cloruro de Trifeniltetrazolio) que se incuban a 28C durante 48 h ms. Posteriormente se
selecciona una colonia aislada de color azul que es

Pgina

185

Chavarria, Vergara y Rodriguez

STB (Medio de produccin bacteriano)

(Buecher y Propiel, 1989). 3% p/v caldo de
soya tripticasa y 0.5% p/v extracto de levadura.
pH de 7.
Agar NBTA (Medio selectivo y diferencial
para bacteria simbionte) (Akhurst, 1980). 2.3%
p/v agar nutritivo, 0.0375 % p/v azul de bromotimol y 0.004 % v/v TTC (cloruro de trifenil tetrazolio). pH de 8.5.
MA-10 (Medio de produccin para los nematodos). 10% v/v aguamiel estril, 2% v/v
aceite de maz, 1% p/v yema de huevo deshidratada, 0.5% p/v NaCl, 1% de extracto de
levadura. Incluye 0.3 mL de antiespumante A
[100% base silicn] (SIGMA-Aldrich) por cada
litro de medio. pH de 7.5.
NOTA: Todos los medios se preparan con
agua desionizada, el pH de se ajusta con 40%
p/p hidrxido de sodio y se esterilizan a 15
lbf/in2 durante 15 min en autoclave, con excepcin del medio MA-10 para el cultivo en
biorreactor.

Figura 8. i) Reactor S (SEV, Mxico); ii) Filtro y humidificador de aire; iii) sedimentador de acero inoxidable acoplado a la tapa del reactor A; iv) Reactor A acoplado a
consola ADI 1031 y controlador ADI 1030 (Applikon,
The Netherlands ).
inoculada en 75 mL de medio STB (matraz Erlenmeyer, VT=0.5 L) que se incuba a 30C y 150 rpm
en una incubadora con agitacin orbital (SEVINO 650V, Mxico) durante 30 h. Transcurrido
este tiempo y luego de verificar que el pH del cultivo bacteriano es entre 8 y 9, se agrega 25% v/v
glicerol estril para preparar viales de conservacin
(1.5 mL) acondicionados posteriormente a su preparacin con 1 h de refrigeracin a -4C, seguida
de 1 h en congelacin a -18C para luego mantenerlos en ultracongelacin a -80C, mantenindolos as hasta su uso (previa verificacin de que la
bacteria se encuentra en fase I).
Medios de Cultivo

Fermentadores
Se utilizan dos configuraciones de reactor Air
-lift con recirculacin interna: un MTB (Modular
Tower Bioreactor 3.4 L - Applikon, The Netherlands) acoplado a la consola ADI 1030 y controlador ADI 1031 de la misma marca, y un reactor Air
-lift con tubo draft liso (Sanjuan-Galindo, 2006)
(SEV, Mxico) que se identificarn como Reactor
A y Reactor S, respectivamente. El aspecto, dimensiones y geometra de cada reactor se muestran en
la Figura 8 y Cuadro 7. El volumen de trabajo de
ambos biorreactores es el mismo, siendo las diferencias principales, la forma del tanque y la presen-

Produccin de nematodos entomopatgenos

cia de un sedimentador de acero inoxidable en el reactor A,

que tiene la finalidad
de disminuir la velocidad de flujo en el comienzo de la zona de
descenso (i.e., downcomer).

Un volumen de
420 mL de medio STB
(Matraz Erlenmeyer
VT=2 L) se inocula con
un vial de conservacin
de X. nematophila y se
incuba a 30C durante
48 h. Se verifica el pH
cercano a 8 y se estran
muestras en NBTA.

186

Cuadro 7. Medidas principales de los reactores A y S utilizados para la produccin de NEP.

Representacin
Magnitud
Reactor A
Reactor S
Volumen total de trabajo

VT

4.2 L

4.2 L

Radio interno mayor del reactor

Rcolumna

6.5 cm

5.5 cm

Radio interno menor de reactor

rcolumna

3.125 cm

4.75 cm

Longitud axial mxima de operacin

Hcolumna

54 cm

51 cm

rea transversal mxima del reactor

Acolumna

132.73 cm2

95.03 cm2

ADWN(1)

109.83 cm2

71.27 cm2

aDWN(2)

15.47 cm2

47.12 cm2

hbottom

2.0 cm

2.0 cm

Radio interno del tubo draft

rint draft

2.58 cm

2.5 cm

Radio interno del sedimentador [a]

rint [a]

5.0 cm

Radio interno del sedimentador [b]

rint [b]

6.5 cm

epared

0.2 cm

0.25 cm

aint draft

12.56 cm2

19.63 cm2

a int [a]

33.18 cm2

a int [b]

19.63 cm2

Cultivo monoxnico rea transversal de la corona 1 en la zona

en biorreactor con del downcomer
agitacin neumtica. rea transversal de la corona 2 en la zona
Inculo bacteriano

Pgina

del downcomer
Separacin del tubo draft con la base del
fermentador

Grosor de pared en tubo draft y sedimentador

rea transversal interna del tubo draft
(zona de ascenso, riser)
rea transversal interna del sedimentador
[a] (zona de ascenso, riser)
rea transversal interna del sedimentador
[b] (zona de ascenso, riser)

Los electrodos de pH y
Longitud del tubo draft
hdraft
33.3 cm
27.5 cm
temperatura se insertan
V int draft
693.53 cm3
579.23 cm3
en los reactores as como Volumen en el interior del tubo draft
el puerto para toma de Dimetro del difusor
d difusor
4.0 cm
2.5 cm
muestra y electrodo de Capacidad de suministro de aire del comQ
1-10 lpm
1-10 lpm
oxgeno. Se conectan a presor
cada reactor, previa este- Sistema de enfriamiento
Chaqueta
Chaqueta
rilizacin (40 min a 15
lbf/in2), un filtro de aire accesorio relleno de algodn como una trampa de gases en el venteo (salida del tan(construido con una botella de vidrio con dimetro y que) (Figura 9). Cada biorreactor se esteriliza in situ, suvolumen variables) y en la salida de un filtro PTFE ministrando vapor a 13-15 lbf/in2 durante 50 min al
(d=4.5 cm, corte de 0.2 m) unido a un humidificador tanque completo y 20 min a cada entrada-salida hacien(d=15 cm, VT=3.8 L con 3 L de agua desionizada), as do las conexiones necesarias (i.e., filtros de aire -

Pgina

187

Chavarria, Vergara y Rodriguez

Cultivo monoxnico
Un volumen de 3.8 L de
MA-10 se esteriliza para cada
reactor en botellas de vidrio
(d=20 mm y VT=9.7 L) a 15
lbf/in2 durante 40 min. Una vez
que baja la temperatura de los
reactores, se llena la chaqueta
de enfriamiento y se bombea el
medio de produccin MA-10
estril a cada tanque. Se mantienen con una aireacin de 2
vvm durante 18 h, tiempo al
cual se bombea el inculo bacFigura 9. Esquema de filtrado y alimentacin de aire en los biorreactoteriano (previamente calibrado res Air-lift, as como ubicacin del puerto para toma de muestra y elecel electrodo de O2 disuelto), en trodos. Clave: C=compresor de aire, FP=filtro PTFE 0.2 m, F=filtro
una proporcin del 10% del to- de algodn, H=humidificador, Tm (A, S)=toma-muestra en el Reactor
tal de volumen de trabajo. Se A o S respectivamente, TG=trampa de gases y E= electrodos.
ajusta la temperatura de trabajo
En cada muestreo se estra una placa de
a 30C, misma que se mantiene durante 48 h con
NBTA para revisar el estado de la bacteria y se founa aireacin de 1.5 vvm en cada fermentacin
tografan los diferentes estadios de desarrollo de
realizada. Una vez cumplidas las 48 h, se inoculan
los NEP en un microscopio de campo claro
fases IJ de NEP a los reactores para alcanzar una
(Eclipse 80i, Nikkon, Japan) con una cmara digiconcentracin aproximada de 1000 IJ/mL, camtal. Cuando se hace reometra, NEP se fotografan
bindose la temperatura a 23C con un rgimen de
antes y despus del cizallamiento en el remetro.
aireacin variable (1 a 1.5 vvm) hasta el trmino
Conteo de NEP viables
del proceso.
Muestreo durante el cultivo
El muestreo durante el cultivo se hace cada
2 d involucrndose los siguientes volmenes de
caldo de fermentacin extrados de los biorreactores:
Purga, 10 mL
Conteo de NEP, 10 mL
Determinaciones reolgicas, 30 mL (cada 4 d)

De los 10 mL de caldo de fermentacin destinados al conteo de NEP, se toman alcuotas de

100 L y se hacen diluciones hasta 10-3
(dependiendo de la concentracin total de NEP en
el reactor) usando agua desionizada de forma que
se puedan contar los NEP bajo el microscopio
usando magnificaciones de 40 a 400. El recuento se hace por triplicado.
Determinaciones reolgicas

Produccin de nematodos entomopatgenos

Muestras de 30 mL de caldo de fermentacin

son cizalladas en un remetro de esfuerzo controlado (AR-2000; TA Instruments, USA) usando la
geometra de paletas o vane rotor en un intervalo de velocidad de cizalla de 50 s1 a 600 s1 y viceversa con una etapa de pre-cizallamiento con la

Pgina

188

finalidad de suspender las partculas del medio y

por supuesto, los nematodos, as como descartar
posible dependencia de las propiedades reolgicas
con el tiempo. Todas las muestras son cizalladas a
25C durante 37 min, obtenindose las curvas de
flujo correspondientes.

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