UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Per , Decana de Amrica

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
Departamento Acadmico de Bioqumica

Anlisis cintico de la inhibicin

enzimtica, inhibicin competitiva,
no competitiva y acompetitiva,
inhibicin irreversible, frmacos
como inhibidores, antimetabolitos

20/09/2013

20/09/2013

 La importancia del estudio de la cintica

enzimtica reside en dos principios
bsicos. En primer lugar, permite
explicar cmo funciona una enzima, y
en segundo lugar, permite predecir
cmo se comportar esa enzima in vivo.
Las constantes cinticas definidas
anteriormente, Km y Vmax, son los pilares
fundamentales a la hora de intentar
comprender el funcionamiento de las
enzimas en el control del metabolismo.
20/09/2013

20/09/2013

La actividad enzimtica puede ser disminuida o eliminada por la

accin de ciertas sustancias a las cuales se les conoce con el
nombre de inhibidores enzimticos. Mediante el uso de
inhibidores enzimticos se ha obtenido informacin muy valiosa
sobre la conformacin del centro activo de algunas enzimas.
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Producion celular de especies

reactivas del oxgeno
Oxidasas de funcin mixta: citocromos P-450

retculo endoplsmico
DNA
citoplasma
++(+)
peroxisoma Fe +(+)

Cu

mitocondria

membrana celular
bicapa lipdica
oxidasas
flavoprotenas
Metales de transicin
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xantina oxidasa
hemoglobina
riboflavina
catecolaminas

Cadena
respiratria

lipoxigenasa
prostaglandina sintasa

 Los inhibidores enzimticos son

molculas que se unen a las
enzimas y disminuyen su
actividad. Ya que el bloqueo de
una enzima puede matar un
organismo patgeno o corregir
un desequilibrio metablico,
muchos medicamentos actan
como inhibidores enzimticos.
Tambin son usados como
herbicidas y pesticidas.
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Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad

enzimtica, a travs de interacciones con el centro activo u
otros centros especficos (alostricos).
Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a
la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica
De esta forma, habr dos tipos de inhibidores segn el lugar de
accin:
I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo
II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la
molcula, causando un cambio conformacional con
repercusin negativa en la actividad enzimtica.

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Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: Se unen a la enzima de forma
no covalente estableciendo un equilibrio con la
enzima libre y diferentes tipos de inhibiciones son
producidas dependiendo en si el inhibidor se une a
la enzima, al complejo enzima sustrato o a los dos.
E+I

EI

ES + I

ESI

2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:

E+I

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Caractersticas
Disminuir o bloquear la velocidad de
reaccin, unindose a la enzima.
Son especficos.
Alteran grupos importantes para la
funcin cataltica, o Alteran
ligeramente la conformacin de la
enzima sin llegar a desnaturalizarla.

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Aplicacines
Permiten determinar qu
aminocidos estn presentes en el
sitio cataltico de la enzima y su
probable rol en la catlisis.
Son el fundamento de frmacos
antivricos, antibacterianos y
Proteasa del HIV formando un
antitumorales.
complejo con la proteasa inhibidora
ritonavir. La estructura de la protesa
se muestra como una cinta roja, azul
y amarilla. La inhibidora se muestra
como una estructura de pequeas
bolas y varillas cercana al centro.

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Mediante el uso de inhibidores

enzimticos se ha obtenido
informacin muy valiosa sobre la
conformacin del centro activo de
algunas enzimas.
Ciertos metales como el plomo,
mercurio y arsnico inhiben enzimas
que tienen en su centro activo grupos
SH libres.
El proceso de inhibicin enzimtica es
til para comprender los mecanismos
de farmacolgica de algunos
compuestos o medicamentos.

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 Muchas molculas de medicamentos son inhibidores

enzimticos, por lo que su descubrimiento y mejora
es un campo de investigacin activo en la
bioqumica y la farmacologa. Un inhibidor
enzimtico medicinal es juzgado a menudo por su
especificidad (su carencia de unirse a otras
protenas) y su potencia (su constante de
disociacin, la cual indica la concentracin necesaria
para inhibir a la enzima). Una alta especificidad y
potencia asegura que el medicamento va a tener
pocos efectos secundarios y as su toxicidad baja.

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Los IE tambin son usados en la naturaleza y estn

implicados en la regulacin del metabolismo.
p.e las enzimas en una ruta metablica pueden ser
inhibidas por los productos resultantes de sus
respectivas va. Este tipo de contra reaccin retarda
el flujo a travs de la va cuando los productos
comienzan a acumularse y es una manera
importante de mantener la homeostasis en una
clula. Otros inhibidores enzimticos celulares son
protenas que se unen especficamente e inhibe a su
blanco de la enzima

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. Esto puede ayudar a controlar enzimas que

pueden ser dainas para la clula, como las
proteasas o nucleasas; un buen ejemplo es el
inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta
enzima en una de las interacciones protena
protena ms fuertes conocidas. Inhibidores
enzimticos naturales tambin pueden ser
venenos y ser usados como defensa en contra
de depredadores o una forma de matar a la
presa.

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Inhibicin. Tipos
Inhibicin Permanente(irreversible)
Unin del inhibidor de manera irreversible por
enlaces covalentes, con la enzima provocando
una modificacin en su estructura qumica de
los residuos esenciales de los aminocidos de
los grupos ubicados en los centros de fijacin y
sitio activo. Ejemplo: el iodoacetato reconoce
grupos SH y OH y envenena la cistena.
Irrreversibles: se dan en los denominados
zimgenos o proenzimas, que son enzimas que se
producen en forma activa. Por hidrlisis parcial, se
transforman en forma activa. As sucede con las
enzimas digestivas: pepsina, tripsina y quimotripsina,
que se secretan como pepsingeno, tripsingeno y
quimotripsingeno.
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Mecanismo de accin de la
G3PDH

Inhibicin irreversible por iodoacetato, bloqueo de

grupo SH en el sitio activo de la enzima
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Inhibicin reversible
La unin del inhibidor a la enzima es

temporal. Al quitar el inhibidor del medio

se recupera la actividad.
Para distinguir si la inhibicin es
reversible o no, se somete a dilisis el
complejo E-I; si la actividad no se
restablece, la inhibicin es permanente.
Los inhibidores reversibles se unen a la enzima
con interacciones no covalentes tales como los
puentes de hidrgeno, interacciones
hidrofbicas y enlaces inicos.
Los enlaces dbiles mltiples entre el inhibidor y
el sitio activo se combinan para producir una
unin fuerte y especfica. Reversibles: El
complejo EI se forma por uniones no
covalentes. Puede disociar
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Tipos de inhibicin reversible pueden ser clasificados

El como:
inhibidor se fija al centro activo de la
enzima libre, impidiendo la fijacin del
substrato: Inhibicin Competitiva
El inhibidor se fija a la enzima
independientemente de que lo haga o no el
substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijacin del substrato a la enzima, pero s
impide la accin cataltica: Inhibicin No
Competitiva
El inhibidor se fija nicamente al complejo
enzima-substrato una vez formado,
impidiendo la accin cataltica; este tipo se
conoce como Inhibicin Anticompetitiva
Mixtos.
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Inhibicin
Competitiva

I y S compiten por sitio

cataltico.
Por lo general, el inhibidor
competitivo es un anlogo
qumico o derivado del
substrato no metabolizable
del verdadero sustrato.
Acta slo aumentando el
Km (Km app) para S.
Vm permanece inalterable
- Las fijaciones de substrato e
inhibidor son mutuamente
exclusivas
A muy altas concentraciones de
substrato desaparece la
inhibicin
El inhibidor es tan especfico
como el substrato
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Ks

k3

E + S E-S E + P
+
I
KI
EI
Se define una constante de
equilibrio de disociacin del
inhibidor:
Ki = [E] [I]
[EI]

20

Vmax igual
KM diferente

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Medicamentos antivirales efectivos contra el H1N1, el

Oseltamivir y el Zanamivir, son inhibidores competitivos de la
Neuraminidasa y son particularmente efectivos en las
primeras 48 horas, antes de que el virus logre liberarse de
sus clulas huspedes inciales e infectar otras clulas.
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Inhibidores Competitivos
Antibiticos
Insecticidas
Hervicidas

Dolor

Venenos

Inhibicin Inflamacin
Diferentes Medicamentos enzimtica
Infecciones virales
Cncer
Malonato
Malonato

Deshidrogenasa
Deshidrogenasadel
delcido
cidosuccnico
succnico

Sulfas
Sulfas

Infecciones
Infeccionesmicrobianas
microbianas

Antihipertensores:
Antihipertensores:Captopril
CaptoprilyyEnalopril
Enalopril
Alopurinol
Alopurinol

Controla
Controlalalagota
gota

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Fluoruracilo
Fluoruracilo

Cncer
Cncer

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Inhibicin No
Competitiva

I se une tanto a la
enzima como al
complejo E-S.
Km no se altera (KI =
Km ).
Vm vara. Disminuye a
medida que aumenta
[I].
I, podra impedir la
conformacin de
centro cataltico.
No puede ser superada
aumentando [S].
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Ks

k3

E+S E-S
E+P
+
+
I
I

EI+S ESI
Ks

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 La presencia del I hace que decrezca la

vmx (es decir, no puede ser compensada
su presencia por elevadas [S]) pero la K m
aparente no vara (o sea, que a la
misma [S] se alcanza la 1/2 vmx
correspondiente a la presencia del
inhibidor). En realidad la afinidad de E
Algunas
poseen
un grupo -SHrealmente
esencial, SON INHIBIDAS
por SE que
s ha
disminuido
NO(aunque
COMPETITIVAMENTE
por iones de metales pesados (la
no "aparentemente").
enzima requiere esos grupos -SH intactos para su actividad
normal). El agente quelante EDTA (tetra-acetato de etilendiamida) se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes
divalentes, e inhibe as de modo no competitivo a algunas E
que precisan esos iones para su actividad.
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El inhibidor NO se une al sitio activo

NO se puede revertir con un exceso de

sustrato
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27

Inhibicin Acompetitiva El inhibidor

slo puede fijarse al complejo ES; el
complejo ESI no es productivo
I slo se une al
complejo E-S.
I no se une al centro
activo
sino
a
cualquier otro sitio.
No se puede superar
la
inhibicin
aumentando la [S].
Km es ms pequeo
(aparente afinidad)
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Ks

k3

E + S E-S
E+P
+
I
kI
ESI
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Cinticas de Inhibicin
Competitivo
Vmax igual
KM diferente

1
V

No competitivo
Vmax diferente
KM igual

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No inhibitor

1/[S]

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Inhibicin acompetitiva
El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora

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La subunidad cataltica
une al sustrato y
cataliza la reaccin 30

Activacin Enzimtica
Cuando
un
ligando
(soluto,
compuesto)
en
el
medio
de
reaccin, aumenta la eficiencia con
que una enzima cataliza una
reaccin o proceso.
Tipos:
Activacin enzimtica esencial.

Activacin
esencial.
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enzimtica

no
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Activacin Enzimtica
Esencial
Activador (A) es imprescindible
para la enzima.
En su ausencia no hay actividad
de la enzima.
Puede ser un segundo sustrato.
La enzima Hexoquinasa tiene dos
sustratos: glucosa y ATP-Mg.
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puede ser un metal. El metal

interacciona con S, o con la E, o
puede pre-existir ya ligado a la
enzima.
Carboxipeptidasa: Zn+2 ligado
fuertemente a la enzima.
Hexoquinasa: Mg+2 ligado a
sustrato ATP.
Enzimas dependientes de K+: K+
interacciona directamente con la
enzima como si fuera un sustrato y
luego el K+ se desliga de la enzima.
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Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
qumico de la enzima, modificndola covalentemente
- Su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki,
sino por una constante de velocidad ki:

E+I

- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los

inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin
del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
txicos.
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Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)
Acetilcolina

Acetilcolinesterasa

Acetato + Colina

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Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)

Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de
gusanos de seda
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Malatin
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Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
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Reactivos de grupos -SH, 1

(a) Agentes alquilantes
Yodoacetato

ICH2 COO-

SH

IH

S CH2 COOO

(b) Compuestos insaturados

E

E S

SH
O

N CH2 CH3
O

N CH2 CH3

N-Etil maleimida (NEM)

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Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercptidos
HOHg

SH

COO-

p-Hidroximercuribenzoato

S Hg

COO-

(d) Oxidantes
Promueven la oxidacin de dos tioles a un disulfuro

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Organofosfricos

Ser CH CH2

H 3C

OH

Ser CH CH2
H3C

CH3
CH

P O

CH
H3C
CH3

DFP:
diisopropil
fluorofosfato

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CH3
CH

O P O
CH
H 3C
CH3

- Actan sobre enzimas sernicas

- nicamente sobre la Ser activa
- Insecticidas: Parathion, Malathion
- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa
- Neurogases
40

Ligandos de coordinacin de metales

Es el caso del ion cianuro, CNSe fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacin
del Fe hemnico, impidiendo toda modificacin posterior.
Por ello acta sobre sistemas de Fe hemnico con la sexta
posicin de coordinacin libre, como la citocromo oxidasa,
de lo que deriva su elevadsima toxicidad

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Substratos suicidas (Inhibidores activados enzimticamente)

-Son inhibidores irreversibles, poco reactivos hasta que se
unen al sitio activo de un enzima especfica.
Se usan para obtener nuevos agentes farmaceuticos,
en el llamado el diseo racional de frmacos
Suelen ser muy efectivos y con pocos efectos secundarios
Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera
especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la
molcula en una especie qumica muy reactiva que modifica
covalentemente a la enzima, inactivndola
- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo
y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles
Ejemplo: difluorometilornitina para tratar la enfermedad
del sueo africana (tripanosomiasis africana)
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Modo de accin de los inhibidores suicidas

E+I

EI

EI*

E + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un

inhibidor competitivo convencional
2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I
en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola
de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
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Ejemplos de inhibidores suicidas, 1

- Sistema de la -lactamasa bacteriana
La utilizacin masiva de antibiticos -lactmicos (penicilinas,
sus derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparicin de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son por
producir una enzima, la -lactamasa, que inactiva a los antibiticos -lactmicos.

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Penicilina (activa)
S

R CO NH

CH3
CH3

N
O

COO-

-Lactamasa

R CO NH
O C HN
O-

CH3
CH3

COO-

c.peniciloico
(inactivo)
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Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas

semisintticas se formulan aadiendo un inhibidor suicida
de la -lactamasa, el cido clavulnico
O
C

N
O

CH2OH
H

-Lactamasa

COO

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C
O-

HN

CH2OH
H

COO-

c.clavulnico

CH CH2
Ser

HN

CH2OH
H

COO-

Esta molcula
reacciona con la
serina activa de la
-lactamasa,
produciendo su
inactivacin
46

Ejemplos de inhibidores suicidas, 2

- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral
Los estados depresivos, en general, estn relacionados con un
descenso en la concentracin de neurotransmisores adrenrgicos
(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del
cerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradacin de estos
neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).
Por tanto, la inhibicin de la monoamino oxidasa se emplea como
teraputica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos
inhibidores suicidas de la MAO
20/09/2013

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HO
HO

Noradrenalina
CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

Monoamino
oxidasa
NH3 + H2O2
HO
HO

CHOH CHO

La MAO es una flavoprotena:

tiene un grupo prosttico
flavnico (FAD) fundamental
para la catlisis. Los inhibidores
suicidas de la MAO inactivan
al cofactor FAD.

Dihidroxifenilglicol
20/09/2013

48

H 3C

S H 2C

N,N dimetil
propargilamina
(pargilina)

NH
N

HC C CH N

Flavina

CH3

H 3C

Inhibicin suicida de la
MAO mediante Pargilina
E
20/09/2013

CH3

N+

CH CH

H 3C

CH

H3C

S H2C

Flavina modificada

O
NH
NH

R
49

20/09/2013

50
Bioqumica Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002

20/09/2013

51

INHIBIDORES: FARMACOS
Estos compuestos entre ellos muchos
frmacos prolongan la accin farmacolgica
de las drogas y aumentan su vida media en el
plasma.
Las enzimas biotransformantes poseen baja
especificidad de sustrato
Ellas pueden metabolizar varios sustratos
con distinta eficiencia y ser inhibidas por
diversos compuestos entre ellos los frmacos,
de acuerdo a las leyes de la inhibicin de
enzimas.

20/09/2013

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INHIBICION COMPETIVA
El agente inhibidor de la actividad enzimtica en
este caso puede ser:
Sustrato de la enzima (morfina y diazepam).
Compuesto que se une al sitio activo del sustrato
pero no es metabolizado por la enzima (anfetamina
no es metabolizada por la MAO pero inhibe el
metabolismo a travs de la MAO de tiramina).
Este tipo de inhibicin puede ser superada,
aumentando la concentracin del sustrato.
La estatinas son ejemplos de inhibidores
competitivos. Son anlogos estructurales del
sustrato de la HMG Co A reductasa enzima
reguladora de la sntesis del colesterol
20/09/2013

53

INHIBICION NO COMPETITIVA

Inhibicin no-competitiva. El agente inhibidor

forma un complejo con la enzima, el cual impide
parcial o totalmente la interaccin de la enzima
con su sustrato. Esta interaccin puede ser:
Reversible o irreversible, pero en cualquier caso
no es vencible por aumento de la concentracin
de sustrato.
Producida por intermediarios del metabolismo
que
son
muy
reactivos
que
inactivan
irreversiblemente a la enzima, ya sea debido a la
unin covalente a la protena (sistema del P450 :
Cloranfenicol) o al grupo HEM (citocromo P450 :
etinil-estradiol, secobarbital, SKF-525A).
20/09/2013

54

 El plomo es un ejemplo de
inhibidor no competitivo. Forma
enlaces covalente con los grupos
sulfhdrilos de la cisteina en las
protenas. Reacciona con la
ferroquelatasa, enzima que
incorpora hierro a la sntesis del
grupo hemo de la hemoglobina y
otras hemoprotenas.
20/09/2013

55

CONSECUENCIAS CLNICAS DE LA INHIBICIN

METABLICA

La inhibicin provoca un aumento de la vida

media del frmaco o del compuesto endgeno
cuyo metabolismo es inhibido, lo cual conlleva a
un aumento de la actividad farmacolgica.
La administracin de frmacos inhibidores del
metabolismo de compuestos endgenos, produce
las respuestas farmacolgicas correspondientes a:
La acumulacin de tales compuestos
endgenos, como es lo que ocurre con los
inhibidores de la acetilcolinesterasa, la MAO
y la dopa-descarboxilasa.
La falta de formacin del producto final:
inhibidores de la xantina-oxidasa.
20/09/2013

56

 5 de las 10 mas utilizadas drogas

medicamentosas son inhibidores
enzimticos.
La penicilina y la amoxicilina inhiben la
sntesis de las paredes bacterianas.(Beta
lactamasa)
El captopril, enalapril y el lisinopril
(hipotensores) inhiben la enzima
convertidora de angiotensina impidiendo la
formacin de angiotensina II a partir de la
angiotensina I.
20/09/2013

57

INDUCTORES
Aumentan los niveles enzimticos y por
tanto, la actividad enzimtica. Adems, en
general estos inductores aumentan el
clearance de los frmacos biotransformados
por las enzimas inducidas.

Mecanismos:
Entre los mecanismos involucrados en la induccin podemos
mencionar el aumento de:
La transcripcin del DNA.
La velocidad de Procesamiento del RNA.
La Estabilizacin del mRNA.
La Eficiencia translacional.
La Estabilizacin de la protena.
20/09/2013

58

CONSECUENCIAS CLNICAS DE LA INDUCCCIN

ENZIMTICA

Si el metabolito de un frmaco es
inactivo, la induccin enzimtica
produce una disminucin en la
intensidad y/o duracin del frmaco
cuyo metabolismo es inducido. Se
puede llegar a producir la tolerancia
farmacocintica (barbitricos).
Si el metabolito es la forma activa
teraputica
del
frmaco,
la
induccin enzimtica provocar un
aumento de dicha actividad, y si el
metabolito
produce
un
efecto
txico, se aumentar la toxicidad.
20/09/2013

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 Un frmaco inductor puede incrementar el

metabolismo de una sustancia endgena
como
la
induccin
de
la
UDPglucuroniltransferasa
encargada
de
glucuronidar la bilirrubina y facilitar as su
eliminacin (aplicacin de Fenobarbital a
recin nacidos que tienen ictericia).
Un frmaco inductor puede inducir la
produccin de una enzima sintetizante como
es el caso de los barbituratos que inducen la
sntesis
de
la
delta-mino-levulnicosintetasa, enzima clave en la sntesis del
HEM, por lo que los enfermos de porfiria
desencadenarn un crisis de porfiria.

20/09/2013

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 1 Cuales son las principales formas de

inhibicin enzimtica? Describa cada una de
ellas con grficos y ecuaciones.
2 Que caractersticas tendra un inhibidor
competitivo? Y uno no-competitivo?
3 Mencione la importancia biolgica del
fenmeno de la inhibicin enzimtica.
4 Esquematice un protocolo para evaluar
a) la presencia de un inhibidor
reversible/irreversible,
b) determinar el tipo de inhibicin reversible

20/09/2013

61