Universidad Estatal Del Sur

De Manab

TEMAS:

Prueba de la Antiglobulina
Directa e Indirecta Factores
Que Afectan A La
Antiglobulina Papel De
Integrantes:

Ponce Santistevan Mara

Parraga Cedeo Isaac
Fienco Uribe Andrea
Rodrguez Evelin
Catedrtico:
Lcdo. Javier Reyes
4to Semestre B

UNIVERSIDAD ESTATAL DEL SUR DE MANABI

Creada mediante Ley N 2001-38, publicada en el Registro Oficial 261 del 7 de Febrero del
2001

Unidad Acadmica de Ciencias de la Salud

Carrera de Laboratorio Clnico

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA

Es usada para detectar la sensibilizacin in vivo de los glbulos rojos, es de gran valor
en el diagnstico de la:

09/10/14

Enfermedad hemoltica del recin nacido

Anemia hemoltica autoinmune
Anemia hemoltica y sensibilizacin inducida por drogas
Investigacin de reacciones transfusionales

Procedimiento
1.

En un tubo de ensayo de 10 o 12 x 75mm, colocar una gota de clulas rojas al

5% suspendida en solucin salina fisiolgica (SSF).
Agregar suficiente SSF al tubo, tratando de obtener una suspensin uniforme
de las clulas.
Centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm para empaquetar los glbulos rojos en
el fondo del tubo. Decantar completamente toda la salina.
Agregar unas gotas de salina fresca al tubo, resuspender las clulas y luego
agregar ms salina para realizar el segundo lavado.
Centrifugar nuevamente y repetir el mismo procedimiento hasta completar 4
lavados.
Inmediatamente despus del cuarto lavado, agregar 2 gotas de reactivo de
antiglobulina humana y mezclar.
Centrifugar a 3400 rpm x 15 segundos, o 1000 rpm x 1 minuto
Examinar el tubo para observar si hay aglutinacin, graduarla en cruces y
anotar los resultados tubo en manos. Para facilitar la lectura es recomendable
emplear ayuda visual.
Las pruebas negativas deben confirmarse con clulas control de Coombs. Al
tubo de la prueba negativa se agrega una gota de clulas de control de
Coombs, mezclar, recentrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Interpretacin
Si la prueba de antiglobulina muestra aglutinacin, se interpreta positiva,
significa que hubo sensibilizacin in vivo de los eritrocitos y se informa: prueba
de antiglobulina o de Coombs directo positiva, sealando en cruces la
intensidad de la reaccin por ejemplo, 4+.
Si no hubo aglutinacin la prueba es negativa y significa que no existe
Autosensibilizacin eritrocitaria.
La prueba de antiglobulina negativa ser vlida, solamente, si la prueba
control de Coombs es positiva. En este caso, se informa: prueba de
antiglobulina o de Coombs directo negativa.

Comentarios

Actualmente, la circular de instrucciones de los reactivos recomienda que las

pruebas negativas se deben incubar durante un lapso de 5 a 10 minutos a
temperatura ambiente, para luego a recentrifugar y leer. Algunas veces, una
reaccin negativa puede hacerse positiva; este procedimiento es de utilidad
cuando se desea detectar sensibilizacin por complemento. No se debe
recentrifugar la prueba de antiglobulina si esta ha sido positiva dbil, porque
puede nagativizarse si la reaccin es debida a IgG.
1

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Para facilitar la lecturas de las pruebas es recomendable emplea una ayuda

visual, por ejemplo una lupa o una lmpara de leer aglutinaciones, la cual debe
estar provista de espejo amplificador. Algunos autores recomiendan leer las
pruebas negativas al microscopio para detectar aglutinacin no visible a simple
vista.
Es de primordial importancia controlar las pruebas de antiglobulina negativas,
con clulas presensibilizadas con IgG.

Al principio de esta prueba se basa en que si el lavado de las clulas de la prueba de

antiglobulina fue adecuado, debern haberse eliminado las inmunoglobulinas libres o
no fijadas a los glbulos rojos. Si la prueba ha sido negativa, el suero de antiglobulina
conservara su actividad anti-IgG y aglutinara las clulas de control de Coombs. El
resultado se interpretara as:
a) Si la prueba control de Coombs es positiva, demuestra que la tcnica de lavado
fue correcta y que el reactivo de antiglobulina tiene actividad anti-IgG, por lo tanto,
la prueba de antiglobulina es vlida.
b) Si la prueba control de Coombs es negativa, la prueba de antiglobulina quedara
invalidada y deber repetirse (correctamente) todo el procedimiento.

PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA

Esta permite detectar la sensibilizacin in vitro de los glbulos rojos. El suero en
estudio es incubado con los glbulos rojos por el tiempo adecuado, luego se lavan
para eliminar los anticuerpos y otras globulinas que no se han fijado al eritrocito, si la
adicin del reactivo de antiglobulina causa aglutinacin de los glbulos rojos, la
conclusin es que en el suero existen anticuerpos irregulares especficos para los
antgenos presentes en los eritrocitos. La deteccin de anticuerpos presentes en el
suero se pueden efectuar con:
1.

Clulas rojas especialmente seleccionadas, en las cuales se encuentran

presentes los antgenos de grupos sanguneos correspondiente a los
anticuerpos de mayor frecuencia e importancia clnica.
Con clulas de gentica conocida (panel) que permite hacer la identificacin
del anticuerpo presente. El panel se emplea una vez que se ha comprobado
que en el suero existe un anticuerpo irregular, demostrando mediante las
clulas detectoras.
Con clulas desconocidas, como en las pruebas de compatibilidad.

2.

3.

La prueba de antiglobulina indirecta se usa en:

Deteccin e identificacin de anticuerpos irregulares.

En la parte final de la prueba de compatibilidad.
Deteccin de antgenos no demostrables por otras tcnicas: D u, kell, Duffy,
kidd, etc. Identificacin de anticuerpos presentes en eluatos.
Pruebas especiales: consumo de antiglobulina, estudio de anticuerpos
antileucocitarios, antiplaquetarios, etc.

PROCEDIMIENTO
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1) En un tubo de ensayo de 10 o 12x75mm colocar 2 gotas de suero fresco en

estudio.
2) Agregar 1 gota de una suspensin de clulas lavadas una vez y preparadas al
5% en SSF.
3) Agregar 2 gotas de albumina bovina polimerizada o albumina al 22 % o al 30%.
Mezclar, centrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.
4) Incubar a 37C por 15 a 30 minutos. Centrifugar, leer y anotar los resultados,
tubo en mano.
5) Lavar 4 veces con suficiente SSF como en la prueba indirecta, decantando
cada vez toda la salina.
6) Agregar 2 gotas del reactivo antiglobulina humana poliespecfico y mezclar.
7) Centrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano.
8) Comprobar las pruebas negativas con clulas control de Coombs.

INTERPRETACION
Prueba de antiglobulina negativa + prueba control de Coombs positiva.
Interpretacin: prueba de antiglobulina negativa.
Prueba de antiglobulina negativa + prueba de control de Coombs negativa.
Interpretacin: Prueba no vlida.
Repetir todo el procedimiento. Averiguar la causa del error.

FACTORES QUE AFECTAN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA

Fase de sensibilizacin (in vitro)
Los siguientes factores afectan la unin del anticuerpo con el antgeno:

Temperatura
Los anticuerpos de la clase IgG reaccionan pticamente a 37C. la incubacin a
temperaturas menores puede reducir la unin del anticuerpo a su antgeno respectivo;
las temperaturas mayores de 37C pueden daar las clulas o el anticuerpo.

Medio de Reaccin
El medio de suspensin para los glbulos rojos puede ser SSF, albumina, suero inerte
(Suero AB libre de anticuerpo) o solucin de fuerza inica baja (LISS).
El efecto potenciador de la reaccin antgeno anticuerpo de estas soluciones ya ha
sido discutido el captulo 2.

Proporcin de clulas y suero

En la rutina del laboratorio, generalmente se emplea 2 gotas de suero ms 1 gota de
una suspensin de hemates al 5%, lo que da una proporcin aproximada de 40:1. Se
ha demostrado que aumentando la proporcin de suero a clulas (por ejemplo, 100:1),
algunas veces es posible que no aparecen en los procedimientos de rutina.
En las investigaciones de reacciones hemolticas, en las cuales no se detectaron
anticuerpos irregulares en la prueba cruzada, puede ser til aumentar la proporcin de

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suero con el fin de incrementar la concentracin del anticuerpo (por ejemplo, usar 3
gotas de suero).

Tiempo de Incubacin
Un periodo de incubacin de 15 a 30 minutos es suficiente para detectar la mayora de
los anticuerpos clnicamente importantes, cuando se emplea albumina como medio de
reaccin. La solucin de fuerza inica baja (LISS) permite acortar el tiempo de
incubacin de 10 a 15 minutos sin prdida de sensibilidad a la prueba.

FASE DE LAVADO
Tanto en la prueba de antiglobulina directa como la indirecta, el lavado de las clulas
es un procedimiento muy importante; las siguientes consideraciones deben ser
tomadas en cuenta en ambos casos:

Tiempo de Lavado
Terminada la fase de incubacin, el lavado de las clulas debe iniciarse
inmediatamente y debe ser continuo, para evitar la elucin del anticuerpo fijado a los
glbulos rojos.

Volumen de Salina
Deben usarse volmenes de SSF adecuados para diluir y eliminar de manera
efectiva las globulinas no unidas a los glbulos rojos. Los tubos deben ser
llenados hasta aproximadamente 1cm por debajo de la boca y deben
practicarse 4 lavados para remover todos los anticuerpos no fijados. Mollison
ha estimado que la presencia de una cantidad muy pequea de
inmunoglobulinas residuales despus del ltimo lavado, del orden de 2ug
IgG/ml, pueden neutralizar el reactivo de antiglobulina agregado.

Decantacin de la Salina
Para eliminar las globulinas no fijadas al glbulo rojo, es importante que
despus de cada lavado la salina sea decantada totalmente. Ello se logra
invirtiendo completamente el tubo y sacudindolo con un movimiento firme; una
vez que se ha vaciado, se termina de eliminar el residuo de salina
sacudindolo con fuerzas varias veces. Las clulas se quedaran adheridas al
fondo del tubo y podrn ser resuspendidas agregando unas gotas de salina
fresca y agitando el tubo con movimientos rpidos; luego, se completa el
llenado del tubo hasta el nivel sealado, descargando la salina con cierta
presin por el interior de las paredes.
No se debe introducir la punta de la pizeta dentro del tubo, por el riesgo de
contaminacin. Las lavadoras automticas pueden realizar este procedimiento
ms eficientemente que cuando se hace en forma manual, sin embargo, se
deben calibrar peridicamente para asegurar un lavado adecuado. La eficiencia
de un buen lavado, se puede apreciar en el cuadro.

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1.1 ml de
1.2 residuo
Volumen de Salina

2ml

Ug IgG remanente**
Despus de:
1 lavado

750

0.01ml de
residuo

0.05 ml de
Residuo
3ml

500

2ml

3ml

2ml

375

250

75

2 lavados

37.5
16.66

9.375

4.16

0.375
0.166

3 lavados

1.875
0.55

0.234

0.07

0.0018
0.0005

3ml

50

d) Contaminacin
Si se tapa la boca del tubo con el dedo para resuspender las clulas, se expone a la
contaminacin con protenas provenientes de la piel, las cuales pueden inactivar el
reactivo de antiglobulina. S e ha calculado que en una gota de dilucin de suero
humano en 1:4000 puede neutralizar una gota de antiglobulina.
e) Elucin
El anticuerpo fijado puede separarse de los glbulos rojos muy pronto, si son dejados
en suspensin salina; por tal razn, es importante que una vez iniciado el
procedimiento, est no se detenga. Al finalizar el lavado, debe agregarse
inmediatamente el suero de antiglobulina; si esto no se hace, el anticuerpo se despega
del glbulo rojo y al quedar libre, puede neutralizar el reactivo agregado dando un
resultado falso negativo.
f) Centrifugacin
La centrifugacin para el lavado de clulas difiere de la centrifugacin para acelerar la
aglutinacin y efectuar una lectura ms precisa. En el lavado, se requiere que las
clulas se precipiten y se empaquen en el fondo del tubo para evitar que al quedar
clulas suspendidas, stas se pierdan cuando se decante la salina. Para ello es
suficiente centrifugar a 3400 rpm durante 2 minutos. Para la lectura de la prueba, se
ha especificado que debe ser de 3400 rpm durante 15 segundos o 1000 rpm por 1
minuto. El exceso de centrifugacin en este paso puede conducir a interpretaciones
falsas positivas sobre lectura.
g) Lectura de la prueba
Para una correcta interpretacin, las clulas deben desprenderse totalmente del fondo
del tubo y ello se logra manteniendo el tubo en ngulo agudo, haciendo coincidir el
menisco del lquido con el borde del botn de clulas; si se agita el tubo suavemente el
lquido desprende fcilmente el botn. Cuando todas las clulas se han desprendido,
el tubo se debe inclinar hacia la posicin horizontal agitndolo suavemente para
obtener una suspensin uniforme de las clulas o el desplazamiento de los
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aglutinados. La agitacin fuerte rompe los aglutinados o dispersa las aglutinaciones

dbiles, induciendo a lecturas falsas negativas.
La intensidad o magnitud de la aglutinacin debe expresar en cruces (0 a 4+) y es
importante que todo el personal emplee el mismo sistema de lectura.

Controles
En la rutina de laboratorio, el
reactivo
de
antiglobulina
poliespecfico es el de uso general,
porque contiene combinadas la
actividad anti- IgG y anti-C3d,
ambas de relevante importancia en
clnica. La actividad anti-IgG
permite detectar la gran mayora de
anticuerpos que conducen a la
destruccin in vivo de los glbulos
rojos.
La
actividad
anticomplemento
permite detectar los componentes
del complemento fijados en la
membrana celular por efecto de la
reaccin
antgeno
anticuerpo,
pudiendo estar presentes tanto el
anticuerpo como el complemento.
En algunas ocasiones el anticuerpo
se escapa de la membrana durante el lavado pero queda fijado el complemento, que
es detectado mediante la actividad anti-C3d del reactivo.
Las normas de control de calidad en el banco de sangre establecen que el reactivo de
antiglobulina debe ser controlado diariamente, al igual que cada frasco que se abre.
Para ello se emplean las clulas de grupo O, D-positivo sensibilizadas con suero
diluido IgG anti-D.
Debe recordarse que la prdida de potencia del reactivo de antiglobulina, puede ser
causada por contaminacin inadvertida con suero humano o por conservacin
inadecuada del reactivo, razn por la cual, es importante chequear cada prueba de
antiglobulina que resulte negativa. Una prueba negativa en ausencia de controles
equivale a una prueba falsa negativa, es decir, una prueba mal hecha. Si las clulas
han sido lavadas en forma inadecuada el reactivo agregado se inactiva; si se ha
dejado un exceso de salina, el reactivo se diluye y la reaccin ser muy dbil o
negativa; y ser igualmente negativa si por cualquier razn se omiti la adicin del
suero antiglobulina.
Estas fallas se detectan agregando a la prueba negativa una gota de clulas control de
Coombs, recentrifugando y observando si hay o no aglutinacin. El uso del reactivo de
antiglobulina de color verde no substituye la prueba de clulas control de Coombs,

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pues el color solamente confirma que el reactivo fue agregado, pero no garantiza que
el procedimiento fue bien hecho y que el suero antiglobulina est activa.

CAUSAS DE ERROR
Son causa de resultados falsos negativos
1. Lavado incorrecto, porque conduce a inactivacin del reactivo.
2. Contaminacin con protenas, por ejemplo, cuando se tapa el tubo con el dedo
para mesclar o re suspender los eritrocitos.
3. Contaminacin del reactivo con suero humano.
4. Ereccin del anticuerpo durante el proceso de lavado.
5. Suspensin de clula, muy fuerte o muy dbil (mayor de 5% y menor de 2%).
6. Las clulas mal conservadas, hemolizadas, calentadas o envejecida, sufren
alteracin de los antgenos y perdida de la reactividad.
7. En el suero viejo, el calentamiento, la descongelacin repetidas, alteran la
actividad de los anticuerpos y del complemento.
8. El empleo del plasma interfiere con la actividad del complemento y conduce a
falsos negativos.
9. Anticuerpos que fijan complemento, este no se podr demostrar si el reactivo
de anti globulina poli especficos tiene escasas o ninguna actividad anti-C3d.
10. Incubacin inadecuada durante la fase de sensibilacion.
11. Perdida de clulas durante el lavado, cuando queda un botn celular
insuficientes para una lectura adecuada.
12. Omisin del reactivo de Coombs.
13. Retardo en agregar el reactivo de antiglobulina despus de terminado el lavado
(elucin del anticuerpo).
14. El exceso de salina residual despus del ltimo lavado, causa dilucin del
reactivo de antiglobulina.
15. Los movimientos violentos para desprender el botn de clulas del fondo del
tubo, producen la dispersin de los aglutinados dbiles e interpretacin errnea
de la lectura.

SON CAUSA DE RESULTADOS FALSOS POSITIVOS.

1. La contaminacin bacteriana de la muestra de sangre y de los reactivos.
2. Los glbulos rojos provenientes de pacientes spticos (activacin de
antgeno T, Coombs directo positivo).
3. La contaminacin de la SSF con slice coloidal proveniente de los
envases de vidrio donde este se almacena, igual problema se ha
sealado cuando se usan tubos rayados; o la contaminacin con iones
metlicos cuando la salina se conserva en envase de metal.
4. Los tubos de ensayo mal lavados contaminados con polvo, detergente y
otros materiales (sulfato de cobre).
5. Los reactivos de antiglobulina mal preparados, pueden contener trazas
de anticuerpos especie-especficos.
6. Las muestras de sangre coaguladas y refrigeradas provenientes de
personas con anticuerpos fros, pueden dar una prueba de Coombs
directo positiva por activacin del complemento. Ello se evita empleando
glbulos rojos de muestra tomadas con anticoagulante (ACD, CPD,
EDTA), que inactivan el complemento.

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PAPEL DEL COMPLEMENTO EN LA PRUEBA DE

ANTIGLOBULINA.
Los glbulos rojos pueden sensibilizarse con componentes del complemento sea in
vivo o in vitro, a travs de dos mecanismos principales:
1. Por efecto de anticuerpo que fijan complemento.
2. Por complejos inmunes presente en el plasma, los cuales de depositan sobre
los glbulos rojos y causan activacin no especifica del complemento, cuyos
componentes se fijan en el membrana eritrocitarias.
Cualquiera que sea mecanismo, el resultado es que los glbulos rojos se
sensibilizan con componentes de cascada del complemento, pudiendo llegar o no
a hemolisis. Si los glbulos rojos no se hemolizan, fracciones de componentes del
complemento quedan en su membrana, donde son detectados por el reactivo de
antiglobulina. Complemento solo, sin inmunologlobia, puede estar presentes en la
membrana del glbulo rojo en ci9ertas circunstancia, por ejemplo:
a) En presencia de anticuerpos fros IgM, que ocasionalmente sensibiliza los
glbulos rojos sin causar su aglutinacin, pero, como invariablemente estos
anticuerpos fijan complemento, este puede ser detectado mediante la prueba
de anti globulina. Debemos de recordar que una molcula de IgM puede fijar
cientos de molculas de C3.
b) Un 10% al 20% de las anemias hemolticas autoinmunes por anticuerpos
calientes, tiene la prueba de antiglobulina directa positiva directa positiva
(actividad anti-C3), sin demostrarse la presencia de inmunoglobulina IgG, Igm o
IgA en la membrana9. Si piensa que estos casos si existen IgG, pero en
cantidades tan pequeas que no es demostrable por el reactivo de
antiglobulina.
c) En el sndrome de anticuerpo fros, el anticuerpo IgM se fija a los glbulos rojos
cuando hay descenso de la temperatura a 30 0C, lo cual sucede en la piel y en
los sitios descubiertos. El anticuerpo unido a las clulas generalmente fija
complemento y si las condiciones son ptimas, se produce la hemolisis. Pero si
los glbulos rojos escapan al fenmeno hemoltico, ellos retornan a la
circulacin central donde la temperatura es de 370C. a esta temperatura, el
anticuerpo IgM usualmente de desprender de las clulas pero quedan los
componentes del complemento fijados firmemente, pudiendo ser detectados
por la prueba de anti globulina.