(QUIMICA DE LOS ALIMENTOS | R.E., and J. R. Whitaker (eds) (1982). Modification of Proteins, Food, onal and Pharmacological Aspects, Adv. in Chemistey series 1 o¢., Washington, D.C. F,, and J. J, Condon (eds.) (1982). Food Proteins, Applied Science Publishers, ondon. an, M. (ed.) (1977), Protein Crosslinking, A, Biochemical and Molecular Aspects Nutritional and Medical Consequences, Plenum Press, New York R. A. (ed.) (1980). Applied Protein Chemistry, Applied Science Publishers, Lon: , B. J. F, (ed.) (1982 end 1983). Developments in Food Proteins, vols, 1 and 2, pplied Science Publishers, London, "A. (ed.) (1979). Funetionality and Protein Structure, ACS Symposium series 92, m. Chem. Soc., Washington, D.C. ye, P. (ed) (1978). Biochemical Aspects of New Protein Food, 11th meeting EBS, vol. 44, Pergamon Press, Oxford. H W,, and A. F. Anglemier (eds.) (1964), Symposium on Foods: Proteins and reir Reactions, AVI Publishing Co., Westport, Conn, r, J. R,, and M. Fujimaki (eds.) (1980). 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Efectos de la temperatura sobr las enzimas: Efectos del pH sobre las enzimas idad del agua y actividad enzimatica Efectos de los electrolits y de la fuerza idnic Inactivacion de las enzimas por fuerzas de ci Efectos de la presién sobre las enzimas Efectos de las radiaciones jonizantes sobre la actividad enzimatica Tnactivacién de las enzimas en las interfases, stividad enzimatica Ia desnaturalizaciOn ¢ inact bre las enzimas ladura EO™mpO= + Direccion actual: Universidad de California-Davis, Davis, California. ity of Wisconsin-Madison, 4a 422 408 45 426 47 47 47 430 437 440 443 45 48 $51 451 467 468 an 43 43 474 475 ais416 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS X. Control de la accién de las enzimas A. Factores utiles en el control de la a B. Potenciacion de la actividad de las Co Control de las enzimas exdgenas Enzimas aNadidas a los alimentos durante el procesado Enzimas y microorganismos inmovilizados idad enzimatica as enddgenas A B C. Catepsinas D. Proteinasa neutra activada por el calcio E. Proceinas F G. H 1. ATPasa de la miosina J, Empardes K. Lipooxigenas: L. Peroxidasas M, Ascorbato oxidasa N. Enzimas antioxidantes ©. Enzimas del aroma P.Enzimas degradadoras XIV, Int A B c DB 9s enzimaticos E as de investigacion XY. Tecnologia del DNA recombinante e ingenieria genética ry B c. D. E logia de fos alimentos Quimica enzimatica, cintica y mecanismo Resolucién de problemas de cinética enaimatica INTRODUCCION Las enzimas son catalizadores complejos, ue, a temperaturas en tomo a 37 °C, aceleran la velocidad de las reacciones au ENZIMAS a7 107° respecto a la de las reacciones adores no enzimaticos usados ‘cas por un factor de En comparaci6n, los nes de magnitud menos ‘descomposicién del peréxido de hidrégeno catalizada por la catalasa llones de veces mas rdpidamente, a 37 °C, que si es catalizada por molécula de por segundo (Tabla ‘ma puede transformar hasta 600.000 moléculas de Actividades molares de algunas enzimas. ‘Moléculas trans. ‘Moléculas trans Jormadas (sec~! Formadas (sec ‘por molécula por moléeula Enzima de encima) Enzima de enzima) Anhidrasa carbénica 600.000 Lactasa 12.500 100.000 Lipooxigenasa 3.000 20,000 2.000 Ureasa 8.000 700 Fuente: Datos dela Ref 14, Las actividades cataliticas de enzimas andlogas varian con la especie de proceden- poral, las enzimas endégenas se han adaptado a operar eficazmente a las bajas tem- peras del ambiente. En general, existe una relacién inversa entre las actividades mola- res de las enzimas y la temperatura a la cual han adaptado su funcionamiento. Por ejemplo, las enzimas termostables del conejo poseen una actividad molar ms baja, en condiciones comparables, que la de las enzimas andlogas del halibut (155). Es la eficacia cataitica de las enzimas a baja temperatura lo que los hace impor- tantes para el tecnélogo de los alimentos. Ello representa que los alimentos pueden ser procesados 0 modificados mediante enzimas a una temperatura moderada, del orden de 25-50 °C, ala que, de otro modo, los alimentos sufririan cambios slo len- tamente, Sin embargo, también representa que las enzimas enddgenas son asimismo activas en estas condiciones, lo que puede ser beneficioso 0 nocivo. El mantenimien- to de las actividades enzimaticas en los vegetales tas la recoleccidn o en los animales Postmortem tiene profundos efectos sobre la calidad de los alimentos (144). Ademas, la tremenda capacidad catalitica de las enzimas es conscuencia de la reduccién en Ja energia de activacion de las reacciones en que intervienen. Las bajas energias de activacién de las reacciones enziméticas indican que una reduccién de la temperatura tiene relativamente poco efecto sobre las velocidades de reaccién. En consecuencia, las enzimas pueden ser bastante activas incluso a temperaturas de congelacién y re- sultar, por ello, importantes estimulantes de las reacciones degradativas en los ali- ‘mentos refrigerados 0 congelados (168). Por supuesto, uno de los fines del tratamiento térmico es desnaturalizar ¢ inacti- var las enzimas, de tal modo que los alimentos no se encuentren sujetos a su continua418, QUIMICA DE LOS ALIMENTOS actividad. Por tanto, el experto en alimentos debe tener conocimiento de los fenéme- nos de desnaturalizacién para procesar los productos alimenticios adecuadamente. (Otra caracteristica importante de las enzimas, ademds de su poder catalitico, es su especificidad. Los catalizadoresindustriales no poseen esta especificidad de reac- de un enlace determinado o de un Jo que permite a los expertos en ‘como tna caracteristica de las en- a. Como veremos, el control de los procesos bioquimicos de las enzimas asociadas con los diversos componentes memt- branosos de un tejido puede tener profundos efectos en la regulacién de los procesos vitales, asi como en definir la calidad de los alimentos durante su procesado y alma- cenamiento tras la recoleccién 0 postmortem, En general, el experto en alimentos debe esforzarse en lograr un conocimiento suficiente de la enzimolog{a alimentaria y de la cinética enziméti cio entre el ingeniero, que usa sofisticados conceptos mateméticos para disefar los reactores y procesos enziméticos, y el enzimélogo, que emplea métodos cada vez mas complejos para estudiar los mecanismos de la accién enzimatica. La aparicién de las cenzimas inmovilizadas y su uso en reactores para el tratamiento de alimentos y la ten- dencia hacia métodos de elaboracién continuos exigen que el experto en alimentos trabaje cada vez mas estrechamente con ie en alimentos que posea un buen conocimiento fundamental de los mecanismos de las reacciones enziméticas puede utilizar enzimas para llevar a cabo las funciones de- seadas en tratamientos y andlisis y para fi conversién de las materias primas en alimentos de mayor calidad y mas apetecibles. Asi pues, las enzimas tienen una enorme importancia para el especialista en ali- mentos. Este capi fenta introducir algunos conceptos basicos de la enzimologia alimentaria, Trata de proporcionar al lector una base suficiente para que pueda con- tinuar profundizando en el conocimiento de la enzimologia aplicada a los alimentos, ‘més detalladamente descrita en los libros de Schwimmer (144), Redd (133) y Whita- ker (183). Son también ities algunos textos derivados de simposios de areas especia- 124, 184), Pueden encontrarse excelentes torios sobre la quimica, cinética y mecanimos de las enzimas recientes y monografias (46, 54, Para un enfoque bio-orgénico iecanismos enziméticos, pueden consultar los textos de Dugas y Penny (40) y de Walsh (180), ‘Como ayuda para un mejor conocimiento de la cinética enzimética, los estudian- tes sin experiencia previa en este campo deberfan adquirir los cuadernos programa- dos, relativamente simples, de Christensen y Palmer (27) y de Tribe y col. (173) y, en una fase posterior, resolver los problemas presentados en los textos, més compli- cados, de Segel (146) y Montgomery y Swenson (116) ENZIMA 419 I, NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS EI numero de enzimas aisladas y caracterizadas ha aumentado a un enorme rit- tuy6 una Comision de Nomenclatura y Cla- sifieacin de Enzimas para que preparase un sistema de denominacién, que do a ser de uso comiin y debe ser utilizado en los trabajos enzimol6gicos (47). ‘A cada enzima se le asigna un ntimero de cédigo de cuatro nlimeros, separados por puntos y dispuestos de acuerdo con los siguientes pri . El primer numero indica la clase basica en la que se encuadra la er ferasas, () hidrolasas, (d) liasas, (e) isomerasas y (f) ligasas. El segundo 1 su subclase, que identifica a la enzima en términos mas especificos. El tercero (sub- subclase) define exactamente el tipo de actividad enzimatica de que se \imero de serie de la enzima dentro de su sub-subclase. Por tanto, los tres cl cuarto enzima numerado en esta serie particular. Ademds del niimero de eédigo, ‘a cada enzima se la asigna un nombre sistemitico, que en muchos casos es demasido incdmodo para ser usado rutinariamente, Por ello, recomienda también un nom- bre comiin para uso ordinario, EI nombre comin es suficientemente corto para un uso general, pero no necesariamente muy exacto o sistem: casos es el que suele usarse. La Unién Internacional de Biog tura y Clasificacién de Enzimas (47) catalog6 mas de dos mil en la edicién de 1978. Fuera de las enzimas implicadas en lafisiologia postmortem o tras la recoleccién, ppocas de las catalogadas son de interés directo para el esp Con ‘mucho, el grupo de enzimas mAs utilizado en el tratamiento de alimentos es el de las hidrolasas. Se emplean también unas pocas oxidorreductasas ¢isomerasas, pero es postmortem 0 tras la reco- en alimentos esta muy interesado en controlar las reacciones DEFINICIONES DE ALGUNOS TERMINOS UTILIZADOS. EN ENZIMOLOGIA (60, 144, 180) 1, Enzimas, Proteinas que catalizan reacciones bioldgicas especificas con extraor- ria eficacia. 2, Isozimas (isoenzimas). Formas de la misma enzima derivadas de diferencias de origen genético en su secuencia aminoacidica primaria. Las variantes de otro rigen deben ser llamadas «formas mi Los artefactos, tales como los productos enziméticamente activos de parcial de una enzima du-420 10. QUIMICA DE LOS ALIMENTOS rante el manejo y almacenamiento del m jolSgico, no deben ser citados como isoenzimas. Centro activo. La porcién de una molécula enzimatica en la que se fija el sus- trato y el lugar donde ocurre la reaccién, inas. (b) Pequenas moléculas snicas asociadas con el centro activo, pero no conocidas como vitaminas. organicos débilmente asociados con la enzima o que actiian como jo de la enzima (cuando ésta puede hallarse en dos reacciones metabélicas. (d) Iones inorgénicos, aniones © sirven como activadores. ibidores de la actividad enzimética que propiedades cinéticas de las enzimas oligoméricas © monoméricas. Laadicién de un sustrato u otro ligando que inhibe o activa a la enzima puede dar por resultado cambios conformacionales en la enzima o en las subunidades enziméticas. Esto, a su vez, altera la adici6n de sustrato a los puntos de fijacién vacantes 0 la velocidad de formacién de productos en los‘centros activos oct- ados. Su compleja cinética produce a menudo curvas sigmoidales al represen- tar la velocidad en funcién de la concentracién de sustrato. Cinética enzimética. Comprende el estudio de los parémetros que influencian la velocidad de las reacciones quit das por enzimas y ién de los datos en términos de los mecanismos moleculares posibles. La ciné- a de estado estacionario, que abarca desd i de estado estacionario. Es la cinética tipificada por la ecuacién de Menten. La enzima se combina con el sustrato para formar un com- plejo, que se descompone luego para dar el producto y la enzima libre, capaz de entrar en otfo ciclo catalitico. Cambio esténdar en energia libre (.2 G*). El valor de G (cambio en energia re) a una concentracion de 1 M de cada reaccionante y a una presién de la temperatura no se especifica). Para una reaccién dada en condiciones estindar, el valor de a G® para la conversidn de sustrato a producto es constan- te y determina, por tanto, el punto de equilibrio para esa reaccién. Un proceso. cspontaneo en funcionat bre (— 4 G*) hasta que alcanza un valor minimo (eq = 0. La velocidad de una reac- moléculas (basado jue puede (a) regresar al estado original (no hay reaccién) lernamente para formar nuevos enlaces y productos (véase teoria del estado de transicidn, es re (a G*) necesaria para evar un mol de moléculas ( zcla de reaceiOn hasta el estado de transicién (para su convers to}; se expresa en calorias (0 julios) 0 kilocalorias (0 kilojulios) por mol (k3/mol), Las enzimas y otros catalizadores actian rebajando esta barrera pi cin, pero no alteran el punto de equilibrio. Luego es crucial distinguir entre 4G" en Ia definicién 8, que determina el equilibrio de una reaccién, y 4 G*, ENZIMAS, 2 que define la velocidad a la que se alcanzard el equi ase la Fig. 1 y la discusién de la seccién I ivaci6n (E,) derivada de la ecua- Energla libre (p Gace \ resin CCooraenaca ae reaccion Figura 1, Diagrama de energia, mostrando la reduccidn de a energa ibe de activacin (a G*) cuando en la reaccién interviene un cataizado. IV, ESPECIFICIDAD, CATALISIS Y REGULACION res se deduce que las dos caracteristicas sobresalientes de las enzimas son la aceleracién de las velocidades de reaccidn (sin afectar a su equi- especificidad de accién. El mecanismo que se esconde detras de estas dos ‘as principales de las enzimas ha ocupada a los enzimélogos durante dé- ccadas y es todavia incompletamente comprendido, Hay, sin embargo, una cierta logi- ca en las secuencias de las reacciones enzimaticas (180) y, como en cualquier serie de eventos, existen factores que controlan la velocidad. Dado que las enzimas pueden actuar como reguladoras y también pueden ser reguladas, este aspecto de logia y sus relaciones con los alimentos es considerado aqui una caractet (50, 144) id de las enzimas los diferencia de los catalizadores no biolégicos, Las enzimas muestran varios grados de especificidad, a saber:422 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS |. Baja especificidad. La enzima no discrimina entre sustratos, sino que se mues- tra especifica dnicamente para el enlace a atacar. 2. Especificidad de grupo. La enzima es especifica para un enlace quimico parti- cular adyacente a un grupo determinado. Por ejemp! ipsina es especifica para los enlaces péptido en el lado carboxilo de la arginina y la lisina, 3, Especificidad absoluta. La enzima slo ataca a un sustrato y cataliza sélo una falible y completa estereoespecificidad en la catalisis y pueden distinguir entre isémetos dpticos 0 geométricos. Casi siempre usan una sola forma de un par enantiomérico, salvo cuando su funcién especifica es catalizar la isomerizacién de enantidmeros. Las etizimas se comportan como catalizadores esteroespecifi- 0s porque son agentes asimétricos o quirales, formados tnicamente de L- aminofcidos. Recuérdese de la quimica orgdnica que una molécula que conten- ga un centro asimétrico (quiral) puede D-o Leaminoscidos) con propiedades fi Un concepto similar puede ser utilizado, en general, para explicar la estereoes- Pecificidad de las enzimas. Cuando una enzima quiral interacciona con cada eéricos. Estos tienen diferentes energias y reactividades y particiones distintas entre reaccionantes y productos. Luego, las diferencias en propiedades fisicas entre los complejos de transicién diestereoméricos favorecen la reaccién de uno de los enantiémeros con la enzima. rales de las enzimas puede formar combinaciones imensional de tales enzimas y ca jcas de un modo muy especifico idad de las enzimas es muy importante en el procesado de alimet donde a menudo es deseable modificar s6lo un componente determinado. En en las cadenas aminoacidicas casi ilimitadas en la matriz de alimentos, la exactitud de un método enzimético es dependiente de su especificidad, B. CATALISIS (60, 144, 180) En general, la cat cién de su energia de a se caracteriza por f Es import ENZIMAS. 423 cia termodinémica a que una reaccién tenga lugar y la velocidad actual acumula el producto. Las concentraciones de equilibrio del producto y el st ‘tan determinadas por la diferencia en energia libre (a G° = —RT In kKEq) te entre ellos. A una temperatura dada R y T son constantes, por lo que & G® es depen- diente tinicamente de In kEq, que es igual a (producto)/(sustrato). Como se observa en la Figura 1, el valor de 4 G* para la reaccién es negativo si el producto es mas estable que el sustrato. Considérese un caso hiporético (180) en el que la diferencia en a G® para la conversién de un sustrato a producto sea —2,8 kcal/' kJ/mol. Por tanto, a 30°C, =RT In kEq = kEq = 100 a Al equilibrio quimico, hay 100 moléculas de producto por cada molécula de sustrato. Asimismo, si se comparan dos reacciones posibles en las que la relacién molar de equilibrio es 100 para la primera y 1.000 para la segunda, es evidente que a G° para la segunda reaccién es (a) mas negativa y (b) en este caso, mas negativa por un factor de 3/2 (In 1.000/In 100). Por tanto, un valor de a G® ligeramente mas negativo para una reaccién que para otra a la misma temperatura determina un aumento sus- tancial en el punto de equilibrio quimico para la formacién del producto. Est de informacién es util cuando se consideran reacciones enziméticas acopladas y defi- ne la magnitud relativa de cada una de ellas en el sistema. ‘Sin embargo, la vetocidad a la que tiene lugar la conversién del sustrato en pro- ducto, una medida de la labilidad cinésica de las moléculas de sust dliente de 4 G®. Una molécula puede ser termodindmicamente inestable Para su conversién en producto es neg la barrera energética para la reaccién ( a G*) es suficientemente alta (Fig. 1). En la mayor parte de las reacciones q iza calor para sobrepasar esta barrera encrgética de activacién). Los catalizadores heterogéneos (por ej., cuando se usa un de niquel para hidrogenar accites vegetales) probablemente reducen a G* casi exclusivamente mediante una estabilizacién selectiva del estado de transicidn (apro- ximando a los reaccionantes en una yuxtaposicién favorable sobre la superficie del izador). Las enzimas, sin embargo, emplean un gran miimero de efectos interre- mnados para reducir la energia de activacién (4 G*) de una reaccién (144, 180), Como una reaccién quimica simple se desarrolla a lo largo de la coordenada de i unto més alto de la curva de energia libre representa su estado de transi- Los catalizadores quimicos (por ej., un catalizador metélico de paladio 'acién de una olefina) probablemente reducen a G* casi exclusivamen- te por estabilizacién selectiva del estado de transicién (Fig, 1). En cambio, los catali- zadores enziméticos también reducen a G*, pero lo hacen reemplazando una gran barrera de activacién por miliples barreras mas bajas con-un pequefio a G* global (180, 183). El estado de transicién es una entidad efimera, que se mantiene tal vez424 (QUIMICA DE LOS ALIMENTOS durante una sola vibracién molécular (~ 10~" see) y se descompone luego para for- ‘mar, 0 bien de nuevo los reaccionantes con los que se supone se encuentra en equili brio, o bien productos, La teoria del estado, de transicién se discute con mayor detalle y se compara con Ja ecuacién de Arrhenius en la Seccién X. Una versién simplificada de la teoria del estado de transicién para las velocidades de reaccidn relaciona la velocidad de una reaccién con la magnitud de » G* mediante la siguiente expresin exponencial (180) = RT pacer Q) oon = Gy one en la que n es el niimero de Avogadro y h la constante de Plank. Las moléculas de sustrato que disponen de una energia cinética a G* pueden saltar la barrera hacia productos. La reduccién de « G* incrementa grandemente la velocidad de reacci6n (ku) dado que ésta depende exponencialmente de 4 G*, La descomposicion del 11262 a 20 °C constituye un ejemplo especifico. La enerpia libre de activacién, G*, El aumento de velocidad conseguido por la ino respecto a la reaccién en ausencia de catalizador equivale a ir, 5,7 x 10? veces, y el que se logra mediante el uso de ca- talasa es (e784)/(e24), 1,7 x 10. Puede comprobarse que, en efecto, el incre- mento de velocidad esta en relacién inversa a a G*, C. Regulacién de los procesos enzimaticos, estrechamente de meses durante el almacenamiento, io tiende a desplazarse hacia un catabo- 's animales, o gradualmente, a I mo en muchos tejidos vegetales. El eq de las caracteristicas de productos alimenticios tales como frutas y legumbres someti- das a almacenamiento, carnes y quesos, son el resultado del control (consciente 0 m0) de estos procesos. Asi pues, las actividades de las enzimas end6genas y exdgenas (afadidas durante ‘el procesado o procedentes de contaminacién microbiana) pueden desempefar un im- te p te su tratamiento y almacenami alcanzado por el cientifico en regular los procesos enziméticos tiene un marcado efecto sobre-la calidad e inclu- so la cantidad (evitando su alteracién) de alimentos que legan al consumidor. Hay ENzIMAS 42s muchos ejemplos de control de la calidad de los alimentos en los que una enzima es cl agente regulador o regulado (144), Uno de los principales determinantes en la regulacién de las reacciones enzimati- ceas endégenas es la integridad de las células y tejidos, es decir, la normal compart ‘mentalizacién de las enzimas en las particulas u orgdnulos celulares. Cuando se pier- dea integridad de los orgénulos (por e}., muerte de las células animales, envejeci- miento de las células vegetales tras la recoleccién o ruptura de las células durante el procesado) la actividad enzimética puede tener lugar de un modo incontrolado, V. COMPARTIMENTALIZACION DE LAS ENZIMAS EN LOS SISTEMAS CELULARES Para la discusién que sigue sobre compartimentalizacién de las enzimas, es ttl para el lector revisar las estructuras celulares que presenta la Figura 8 del Capit 15, Con el tiempo, ha llegado a ser ev i compartimentalizados tanto a nivel subcelular como cin de Las enzimas entre las particulas subcelulares y los tejidos de las plantas y ani- ‘males posee una gran importancia para la ciencia de los alimentos (143, 144). En general, el mantenimiento o destruccién de la integridad de la localizacién de ante en los alimentos por varias razones, La maduracién de los vegetal es una secuencia dindmica e integrada de sucesos biogui- En consecuencia, para asegurar una maduracién adecuada es preciso que se ‘mantenga la integridad del tejido vegetal. Dado que la mayor parte de la fruta se re- colecta cuando aiin no esta completamente madura, para obtener una calidad acep- table debe tener lugar todavia una amplia variedad de cambios inducidos enzimatica- ). Por ejemplo, la pérdida de algunos pigmentos y la ganancia en otros, la acumulacién de azicares, el ablandamiento y la biosintesis de los components del aroma, deben ocurrir de un modo que requiere la integridad bioquimica del ali- mento (80). algunos casos, el especialista en alimentos ha aprendido a controlar estos cam- bioquimicos integrados para obtener productos mejores y mas abundantes. El Imacenamiento de frutas y legumbres en atmésferas controladas, por ejemplo, regu- la el ritmo del metabolismo de algunas frutas (especialmente manzanas y peras) y permite prolongar su almacenamiento (50). Otro ejemplo de control enziméti el envejecimiento acelerado de la carme (actividad hidrolasa incrementada) me exposicin a temperaturas més altas de lo normal y a radiacién ultravioleta para con- trolar el crecimiento microbiano en la superficie (proceso Tenderay) (87). Durante el procesado de los alimentos se produce frecuentemente la ruptura de ridad celular y enzimética, Schwimmer (143) postula la tesis de que «la tecno- de los alimentos puede ser considerado como el arte y la ciencia de la promo- ‘én, control y/o prevencién de la ruptura celular y sus consecuencias metabdlicas, en el momento adecuado y en el lugar adecuado de la cadena de procesado». Por supuesto, la ruptura celular va acompafiada de la liberacién de las enzimas, lo que Puede ser beneficioso 0 nocivo. Por ejemplo, la interaccién de las enzimas liberadas426 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS con sustratos que no les sor ifenoloxidasa, que se co ‘de pardeamiento enzim: pero indeseable en frutas y verdu- Seccién X se presenta una lista de métodos a utilizar objetiva de la frescura. Asi, las actividades enzimaticas pueden ser usa- inguir el pescado fresco del congelado y para medir su grado d 32a). Estos pocos ejemplos dan algunas indicaciones de por qué el conocimiento que implica una asociacién reversible de las enzimas con las membranas como mecanismo de control metabélico. Algunas enzimas son caract ‘embargo, otras se encuentran en todos ellos. Aunque estas catalizar la misma reaccién en distintas localizaciones subcelulares 0 tisulares, pue- den diferir en sus estructuras primaria, secundaria, teci i jeas de un orgaénulo subcelular determinado; sin tinto modo a los efectores alostéricos. El significado bucién en los tejidos alimenticios esta siendo cor anaerobia celular ( ras que las que catalizan Ia oxi- Embden-Meyerhof) se encuentran en el ENZIMAS 427 dacién de los sustratos via el ciclo de los dcidos tricarboxilicos estén compart - lizadas en las mitocondrias. Puede encor discusién detallada de la distri- bucién y latencia de las enzimas a nivel subcelular en (138), entre otros. B._Distribucién de las enzimas en los alimentos es a menudo oscuro; sin em- bargo, en ocasiones puede afec' 108 de procesado y al tipo de pro- ducto obtenido, Por ejemplo, en la preparacién de queso azul, se separa primero la nata de la le- che descremad: La distribucién de las er claramente que la compartimental ductos alimenticios (138). ‘enzimas es caracteristica de los pr ‘VI. CINETICA DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS (54, 146, 182) A. Cinética de estado estactonario El esquema mas simple para representar cinéticamente una reaccién enzimatica es ky ky E+S=2 ES = P+E 2) ky ke en el que E designa a la enzi rato; ES, al complejo enzima-sustrato; P, al producto de la reaccién enzimét 11 ka, ks y ka, a las constantes de velocidad de cada una de las etapas de la reacci6n global. La piedra angular del esquema es la formacién de complejo en: ‘menudo denominado complejo de Mi cchaelis por haber sido Michaelis y Menten quienes primero postularon su existencia. La velocidad de formacién del producto viene dada por Durante la etapa incial de una reaccién enzimética tipica, la concentracién de pro- dueto es esencialmente cero, Luego 4 =k3lES) 6428 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS donde v es la velocidad de formacién del producto, a la que suele denominarse velo- cidad de Michaelis-Menten. La concentracién del complejo enzima-sustrato es cialmente cero, pero répidamente alcanza un nivel m ¢s mucho mayor que la de enzima ( : En un instante dado [ES] es aproximadamente constante, por lo que podemos acep- tar que existen condiciones de estado estacionario, Por tanto L =k, (£][S] ~kp1ES] ~kg IES) =o ) it Reordenando esta ecuacin, se obtiene teyis) _ Kat ks (Es) iy “Ky en la que K,, es la constante de Michaelis. Por definicidn, la constante de disoc cin para el complejo enzima-sustrato (K,) es igual a ka/ks. Obsérvese que Ky, ¢5 = que K, y que ambas constantes slo seran iguales si ks es cero (0 tiene un valor tan bajo respecto a ky que kz + ks ~ ka). La concentracién total de enzima [Es] viene dada por (Ep) = (£1 + (ES) (8) Combinando las ecuaciones (7) y (8), obtenemos: L918] Kn tl La Velocidad de Michaelis-Menten seré [Ec [es] = (9) v= k3IEj im +51) Puede obtenerse v experimentalmente de la pendiente de una curva de progreso, i ‘en funcién del tiempo de reac- ‘que transcurre una reaccién enzimiética, la linea de progreso ea, Esto quiere decir que la velocidad de formacién del pro- ducto desciende durante el curso de la reaccién, a causa de la deple Notese que en la Ec. (10) v se hace mds pequeia a medida que inuye. Existen otras razones para que v descienda a 10 largo del tiempo. Dado que las reacciones ‘enziméticas son reversibles, Ec. (3), su funcionamiento en el sentido inverso va cre- ciendo en importancia al progresar la reaccién ¢ irse acumulando el producto. Por ‘otra parte el producto de la rea ibira Ia enzima. Se acostumbra a to- ‘mar como valor de curva de progreso. Si se obtienen valo- res de vo (velocidad rentes concentraciones de sustrato y se representan ENZIMAS, 429 TENPO Curva de progreso de una reaceién enzima curva en el momento en cuestiOn) decrece a medida que esta transcurre. (Reconstrui- ia Ref. 183), luego frente a muestra la Fig 4 las concentraciones bajas de sustrato y de forma menos acusada cuanto més altas sean éstas. Cuando [S] >> K,, la velocidad de Michaelis-Menten alcanza un valor VELOCIDAD INIGIAL ol = OK CONCENTRACION DE SUSTRATO sncidn de la concentracién de sustra- ruida de la Ref. 183). Figura 3. Representacién dela velocidad ini to, [S), para una reaccién enzimatica tpica. (Rec430 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS maximo, al que se denomina Vina. Decimos entonces que E se encuentra saturado de S. Como norma general, una concentracién de S 20 veces mayor que Ky, se consi- dera suficiente para obtener un aproximacién valida de Vina. En estas condiciones el denominador de la Ec. (10) es aproximadamente igual a [S], puesto que el valor de K,, puede ser ignorado. Los términos [S] en el numerador y el denominador anulan, ¥ la Ec. (10) se transforma en v= k3lEg] "Vinx ay ‘Se comprucba en esta ecuacidn que Vana, ¢s independiente de [S}, es decir, que la reaccidn es de orden cero con respecto al sustrato. Por otra parte, Vina ¢s de pri- ‘mer orden con respecto a E. El término Vieax€s tam| a Kp, el término v se hace igual a Vingy/2. El valor de la constant - presa, por tanto, la concentracién de sustrato necesaria para semisaturar a la enzima, Si Ky, es grande, se precisa una gran cantidad de S para saturar E; si Ke, ¢s pequeta, basta una pequena cantidad de $ para saturar E. La mayoria de las reacciones enzi- ‘miticas que utilizan sustratos no muy complejos muestran valores de K,, entre 10~* y 07M, Los dos pardmetros mas importantes en la teoria de Michaelis-Menten son Ky, y Ving- Suelen determinarse por la representacién de Lineweaver-Burk. Si tomamos la inversa de la Ec. (10), obtenemos L_ Km vy, «zy que, al representar 1/v en funcién de 1/{S} en la que el punto de interseccién en el el eje horizont es igual a Ky, sponde a la ecuacién de una recta la interseccién con ferseccién con «> tra muy bien graficamente el significado de Ky ¥ Vis B. Cinética de Ia inhibiclon enzimética (46, 146) Un inhibidor es cualquier compuesto que reduzca la velocidad de una reaccién ‘enzimética. En la inhibicién enzimética, una molécula de inhibidor reacciona con la cenzima, el complejo enzima-sustrato 0 con ambos, dando lugar a cambios en el valor ENZIMAS 431 sl) . oe pwoves ” Unnos MIN easxion® be vaniot— reaxio-2 tooxien$ 60 oxo 6 asxo-2 lasxion$ ra szaxo-2 ae exo4 — az0x0-2 287 sxiot — arsxo-2 308 ano — s25x0-2 262 so — 276xo-2 44s axwt — 225x0-2 sre ixo4 —1.75x0-2 667 osx —1S0x0-2 a 5 INTERSECCION = @ / \NTERSECCION = shane \ 34 snes genzswos \ Fo wizsn0-2 —. “a 102 vnor* apts Vinex = 89» MOLESTLTAO MIN zaxio* 200-5 =o -§ 4 2 60 ¢ 4 6 8 Dw V[s] ub 4 Figura 4. Representacién doblemente inversa (Linewever-Burk) de 1/v en funcién de para una reaccién enzimatica. (Reconstruida dela Re. 146, por cortesia de John Wiley and Si Ite de Ky, de Vinax 0 de las dos. Decimos entonces qui 1a. Sila molécula del inhibidor reacciona con E, la inhibicién se denomina com- a; si con ES, acompet lo hace con E y con ES, nocompetitiva. Cada luna de estas formas de inhibicién es reversible: si se retira el inhibidor, se recupera 4a actividad enzimatica. Sin embargo, hay también inhibidores irreversibles. En estos jor en exceso la enzima no vuelve a ser reactiva. Los metales Pesadlos, tales como el mercuric, son buenos ejemplos de inhibidores irreversibles. La discusion que se expone a continuacién se centra en las formas reversibles de inhibici6n. enzima se encuentra432 (QUIMICA DE LOS ALIMENTOS sn del producto, son validas, independientemente del tipo de ir ion ‘que se trate. a oe 1. Inhibicién compettiva Cuando la inhibicién es competitiva, ademas pease peti jemas del mecanismo de reaccién (3) Kip EHS el 1, El al complejo enzima-inhibidor y Kye tamente, la constante de disociacién para aa) Ls conentrain otal de enzina yu no viene dade no vi por la ecuacién (8), porque ha de considerarse también El. Sera ahora bial t } = [E] + (ES) + [EI] ‘Combinando las ecuaciones y@, Es} = tes) sl a6 en la que Kj es la constante de Michaclis aparente, igual a cxf) La ecuacién (5) para la velocidad de Michaelis-Menten toma ahora la forma = Malt ky tis] (as) Puede observarse que la constante de Michs competitive. La molécul [ENZIMAS a cl término Ki, tendré un valor numérico mas alto que Ky. En cambio, el término que es igual a k; (Es), no se ve afectado, salvo en que se nevesitardn concen- traclones de sustrato mds clevadas para saturar a E, El valot de Ky, puede ser obtenido con la ayuda de representaciones de Linewewer-Burk en presencia y en ausencia de I. El de Ky puede determinarse de fas ardficas de este tipo utilizando los datos obtenidos en ausencia de Ty el de Ks Tos obtenidos ‘de inhibidor. Como el valor de Vy no resulta mo- inhibidor competitivo, las lineas de las gréficas de Lineweaver-Burk {endrdn todas el mismo punto de interseccién con el eje de ordenadas, cualquiera que sana concentracién de inhibidor a que corresponden. La Figura $ muestra una de satus prificas a diferentes valores de (I). Una ver determinados los valores de V, ‘de Kip puede calcularse de la Ec. (17) si se conoce el de (D. Es pos Ky. conocida K’, para un solo valor de [I]. Sin embargo, se producen fnenos errores si se obtiene K;, a una serie de concentraciones de inhibidor y se re- presenta Ki, en funcién de (I, segtn la Ex (17) La pendiente de esta grifica es igual 1 Koo/Kye ¥ la interseccion en el eje de abscisas a —Kre. ). Inbibicién acompetitiva tendremos Ms) Figura $._ Inhibicién competitiva en una representaciGn de Lineweaver-Burk. Cada linea co- rresponde a fos valores de I/¥ a varias concentraciones deustrato y una {I}, (Reconstruida de Ref. 46). ‘434 ‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Kip Et 2er c donde ESI es un complejo formado por la interaccidn entre ES ¢ Ly Ks tante de inhibicién, que es la constante d 20) La concentracién total de enzima es (£9) = (6) + [ESI + (est) ‘Combinando las ecuaciones (20) y (21) con la Ec. (7), se demuestra que (ES) es (2 03) an es i que Ks solamente con ES, su presencia arrastra a E hacia S Vinax Vimaxs Ya que I inter- fiere con ES. La concentracién de ES determina la velocidad de la reaccién segdn la Ec, Como, en la inhibiciSn acomp: smagnitud por 1, las reprsentaciones de Lineweaver-Burk en prese sala obtenida en su ausencia, En la Figura 6 se muestra una réfia de este tipo a diferentes valores de (I). La interseccién vertical de cada Iinea en presencia de ENZIMAS 435 igual a 1/Vigas para la concentracién correspondiente de inhibidor. Si tomamos inversa de la Ec. (24), tendremos que (26) Esta ecuacién indica que si tomamos la inteseccion en ordenadas de varias rectas de una grafica de Lineweaver-Burk y las representamos en funcién de los valores de [i] correspondientes, obtendremos una recta cuya pendiente ¢s 1/VnaxKies. Su inter- sevcidn vertical sera 1/Vagx y el cociente entre ésta y la pendiente valdré Kies _tsan, Flew 6, Representacin de Linewester-Burk pra una inhibickn acomptitve. (Revonsrida de Ref, 46), 3. Cinética de la inhibicién nocompetit itiva el inhibidor se combina con E y con ES. Luego, son también operativas las reacciones (13) y (19). Es de suponer que exista un equilibrio entre El y ESI. Sin embargo, las ecuaciones (14), ue define Kye y (20), que define Kyzs, son todavia validas. La concentracién total de enzima es ahora igual a (Fp) = [E] + (ES) + (E4) + [Est] en Si se combinan las Ee. (14), (20), (27) y (7), puede obtenerse la siguiente para (ES): (28)436 ‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS ién no competitiva «simple»; cuan- lenominamos K, a la constante de inhibi- nsforma en 29) 0) en la que Vina, Viene dada por la Ec. (24), substituyendo Kixs por Ky. El valor de Ky puede ser obtenido por el mismo procedimiento utiizado para determinar Kips en la inhibicién acompetitiva in nocompetitiva simple Kj, no se ve afectado, mientras que Visas dismuye. Esto quiere decir que las representaciones de Lineweaver-Burk darn rectas ; 10) permite derivar las fSrmulas que describen la inhibicién mixta, Se observa en ellas que si Kies > Kip, las representaciones de Lineweaver-Burk convergen por encima de! eje horizontal, con la consecuencia de que Figura 7. Representacién de Lineweaver-Burk para una inhibicién nocomy ="Kies). (Reconstruida de Ref. 46). tva simple (Ke, ENZIMAS 437 la constante de Michaelis aparente aumenta con la adicion de I. Si Kyzs < Kyp, con- vergen por debajo de! referido ¢je, indicando que la constante de Michaelis aparente disminuye con la adicién de I. En todos los casos de inhibicidn nocompetitiva, la incorporacién del inhibidor al sistema provoca un descenso del valor aparente de Von La Tabla 2 resume los efectos de I sobre K,, ¥ Vix en cada uno de los tipos de inhibicién discutidos aqui. ‘Tabla 2._Casactersticas de los diferentes tipos de inhibicién enzimatica reversible I Efecto Efecto sobre bidor se ‘aparente Bfecio las graficas combina ‘sobre aparene de 1/V. con Vas sobre Ky frente a 1S) E Ninguno ‘Aumenta Convergencia sobre el eje de ondenadas ES Disminuye __Disminuye _Receas paraletas Eyes Convergencia Disminuye Ninguno Disminuye Disminuye uence: Ret. 46 G Cinética de enzimas inmovilizadas (192) La cinética enzimética ha sido disehada basicamente para reacciones en disolu- ién, en las que la enzima y el sustrato se encuentran en libertad para moverse desor- > Ky, La velocidad de Michaelis-Menten es entonces i faass que e8 funcidn de [Eg], pero no de La pendiente inicial de la curva de progreso equivale, Por tanto, a Vix y para un valor dado de [Fo], es constante, Si se obtienen curvas de progreso a diferentes valores de [Ea], las pendientes ini- ciales de cada curva pueden ser representadas frente a los correspondientes valores ara obtener tna curva patron para la determinacién de actividad enzimaética Las curvas que relacionan la velocidad de formacién del producto’ con la concentracién de enzima son especialmente iitiles en su tramo lineal, En éste la pen- dente es constante, de modo que444 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Tiempo ae incubacién fempo a diferentes Figura 9. _Andlisis enziméticos. Formacién del producto a lo largo di ey Fao = constante as) ie, ~consan donde vo ¢5 la velocidad inicial de formacion del producto. La ecuacién (48) indica ue vo es proporcional a (Fal. Siendo vo constante para un valor dado de [Eo], y dado que vo se expresa en unidades de tiempo, Ia Ec. (43) leva a tlk] =C (46) en la que C es una constante. El producto de la concentracién de enzima por el tiem- es constante cuando en la determinacién de la actividad enzimética se cumplen las condiciones expuestas anteriormente, ‘Al determinar la actividad catalitica de una enzima, deben observarse las siguien- tes normas: . Es preferible medir las velocidades continuo. 2. Aunque no es imprescindible qué les empleando técnicas de seguimiento | Sustrato se encuentre en exceso respecto a Kp, las determinaciones de las enzimas suelen efectuarse con [S] 20 veces Ky. Esto asegura la maxima velocidad de reaccién. nes de reaccién deben ser constantes y han de ser descritas al publi- car los resultados. ENZIMAS 44s leulada com ida de Ta Ref. en funcién de la 4. Debe determinarse la velocidad de la reaceién en ausencia de en: luna preparacién enzimética inactivada por calentamiento. fidad de enzima utilizada, de forma que pueda calcularse la actividad especifica (normalmente se efectiia una determinacién de ‘otal, aungue, sila preparacién no ha sido purificada, la enzima puede uir s6lo una pequefia parte del total), na, empleando Una vez que se ha determinado la actividad cat bresada en «unidades de enzima», La unidad habit Cantidad de enzima que cataliza la utiliza las condiciones estandar de andli les utilizadas para el tratamiento de alimentos, las unidades de actividad no necesa mayor parte de las preparaci ziméticas de uso alimentario no son puras, por lo que no es posible deter cantidad de proteina enziméticamente activa, responsable de la transfor: Sustrato. Asi pues, la concentracién de expresa como unidades por mililitro de 0 en proteina de la preparacién, com: enzima por miligramo de proteina de actividad especifica seria moles de proteina, en las condiciones de tempera446, ‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS 2 Andlisis a Los bron de que ahort uso de ensayos de est en las que es posi Podemos hacer un ensayo a tiempo jo (9, 10, 146) lizan con frecuencia andlisis a tiempo fijo. Tienen Ia ventaja rie de valores de progreso debe ser igual a vo Un ejemplo interesante del empleo de ani test de coagt iempo fijo se encuentra en el jente usado por las industrias preparaciones de cuajo. Uno de ie0s de la leche es que coagula en presencia de pequefias, ky e+ ss esp, teem «a (48) ‘ima proteolitica, generalmente quimosina, aunque actualmente se emplean también cuajos de otros tipos. El término S se refiere a la «-caseina, una seina, que es la particula que coagula, léculas de x-caseina hidrolizadas en el Por la enzima coagulante. El péptido M es retirado de la x-caseina ase primaria de la reaccién [reaccién (47)]; suele ser llamado glicomacropépti- plemente, macropéptido. niimero de particulas que coagulan en la segunda fase de la reaccién [reaccién (48)]. La reacci6n de coagulacién viene expresada cinética- la constante de velocidad de floculacién. Bl término P, representa el empos de coagulacién, no se determina [P] en un momento tiempo fijo, sino que se obtiene progrese hasta un cierto punto, hasta que aparecen en la leche grumos coagulados. Para determinar la actividad de los cuajos se emplea la Ec. (46), denominada relacién de Segelke-Storch en este caso particular. Esta ecuacion indica que el tiempo de coagulacién debe ser inversamente proporcio- hal @ la concentracién de enzima. Por tanto, al representar el tiempo de coagulacién frente a la inversa de la concentracién de la enzima, se obtiene una linea recta que Puede ser utilizada como gréfica patrén para la determinacién de la actividad de un cuajo. ENZIMAS. 4a Es bien sabido que, en el momento en que la hhidrolizado hacia el 80 M% de los enlaces Fen-Met de la de la reaceién, cabe pensar que la curva de progreso par Ta enzi 10 sea lineal hasta Significa e smpo de coagulacién no es el modo mas pre- {so de determinar la actividad de los cuajos. Sin embargo, en el rango en que la gré- le tiempo de coagulaciOn en funcién de la inversa de la concentracién de enzima al, los tiempos de coagulacién dan una medida razonablemente buena de la actividad enzimatica. 3. Analisis con enzimas acopladas (9, 10, 146) A veces no es conveniente 0 resulta imposible determinar directamente el produc- to de una reaccién enzimatica. Sin embargo, el citado producto puede servir como sustrato para una segunda enzima, de forma que se obtiene un segundo compuesto ‘que puede ser medido convenientemente. En este caso, puede Ilevarse a cabo un and- lisis con enzimas acopladas. El sistema enzimético a ensayar se acopla con una se- ‘sunda enzima, que sirve como indicadora para la primera. En esta situacién, tendremos EE, abate (49) siendo A el sustrato para Es, la enzima a ensayar, B el producto de la accién de Ex indicadora. Cesel produc- jén de C para determinar la ara que se den esas circunstancias es preciso satisfacer dos condiciones basicas. En primer lugar, que la velocidad de eliminacién de A sea de orden cero respecto a Ay que la reaccién sea irreversible. En segundo lugar, que la velocidad de forma- cin de C sea de primer orden con respecto a versible. Si —d[AJ/dt es de orden cero res} © si durante el periodo de an: de aceptarse que la reaccién sera irreversible, puesto que B es retirado del sistema por la actividad de la enzima acoplada. Luego ata = constante (E:] (50) Podemos estar seguros de que d{C} en estado estacionario << Kg (la const bre B). Esto puede lograrse efectuando e! ta en un corto espacio de tiempo, para evitar la acumulacién de C. Si se cumplen las mencionadas con tencia, d{C]/dt serd constante y proporcior ten en estado estacionario, d[C]/dt =448 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS rn que relacione d[Cl/dt con ‘in de Ca diversos valores de [E, les de estas curvas frente a Ta concentracién de Por tanto, puede construirse una grafica ‘obteniendo curvas de pro ¥y representando las pendientes ini E; correspondiente. B, Determinacién de sustratos (9, 10, 146) Por su gran especificidad, las enzimas pueden ser utilizadas para el andliss de ‘componentes de los alimentos sin necesidad de purificarlos previamente. Ademas, mu- chas de las reacciones enziméticas son muy sensibles y permiten determinar incluso 10-" de m: Cuando se izan enzimas para la determinacién de sus sustratos, es importante mn. Dado que lo ante del sistema, adores y cofactores, por ejemplo, deben encontrarse en cantidad jinada de dos modos: fio 0 de conversién total. Se permite que la reaccién se com- plete y se mide la cantidad de producto formado por métodos fisicos o quimicos especificos. Método cinético. Se basa en operar a concentraci nes tales que la velocidad de reaccién sea propor trato (0 de un activador o inhibidor, si es éste de sustrato puede ser deter de enzima y en condicio- la concentracién de sus- que se desea determinar), jidad de formacién del pro- cuando [S] < 0,2 Ky. La punto importante a conseguir aqui es que la dducto sea proporcional a [S]. Esia condicién se cumpl Ec. (10) se convierte entonces en kg lEo] Km = constant (S] Por tanto, cuando [S] es muy baja las curvas de progreso deben ser lineales. Para ‘obtener una gréfica patrén que relacione la velocidad de formacién de producto con concentracién de sustrato, se construyen curvas de progreso a diferentes valores de [So] y sus pendientes se representan en funcién de la concentracién de sustrato correspondiente. (2) VIN MECANISMOS ENZIMATICOS (180, 183) En toda la discusién anterior se encuentra implicito el concepto de que las reac- ciones enziméticas exigen la formacién de un complejo enzima-sustrato, que se trans- ENZIMAS 449 producto para disociarse finalmente a enzima y pro- observados experimentalmente. En muchos casos son consecuencia d 183), Esto es lo que do producto. Este tipo de mecanismo puede ser gener nivel molecular puede ser ex- nuevos procesos y productos. aminodcidos especificos en las proteinas para mejorar su valor nutritivo. Aunque se basan en mecanismos diferentes, en los procesos.de transglicosidacién, de gran inte-450 NCA DE LOS ALIMENTOS: (A) Aaiecién s i ant KP rvagAt yar wn wh Fn eno MMe ies Se A i 7. en WO 20-6 . WO » rh Mecanismo de accion propuesto para la quimo cin cataltica de las cadenas lateales de histiding, sina (Ret. 183), fe ilustrando la partici spartico del centro act rés en la bioquimica y tecnologia de los carbohidratos, estan implicadas reacciones andlogas a éstas. El bloqueo reversible del grupo tiol de la cisteina en el centro activo de la papai- na, utlizando reacciones de intercat de una nueva explotacién comercial de Es bien sabido que la inyeccién der a su sacrificio intensifica, cenzima en el tejido da lugar al ablandamiento postmortem de la carne resultante. La inyeccién de la enzima libre y activa produce stress al animal, acompaftado de hemo- rragias internas que determinan la devaluaci el cocinado (88)). Conocidos los grupos funcionales dad enzimética, prcticamente cual alimentos, eng ASt = 198 ENZIMAS 4st Asi pues, pulacién juici nde nu ‘vos productos. Desd ficos por inversién delas Por otra parte, al- reambio en las que queso las enzimas 0s existentes en él ‘exégenas y endégenas pueden re (a concentraciones de agua rel importantes para el aror de los productos alimenticios ya existentes y para desarrollar otros nuevos. IX. FACTORES QUE INFLUENCIAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA les factores que afectan a fuerza inica, radiaciones ionizantes, fuerzas izallantes, presion y efectos de se. tos de Ia temperatura sobre Ia desnaturalizacién activacién de las enzimas Los efectos de la temperatura sobre jemperaturas elevadas pueden afectar uno de los sustratos de la reaccién. Ademds, puede ocurrir que inactivada. De hecho, éste es uno de los objetivos del tratamiento al, las enzimas operan muy lentamente a temperaturas de congelacién Y su actividad aumenta cuando lo hace la temperatura. La mayor parte de las enzi- esentan su «actividad éptima» en el rango 30-40 °C y, por encima de jenden también a tener una temperatura de «re desnaturalizacién, por lo general claramente pot debajo de la de 10 de estos fendmenos y el de otras caracteristicas del comporta- ‘miento de las moléculas de las enzimas, es wtil para la ciencia de los alimentos, El452 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS bromatélogo debe saber cémo obtener y utilizar los Por ejemplo, necesita a menudo conocer los pé ‘nactivacién irrevers y, para una comprensién plena del proceso, ha de entender también los principios termodindmicos en que se basa. Por ello, la primera seccién de este apartado esté dedicada al estudio de la termodinémica de la desnaturalizacién /inactivacién enzi- mética y la segunda al de la cinética de la inactivacién de las enzimas por el calor. Los efectos de las temperaturas elevadas sobre las proteinas han recibido mds aten- cidn que los de las bajas, situacién que refleja el espacio dedicado a ellos en las dos secciones siguientes. Sin embargo, el hecho de que las enzimas presenten una tempe- ratura de méxima resistencia al calor indica que estan también sometidas a desnatu- ralizacién a bajas temperaturas. Este comportamient de las bajas temperaturas sobre las enzimas se expondra en una seccién poste 1. Termodinémica de la desnaturalizacién ¢ inactivacién de las enzimas ‘ionada con, pero no es idén- ién de las enzimas por el calor esta rel requerir una desnaturalizacién profunda 0 muy ligera. La discusién que sigue se centra principalmente en la desnaturalizaci6n proteica, porque este fenémeno proporciona un contexto ideal en el que explicar el comporta- ‘miento de las proteinas cuando son sometidas a cambios de temperatura, Cuando abordemos el tema de I iguien- te, trataremos més especificamente de la destruccién de la actividad enzimatica. ‘Se han hecho numerosos intentos para explic nas por el calor desde un punto de vista termo més fundamentales a este fin AG=AH-Tas (53) donde Ges el cambio en energia libre de Gibbs, 4H el cambio en entalpia, aS el cambio en entropia y T la temperatura en grados Kelvin. La energia libre represen- ta la energia disponible para que funcione un proceso determinado, Si el valor de a energia libre es positivo, el proceso no es favorable termodinamicamente (vase Fig. 1). Sies cero, el proceso esté en eq Si negativo, es favorable desde el pun- to de vista energético, pero esto no dice nada acerca de la velocidad a que tendra lugar. La entalpia es el calor absorbido 0 liberado durante un proceso quimico dado ‘cuando la presién es constante. Si se absorbe calor (+ a H), el proceso es endotérmi- 0; si se libera (— a H), es exotérmico. Los valores de entalpia suelen dar indi de la clase y niimero de enlaces rotos o formados durante una reaccién quimica, ENZIMAS 433 La entropia es una medida de la «libertad» de que dispone una molécula en una situacién determinada. Un aumento de entropia indica un aumento en libertad, lo {que suele significar que las moléculas involucradas en la reaccién han ganado al tér- mino de ella una libertad de movimientos que no tenian. Las moléculas de proteina tienden a tomar una configuracién en espiral ordenada ‘al azar durante la desnaturalizaci6n. Este evento suele ir asociado a grandes cambios ‘espaciales por los cuales las cadenas laterales de los aminodcidos ganan una libertad ide movimientos que no tenfan en el estado nativo. Por 1a desnaturalizacion El cambio en en- proceso serd tam! ra romper los numerosos enlaces electi an la estructura nativa. as elevadas, S para la desnat icos y puentes de hidré- izacién es suficientemente grande de —T 45 sea mayor que el valor absoluto de + 4H, lizacién favorable, A temperaturas algo més bajas, la magnitud de + aH supera la de —T a S, dando lugar a un valor p para s Gy a que las condiciones sean desfavorables para la desnaturalizacién. Estas ‘observaciones tienen en cuenta tinicamente el comportamiento de las moléculas pro- teicas. Sin embargo, hemos de considerar también las interacciones entre tales molé- coulas y el agua adyacente, El desplegamiento de una molécula proteica expone a los idrofobicos al entorno acuoso, dando lugar a un incremento de la estruetu- racidn del agua adyacente a estos grupos. El aumento del grado de interaccién entre ecto sobre el agua es especialmente pronunciado a bajas temperaturas. Si pre= aH > +T aS, 2G serd negativo y la desnaturali temperaturas. Dicho de otro modo, a bajas tempera ‘onar unas con otras. En consecuencia, las asociaciones hidrofobicas son menos es- tables. En concordancia con estos post ue algunas proteinas presentan una temperatura de maxima resistencia a la desnatu- ralizacién, Por ejemplo, la representacion de 4 Gen funcién de T para el a-quimo- tvipsinégeno (Fig. 12) muestra un minimo, en tomo a 10 °C, al que la resist la desnaturalizacin es maxima, Este importante aspecto de la desnaturalizaciOn pro- teica seré fo con mayor detalle més adelante, pero conviene describir primero los métodos de determinacién de los pardn i iden al equilibrio. La Ec. ($4) describe la desnaturalizacién rever- sible de una proteina: Kp Pye Pp (sa) «Ia que Py es a proteina nativa, Pp la proteina desnaturalzada reversiblemente y Koes el cociente [PpI/[Py], es decir, la constante de equilibrio para la desnatural-454 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS zacién. La relacin entre la constante de equilibrioy la temperatura viene dada por (55) La integracién indefinida de la Ec. (55) da lugar a la Ee. ($6), que corresponde a la ecuacién general de una recta: au inka SB Kan Qh + constant (56) pH 10, 01M cim oH 20, OOM cI rr a a a TEMPERATURA ENZIMAS 43s én de In K frente las concentraciones ‘denadas de la repres H/R. Si se conoce alas temperaturas T; y idos los valores de K a dos do K: y Ko las constantes de equi . La Ec. (57) permite calcular a diferentes. -mperaturas Los valores de a G pueden ser obtenidos directamente de la conocida ecuacién AG=-RTInK (58) 553 uUre9, os 3031 32 33 34 35 36 177 108 KY456 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Una ver que se han determinado «Gy 4H, 4S puede calcularse a partir de la Ec. ( En las Ee. (56) y (57) se supone que & Hes te en el rango de temperatura j6n de Van't Hoff para rafica (— a H/R) se deduce que, en pre- ‘@H se aproxima a cero en torno a 38 °C y aumenta en valor absoluto turas mas altas como mas bajas. Por tanto, la desnatu: micos y los valores de Trax Para yen también en la tabla los valores de capi un pardmetro termodindmico importante en mino Cp puede ser determinado a partir de la ecuacién: dant ar Ta as (9) aT scr aH ase Cp estabildad Proteina (condiciones) (kcal/mol) (kcal/mol) (cal/grado)(cal/moligrado) --("C) Ribonuclease +09 487 +S 420009 " +73 439 +108 +2600 0 +16 42495 +1400 ° +06 42180 35 (SM urea, pH 3, 25°C Fuente: Ref. 1683 La capacidad calérica es, pues, una medida de la dependencia de a Hy 0 Sres- pecto de la temperatura. Hemos indicado ya que el desplegamiento de una proteina cursa con un gran ineremento de Hy 4S para la molécula proteica misma, pero con un descenso en 4S y a H para las moléculas de agua que co vente de la protein en cuestién. Dado que los valores de Cp de la todos los casos, muy elevados, se deduce que «Hy aS dependen fuertemente de la temperatura, como confirma la Figura 14, que demuestra que aH, Sy Cp aumentan cuando esta lo hace. ENZIMAS 4s7 S* y B¢p/0 (calimotn) TEMPERATURA (0) Figura 14, Dependencia dela temperatura de la calorica, Cp, en la desnaturalizacién del quim Los efectos de la temperatura sob: rncia de una temperatura imiento de la temperatura de menos uuna gran importancia para el la calidad de las proteinas en La termodindmica se ocupa brio. Sin embargo, de los alimentos suele tener como ol inactivar sus enzimas irreversiblemente. La cinética quimica proporciona una pode- ‘rosa herramienta que puede ser de gran ayuda en el logro de este objetivo, especial- ‘mente en la preparacién de perfiles de tiempo-temperatura para los tratamientos de inact En 6n se estudia la cinética de la ina 2imas. El pre elemento cecil de infor tiene lugar el proceso de in iin térmica aplicada a las en- al respecto es la velocidad a que = ivacién de una enzima determinada a una temperatura Gada, Han de obtenerse también las velocidades de inactivacién a diferentes tempera- luras, En relacién con ello, se estudian aqui las conexiones entre la teoria de la del estado de transicién y, dado que son ampliamente utilizados, se quecute asimismo el significado de los valores de Quo. Finalmente, se pasaré a consi- rar las curvas de inactivacién térmica, por cuanto proporcionan los medios para obtener perfiles de tiempo-temperatura en los procesos de inactivacién de las enzi- ‘mas por accién del calor.458 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Orden de reaccién. La desnaturalizacién proteica suele seguir éinéticas de primer orden, ya que, por definicién, es una sola molécula, la proteina, la que sufre un cam- bio de conformacién. Del mismo modo, se acepta que la inactivacién de las enzimas sigue, en general, una cinética de primer orden. Sin embargo, cuando existe en el me- dio més de un tipo de enzima, como es el caso frecuentemente en los alimentos, pue- den aparecer cinéticas mas complejas. En Jos casos en que puede aceptarse que la cinética es de primer orden, el proceso ty ey (60) fay k la constante de ve- donde Ey es la enzima nativa o activa, E; La expresign matema- fica para el proceso de ow aie pucde ser reorganizada esd gat (62) ¥; Por intcgracién indefnia, og [Ey] =~ #— + constante (3) 2.303 donde la constante es la intersecciGn en el eje vertical obtenida al representar log (Ex] en funcién de t y —k/2.303 la pendiente de dicha gréfica, Si la cinética es realmente de primer orden, la citada representacién debe ser lineal durante, al menos, tres veces la vida media, siendo ésta 0.693 /k. Dependencia de ta temperatura. La expresién matemética tal vez mas utilizada para exponer el efecto de la temperatura sobre Ia velocidad de un proceso quimico, reacciones enzimaticas incluidas, es la ecuacién de Arrhenius k= aeEURT cen la que Aes el factor de Arrhenius o de frecuencia y E, la energia de act de Arrhenius. La forma logaritmica de la Ec. (64) es me (6s) ica que, al representar Ink frente a 1/, se obtendré una linea recta cuya pen- diente es —E,/R. Si la cinética de la inactivacién es de primer orden, k puede obte- nerse a partir de la Ec. (63). La magnitud de E, expresa el grado de dependencia res- ecto a la temperatura de la reaccién en cuestién, En la seccién precedente se mencioné que las proteinas pueden desnaturalizarse tanto a altas como a bajas temperaturas. Del mismo modo, es de esperar que se pro- ENZIMAS 459 duzca inactivaci6n tanto a las temperaturas altas como a las bajas, La inactivacién Ge las enzimas a altas temperaturas es bien conocida, pero lo es menos su comporta: miento a temperaturas bajas. Las representaciones de Arrhernius para la actividad (Fig. 15). Este rente, o al desplegamiento de la molécula proteica o, sila enzima es una proteina polimética, a la disociacién de sus subunida- des, Este fendmeno sera discutido con mayor detalle en la seccién siguiente. 20 0 0” 0 -20 -30 106 DE LA VELOCIDAD & 8 & 5 os} 33035 6 37 383940) VT x04 Figura 18. Representacién de Arrheni roxidasa y por la hemina, (Repro yacolcatalizada por la pe de Ref. 169, por cortesia de Academic Pres Teoria del estado de transicién. Como puede observarse, las ecuuaciones de van't Hoff y de Arrhenius son muy similares, Sin embargo, « H no es idéntica a E,. Ain asi, la semejanza entre las dos ecuaciones sugiere que los valores de E, pueden pro- Porcionar alguna informacién sobre la naturaleza termodindmica de los procesos ‘micos. La teoria del estado de transicién, o teoria de Eyring, constituye el mejor mo- do de relacionar la informacién cinética sobre un proceso irreversible con la termodi- »namica, Brevemente, esta teoria sugiere que el reaccionante X, en una reaccidn irre versible, pasa por un estado de transicién, X*, que se encuet ibrio con el Feaccionante original. Ademés, sugiere también que X* se encue ético mas al teen la res de 4 Gt, de la entalpia (» H*) y la entropia ( S*) del estado ién como pueden ser calculados estos valores y cémo pueden rela Sionarse explicitamente Ex y a H*,‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS La teoria del estado de transicién puede ser representada del siguiente modo xEixe—p (65) La velocidad de desaparicién de X viene dada por co) la pérdida de moléculas del léculas activadas sobrepasan la ba- Ja Ec, 67 se transforma en rrera energética ie. D. Dado que K* = a = BK*IX] (68) De la Ec. (68) se deduce que (69) k=BK* donde k es la constante de velocidad especifica para el proceso de transi de K*, puede expresarse en términos de G* por la Ec. (58). El coefic jendo in de moléculas que pasan a energética, pero este término suele considerarse igual a uno, Asi pues, la Ec. (69) puede transformarse en término exponencial corresponde ahora a la ener en lugar de a la energia de activacién. Por otra parte, puede observarse que de frecuencia (kyT/h) incluye un término de temperatura, que no existe en el factor de Arrhenii puede combinarse con la Ec. (53) para relacionar la cons- tante de velocidad especifica con la entalpia y entropia del estado de transicién: ENZIMAS, SH! 4 constante RT Tepresentacion de Arrhenius In ken diente es ig tan relacionadas por la ecuacién funcién de £,=AH*+RT oD jo de transiciOn (« H*) para valores son bastante grandes, generalm esperar dada la naturaleza de la desnaturalizacién e idn, en las que se rompe un gran numero de enlaces electrostaticos y puentes de hidrégeno, ién para la desnaturalizacién de varias p aS* Enlaces roios— a.G* (25 °C) Proveina (cal/moly __(eu)* (No} feal/mol) Lipasa (pancredtica) 45.400 68.2 9 25.100 Amilasa (malta) 4.600 23 8 26,000 Pepsina 55600 1133, W 21.800 Ovoalbimina 132.00 3157 26 37.900 Hemoglobina 75600 182.7 15 30.100 Peroxidasa (leche) 185300 466.0 ” 46.400 89.300 2080 18 27.300 40.200 449 8 26.900 2.400 10 27200 86.400 0 31.300 110.400 2 32.200 74.400 is 29,000 ado, durante el proseso de desnaturalizacién (~ « H¥/S.000), oman- ace $,000 cal/ol 83, con algunas modificaciones. 40 como promedio de a H™ Fuente: Tomas dela Ref Es preciso recalcar que la diferencia entre H* y E, es igual a RT. Esto representa menos de 1 kcal/mol en el rango de temperatura normalment {dios de inactivacién, Los valores de H* y E, para la catdl Beneral, mucho menores que los correspondientes a la inactivacién; suelen caer en462 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Los modelos de Arrhenius y de cl efecto de la temperatura sobre las vi nos de mencién otros dos enfoques, truir las curvas de efi Valores de Quo. icroorganismos, a: = 3 En la mayor parte de los procesos quimicos el valor de Quo cae en el rango 2:3. Este valor puede ser en la temperatura. Graficas de inactivacién térmica. En las industrias conserveras, la inactivacién de los microorganismos por accién del calor suele expresarse mediante graticas de tiem- po de muerte térmica (representacién del log del tiempo de muerte térmica en fun- cin de Ia temperatura). Para la inactivacién térmica de las enzimas puede aplicarse tn tratamiento similar. El objeto de la discusidn que se expone a continuacién es des- cribir como se construyen las curvas de inactivacién térmica y definir los pardmetros a utilizar. El primero de estos pardmetros es el valor D o valor de reduccién decimal, que se define como el tiempo necesario para inactivar, a una temperatura constante, un 90 Wo de la actividad enzimética original. Si una reaccién de iné in sigue una cinética de primer orden, el valor D es igual a 2,303/k. Asi pues, este término puede ser combinado con la Ee. (63) para dar to {Ey == + conte a 463 ite de la recta ser —1/D. Los valo- faciones en papel semi ico (en ordenadas) y jalmente cuando se repre- Porque proporcionan datos de inactivacién térmica ‘a muchas temperaturas. La pendiente de una de estas graficas, que refleja la depen- con la temperatura, es —1/2, donde 2 representa jecesario para que la curva de inactiva- (76) Las temperaturas T; y Ts se expresan normalmente en grados Fahrenheit, Como D esté relacionado mateméticamente con k por la Ec. (74, lo est también ‘con E, por la ecuacién de Arrhenius Y, como Dy Zestan también rel con E,. Combinando las Exs. (64), 4) a de inactivacién corresponde a un valor z pequefio. srmica suelen expresarse en la escala Fahrenheit érmino 9/5 para convertirios a la escala de Kelvin, Es importante sefialar que, aunque tanto E, ;peratura, la Ee. (77), que correlaciona ambos Por tanto, una gran eners Dado que los datos de inactivaci arimetros, depende de ella. El valor Z puede ser nando las Ecs. (73) y ( mado también con Qyo. Puede lograrse esto combi- Qyo = e232K915) iss De nuevo el término 9/5 transforma Ia escala de temperatura de grados Fahren- helt a grados Kelvin. Los grandes valores de Quo y Ex observados para la inactivacion snzimatica concuerdan con el hecho de que, a temperaturas critcas, un pequeno464 (QUIMICA DE LOS ALIMENTOS aumento en esta produce un gran incremento en la velocidad de inactivacién de las enzimas. como referencia, algunos otros en: De un modo simi © vapor con el propésit as, lipoxigenasas, cloro! dado es considerado suc tente al calor, ya no es act ‘Cuando una actividad en: vacion irreversible, Si tarse conseguir su inacti- ropésitos y su accidn so- vadas reversiblemente (véase as mas bajas tO puede ser ex mo muestra la Figura ial severidad térmica (para los. to crea problemas en La inspeccién de tentos, cuando, por ejemplo, una leche debidamente pasterizada pot métodos HTST da positivo al test de la fosfatasa (lo que indicaria una pasterizacién incorre regeneracién de la enzima. La regeracién de enzimas como la peroxidasa ‘genasa, puede tener efectos nocivos sobre la calidad sensorial y el valor nu Ios al 168) 3. Algunos efectos especificos de las bajas temperaturas (53, 75, La principal raz6n por la que los alimentos se exponen a bajas temperaturas, es- Pecialmente los productos congelados, es evitar el crecimiento microbiano manteniendo en lo posible todos los atributos de calidad del alimento. Aunque algunas enzimas se desnaturalizan en un grado significativo durante la congelacién y descongelacién, muchos otros no se ven afectados, Ademas, muchas enzimas conservan parcialmente su actividad en los productos congelados. Cuando se hace descender la temperatura de una disolucién enzimatica de 0 a 10 °C por de- bajo de su punto de congelacién, la actividad enzimética puede aumentar o decrecer, dependiendo de la enzima de que se trate y del sistema en que se encuentre. Un mayor descenso en la temperatura da como resultado casi siempre una reduccidn de la acti- vidad. Este comportamiento de las enzimas en los sistemas parcialmente congelados parece estar en relacién con 1, La composicién det medio, 2. La velocidad y extensién de la congelacién, 3. Los efectos de concentracién provocados por la congelacién, 4. La viscosidad. ENZIMAS 465 CATALASA 60 % 60} 7 pe 9 FOSFATASA ACIDA 83 2 / N pasa PEROXIDASA ~ Z 08 XANTINA aa OKIDASA o2| FOSFATASA * ALCALINA °Y PASTERIZACION gael 206 004 002] ia 4 ae 3088106, TEMPERATURA para la inactivacion de algunas enzimas de ia de John Wiley & Sons), 16. Relaciones de tiempo y tem (Reconstruida de la Ref, 84, por PEROXIDASA REGENERADA (%) ° 304030 70 VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO (°CIMIN} Pikure 17, Regeneracion de la peroxidasa del nabo en funcidn de la velocidad de calemta- ‘mento, (Reconstruida de ta Ref. 143, por cortesia del Institute of Food Technologistda. *mportamiento predicho por la ecuacién de Arrhenius. En la Figura 15, por Se representan, segiin esta ecuacién, datos para la oxidacién del guayacol en metanol al 40 % por preparaciones purificadas de peroxidasa y por la hemina a temperaturas entre +25 y —30 °C. Las muestras estuvieron exentas de hielo en todo el rango de temperatura. Se han observado comportamientos no lineales similares en la representacién de Arrhenius con diversas otras enzimas, tanto en sistemas que con- tenian hielo como en otros que no (144). El descenso en que predice la ecuacién de Arrhenius puede ser debido a los: bios en ta conformacién de la enzima (por ej., durante el centro activo puede verse alterado dando lugar a conform: la enzima, con el resultado de una menor eros menos activos de la enzima; cambios ‘mecanismo de reaccién (por ¢j., puede cambiar la etapa dad); descenso en el estado de ionizacién de la enzima, del sustrato o de los tampones, al descender la temperatura; posibles cambios en el pH del sistema o en el pH éptimo de las enzimas; y aumento de la viscosidad del sistema a medida que desciende la temperatura. Durante la congelaci gelada. El aumento en la ‘menudo, ocurre simul efecto sea activacién, estabilizacién o inhibicién, depende de la enzima za y concentracién de las sales, del pH, de la temperatt- demas sustancias presentes, dad de algunas enzimas en los sistemas parcialmente congelados puede afectada por la velocidad de congelacién. Este factor contribuye a de- terminar el tamafio de las zonas no congeladas y la concentracién de solutos en ellas, lo que, a su vez, es de suponer afecte a la actividad enzimatica. La elevada viscosidad de los sistemas congelados da lugar a que desciendan las. velocidades de difusién de la enzima y de los sustratos y, por tanto, tiende a la actividad de las reacciones enzimiticas La congelacién y descongelacién lenta det didas de actividad enzimética que la répida, y descongelacién de 10s produce dafios en las membranas ares, tales como las mitocondrias o los lisosomas, y, con ellos, Ia ina, por regla general, mayores pér- ENZIMAS 467 jones naturales, Las enzimas liberadas («ac- MN © por otras manipulaciones capaces somas se rompen apariciOn de enzimas fuera de sus local tivadas») por la congelacién y desconge de alterar las estructuras, se denominan enzimas latentes, Los li fécilmente por los cambios en la presién osmtica, el pH y la concentracién salina que acompaian a la congelacién y descongelacion. Como los lisosomas contienen lun amplio equipo de enzimas cidn masiva del ' Su ruptura puede dar lugar a una altera- ido, Para minimizarla, si es esto lo que se desea, debe prestarse n lo posible, que los lisosomas resulten dafiados. pueden ser alteradas por exposicién a temperaturas de refrigera- cidn, fenémeno al que se denomina desnturalizacién por to, que es mas bien una excepcién que | algunas enzimas La inactivacién reversible por el frio puede ser consecuencia de la disociacién reversible de subunida- des enzimaticas a bajas temperaturas o, en general, de cambios en la conformacién de la enzima, Los problemas de origen enzimatico que afectan @ la calidad de los alimentos du- rante su almacenamiento a bajas temperaturas, pueden tener las siguientes causas: Concentracién de solutos por la retirada de agua durante la congelacién, tuaciones de Ia temperatura durante el almacenamiento y distribucién, que Posibilitan se potencien las actividades enzimaticas durante los momentos en que Ta temperatura es alta, 4. Acumul macién de componentes no 6. Cambios en las funciones fisioldgicas al descender la temperatura, como respuesta al stress a nivel tisular. 7. Presencia en los que pueden estabi- jas temperaturas. B. Efectos del pH sobre las enzimas (50, 133) Los pH extremos suelen inactivar a las enzimas. Por lo general, las enzimas pre- sentan una maxima actividad a un valor determinado de pH, al que se denomina «pH Sptimo», En la Figura 18 se ilustran las relaciones entre pH y actividad, La mayor Parte de las enzimas presentan su actividad maxima a pH entre 4,5-8,0 y ésta suele antenerse slo, aunque no siempre es asi, en un rango de pH bastante estrecho. Exis- ‘en, sin embargo, enzimas con un pH éptimo extremo, como la pepsin, que lo tiene PH 18, 0 la arginasa, cuyo éptimo se encuentra a pH 10,0. Dependiendo de la enzi- ‘ma de que se trate, las curvas de actividad en funcién del pH pueden ser sigmoidales468 QUIMICA DE Los ALIMENTOS © tener forma de campana. A pHs extremos, la actividad enzimética suele decaer irre- versiblemente debido a procesos de desnaturalizacion proteica, Sin embargo, como se indica en la Figura 18, las enzimas suelen presentar también un rango de inactiva. in reversible, aparentemente por jonizacién reversible de los grupos funcionales de! centro activo 0 de dteas que controlan la conformacién de El control det pH y de sus relaciones con la actividad enzimética es importante imentos. En un proceso industrial, el pH puede ser controlado al maximo una reaccién enzimatica. Por ejemplo, puede impedirse la actividad fenolasa reduciendo el pH del sistema por debajo de 3,0. En las frutas, por ejemplo, suele conseguirse esto por adicién de acidificantes naturales, como acido citrico, malico o fosférico. oH OFTIMO | RANGO DE TOTAL ESTABILIDAD VELOCIDAD INIGIAL DE REACCION El pH éptimo de una enzima puede ser consecuencia de (a) un verdadero efecto ‘eversible del pH sobre la velocidad maxima de la reacci6n, (b) un efecto del pH so- inidad del sustrato por la enzima y (c) en efecto del pH sobre la estabilidad Actividad del agua y actividad enzimética (1, 144) Muchas de las caracteristicas de las actividades enzimaticas en los gelados se dan también en los alimentos deshidratados, en los que ‘gua (a) se encuentra asimismo restringida, Aunque es di ‘mas puedan actuar a concentraciones de agua muy bajas, es bien conocido que las temas con- ENZIMAS 469 egumbres deshidratadas adquieren pronto un aroma a heno si no son escaldadas an- tes de desecarlas y que Jos producto: avena deshidratada se vuelven cl almacenamiento fe sus enzimas por Asi pues, es de conocimiento comin que los alimentos protegidos is a muy bajos niveles de humedad, como muestra la Figura 19, A medida ‘que aumenta la humedad lo hace también la lipolisis, de forma que a un 14% de humedad es ya muy répida, idos no alterados, la compartimentalizacién de las enzimas hace que &s- tas se encuentren eficazmente separadas de sus sustratos. Los granos de cereales con ‘un contenido en agua de un 13 ®, por ejemplo, pueden ser almacenados durante me- ses ¢ incluso afos sin deterioro aparente; sin embargo, los granos con el mismo conte- enzimas endégenas, ha de prestarse atencién t ‘genas producidas por los mictoorganismos, que pueden ser de gran importancia en los cereales y en los oviproductos deshidratados, en los que las bacterias pueden ha- ido antes de procederse a su desecacién. ‘en agua de un alimento no es necesariamente el factor decisivo; importa, mas bien, el grado en que ésta se encuentra ligada (véase Cap. 2). Por tanto, Ja actividad de agua (a,) y la humedad relativa de equilibrio son pardmetros més ade- cuados de las actividades enzimaticas en los alimentos deshidratados que el conteni- do en agua, Sobre la base de los datos proporcionados por sistemas model {ra la Figura 20, cabe hacer las siguientes generalizaciones: ( la actividad de las enzimas puede producir cambi alimento en cu como el que sin embargo, jemplo de la Figura 20: tras prolongar el almacenat @ baja a, hasta que ces6 la acumulacién de producto, se hizo aumentar la a, del tema, con el resultado de que la e ivel caracteristico de la nueva actividad de agua. debido, aparentemente, a que la disponibilidad del sustrato (la cantidad disuelta) era dependiente de la a,. Una vez que el sustrato disuelto a una 'y dada era constumido, la reaccin se detenta. Asi pues, un aumento en ay daba lu- Bar @ que se incrementase la cantidad de agus cantidad adicional de sustrato y continuase. adsorcién monomolecular, cuando comienzan a existir cantidades crecientes de agua como vehiculo de los procesos enzimaticos. Sin embargo, algunas izadas por enzimas pueden tener lugar incluso por debajo de la ay ente a la adsorcién de agua en monocapa. Esto es posible si el sustrato ®S sificientemente movil y fluido para asociarse con la enzima, como sucede, por ejem-470 ‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS HUMEDAD Ea 3 wm e § a ef 2 boo lt i 5 TIEMPO (SEMANAS) igure 19. Efecics del contenido en humedad y de! empo de almacenamiento 2378 °C en rados herméticamente sobre la acidez de ‘queado,(Resonstrulda dela Ref. 0, por cote dela HIDROLISIS (%) TIPO DE ALMACENAMIENTO DIAS) igure 20. Influencia dela actividad de agua sobre la hidrdlsis enzimatica de la luna mezcla de malta de cebada molida y un 2 % de dda de la Ref. 2, por cortesia de J. F. Bergmann-Ver ENZIMAS an jas, estos compuestos son més accesi zados mucho mas répidamente que los se almacenan los aliment jos pueden ser atacados a baja a, si se encuentran en cont tos macromoleculares pueden enzimatica. Por eje ble para formar oli ‘man glucosa y maltosa y sél |, 1a accidn de las enzimas a ay bajas tiende a evi ua se encuentra fuertemente ligada, la oxidacién enzimatica se enlentece 0 resul- ta imposible. desecacién, las enzimas son més estables al calor. A medida que do en humedad, lo hace tambien la susceptibilidad de la enzima i ede tener importancia practica durante la deshidra- por ejemplo, y en algunos articulos de panaderia, fen los que no todas las enzimas son inactivadas durante Los efectos producidos sobre los diferentes enzimas dur dden ser muy variables, porque lo son también sus respuestas a ,activadores 0 inhibidores (144). Algunos solutes, como los azi- icinas, suelen tener un efecto protector sobre las enzimas. La conc tracién salina afecta de distnto modo a la solubilidad de los demas componentes(sal- ting in/out \o que puede det ‘concentracién de un sustrato dado aumente © disminuya, Por otra parte, en el caso de algunas enzimas, un aumento en la conce: tracién de sustrato puede producirinhibicidn por exceso de este, Finalmente, un au to en la concentracién de compaftado de un descenso en la concentracién de agua puede dar lugar a la inversién de las reacciones hidr aparicién de rmacién de productos «anormale: ividades enziméticas durante el almacenami Productos deéecados no siempre es nociva. El artoz almacenado durante Flodos resulta menos pegajoso tras la coccién que el ' porque las amilasas actin sobre las cadenas amilosa del almidén. Las amilasasan QUIMICA DE LOS ALIMENTOS indo sobre el almidén de los articulos de panaderia roma de algunos alimentos desecados puede verse favorecido por la com de las enzimas endégenas, que es también importante para la produccion de datiles y boniatos deshidratados de alta calidad (144), D. Efectos de los electrolitos y de Ia fuerza idnica sobre las enzimas (36, 138) hibicién 1. Activacién e variables, dependiendo de la enzima de que se t tOxico para una de ellas y activar, en cambio, a otra, ¢ inhibidor d sobre la enzima como pr ponentes del centro activo. Los aniones tienden a ser bastante inespecificos en sus acciones sobre las enzi- ras que las necesidades de cationes de una enzima son, con cierta frecuen- nas enzimas son activadas por mas de un catién, otras lo son inado, Se sabe que activan enzimas los cationes: Na*, K*, mbién casos de antagoni josina activada por el Cat eden activar a las enzimas por una gran vari entre ellos (a) llegando a ser parte integrante del centro activo, entre la enzima y el susrato, (c) modificando la constant de eg tia, (4) modificando la carga en la superficie de la proteina enzimética, (€) retirando un inhibidor de la reaccion, (f) desplazando un ion metdico ineficaz del centro activo 0 del sustrato y (g) desplazando el equilibrio de una conformacién me- nos activa a otra que lo es mas 2 Solu ién con la concentracién salina izacién e insolut Las concentraciones elevadas de electrolitos afectan, en general, de las proteinas, Para solubilizar una prote{na en un medio acuoso suele ser necesaria la presencia de sales (salting in). De otro lado, las sales pueden ser utilizadas para insolubilizar (salting out) una enzima, un fendmeno del que se hace uso para su aisla- rmiento, A este fin suele utilizarse sulfato aménico, por ser altamente soluble en agua ¢ inocuo para la mayor parte de las enzimas, Al someter a Jos al 1s a ciertos tratamientos, tales como el salazonado, las ‘enzimas pueden ser inactivadas por las concentraciones elevadas de electrolitos. En [ENZIMAS 473 10s, bastan pequefias concentraciones de ciertos cationes y aniones para lad. Estos efectos son especificos y difieren de una a otra enzima, icos de los electrolitos parecen ser consecuencia de una fuerte pre- jigarse a la enzima, bien en su estado nativo o desnaturalizado. Sin embar- lad de las e ferencia go, 2 concentraciones altas todos los electrolitos presumiblemente por efectos no especificos, pues fadas de un modo similar. FE. Inactivacién de Ins enzimas por fuerzas de La Figura 21 ilustra la inactivacién del cuajo, a 4 °C, por fuerzas de {a inactivacin comienza a ser detectable cuando el valor de cizalladura ( de cizalladura en see ~' por el tiempo de exposicién en sec) es mayor de 10*, A del orden de 10”, se ha observado una inactivacién del orden de un 50 ®%s para disolu- clones de catalasa, cuajo y carboxipeptidasa (42). Por otra parte, el cuajo se reactiva acién por fuerzas de cizalladura, lo que recuerda la reactivaciGn tras ivacion térmica reversible. TIEMPO DE EXPOSICION (MIN) Figura 21. Inc Ref. 24, por corte ivacién del cuajo, a 4 °C, por fuerzas de cizalladura, (Reproducida de la ‘de Academic Press)44 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS do de os alimentos, Por tanto, los efectos de la presién sobre las enzimas tienen poco interés para la ciencia de los alimentos. to el empleo de radiaciones ionizantes, como rayos + y electrones ‘Aunque las enzimas pueden punto de vista microbiolégico por las radiaciones ionizantes, las ticas residuales de un alimento pueden poner en peligro sus propiedades organolé} cas deseables y su valor nutritivo. En general, la destruccidn de la actividad enzimatica por las radiaci tes seve afectada por la clase de enzima de que se trate, la actividad de agua, la concen- la pureza de la preparacién enzimética empleada, los efectos in la concentracién de oxigeno, el pH y la temperatura. En ausen- “omo puede verse en Ia Figura 22, Iblemente porque, en estas condiciones, s6lo operan én. La inact contenidos en agua mAs altos, la répida recombinacién de los radical tantes reduce, aparentemente, su eficacia. La radiorresistencia de cada enzima en medios acuosos varia dentro de limites muy lasa es unas 60 veces mas resistente a la inactivacién por irradiacién ‘que la carboxipeptidasa. Las enzimas que requieren la presencia en su centro activo de determinados grupos funcionales sensibles, como el grupo tiol de la cisteina en les ala inactivacién por ac- preparaciones enziméticas poco purificadas suelen ser més resistentes a la irradiacién ‘que las puras. La presencia de oxigeno en el a la radiodestruccién, tal vez por la formacién de peréxidos de proteina que actiian ‘como intermediarios inestables. El efecto del pH sobre la in de las enzimas i6n puede ser considerable, pero no resulta facil de predecir (véase Fig. 22), El efecto de la radiacién sobre las enzimas de la carne se ve influenciado por ak att teeiiieaiilani ENZIMAS. 415 20, 1 hoes ACTIVIDAD RESIDUAL.) DOSIS RECIBIDA la temperatura. En los sistemas congelados la alteracién de las enzimas es poco evidente, presumi- © porque los radicales libres se encuentran inmovilizados. an para dar diferentes resul- ficadas). En los te) de importancia, como lo la actividad de agua, los efectos protectores de otros componentes celulares, par- ‘ularmente los que son capaces de eliminar los radi fn funcién del tiempo transcurrido desde la recolec: En algunos casos se ha sugerido el empleo de trata ropuesto, por ejemplo, aplicar un tratamiento térmico moderado para inactivar a las enzimas asociado a otro de irradiacién para destruir a los microorganismos. Co- ‘mo alternativa, la irradiacién seguida de refrigeracin es eficaz en alimentos tales co- Mo pescado fresco, fresas, tomates y setas. En el Capitulo $ se aportan mas detalles sobre los cambios ocurridos durante la én de las proteinas, 1H. Inactivacién de las enzimas en las interfases (83, 95, 109) Las proteinas iden, en general, a adsorbe lugar a su desnatu izacidn. Es responsable de el en las interfases, lo que suele dar parecer, la elevada tensién exis-476 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS tente en las interfases aire/agua o aceite/agua, que da lugar a que la estructura secun- daria y terciaria de la enzima se despliegue répid: ientan hacia el aire y las hidrot /agua, las cadenas hidrofol fenden dentro del agua. La si cas hacia el agua. En una emul- ian con cl aceite y las hidrofilicas 6n de espuma en las disoluciones que nen enzimas puede producir interfases aire-agua y, con ello, su desnaturaliza- iguiente pérdida en actividad enzimatica no se recupera por compresin © por las diversas formas de recuperacién de las peliculas Algunos de los efectos de la adsorcién en una interfase aceite/agua son si ‘los de la adsorcién en interfases aire/agua. Sin embargo, cuando las enzim sorben en una interfase ya ocupada por una pelicula compacta de otra pi molécula «protectora», no parecen desplegarse y perder su actividad. La capaci de recuperacién de la forma de aceite en agua depende de de la emulsién y de las con dela disol terfases aceite/agua, puede verse de izada por adsorcién en ellas (85). La lipasa también puede inactivarse en las interfases aire/agua. X. CONTROL DE LA ACCION DE LAS ENZIMAS, la activi. En muchos casos, el cientifico de los alimentos desea (a) retardar/e dad enzimdtica o (b) acelerar/promover la accién de las enzimas. Schwimmer (144) ha discutido las muchas opciones posibles para controlar la accién de las enzimas. ion siguiente se resumen brevemente los principales métodos para controlar ividades de las enzimas endégenas y, en su caso, exdgenas, La mayor parte de estos métodos han sido tratados con mayor detalleen secciones precedentes. Para mayor informacién, el lector puede consultar la discusién, més extensa, de Schwimmer (144) A. Factores tiles en el control de Ia actividad enzimatica 1, Temperatura. El empleo de las altas y bajas temperaturas para frenar la accién de tas enzimas en los alimentos es bien conocido y ha sido tratado con d en la See. IX. 2. Contenido en agua y a,, Como vimos en la Sec. 1X, a cantidad de agua dispo- nible para una enzima y su sustrato juoga un importante paps regulacién de la actividad enzimatica. Como era de esperar, a bajas concentraciones de agua las enzimas se ven severamente restringidas en su accién e incluso pueden alterar sus patrones de actividad. 3. pHs extremos, Pueden utilizarse condiciones fuertemente dcidas o alcalinas para inactivar enzimas, reversible o irreversiblemente, ENZIMAS “AlteraciOn de los sustratos. La * etirar de ellos reaccionantes (o enzimas) no deseabi . ién del cosustrato (el oxigeno) puede ser importante para minimizar las reaccio- nes oxidasa no descadas que catalizan diversas enzimas, “Alteracidn de los productos. Los productos de una reaccién enzimética primaria dentro de una secuencia de reacciones pueden ser convertidos selectivamente en no reactivos 0 en el s Por ejemplo, la reduecién por sérbico de las quinona: a los feno- ales puede retras compu el cido terias primas, que pueden ser ut cas. Coordinando su trabajo eon el de los gen Jos alimentos puede ejercer cierto control sobre los niveles o tipos de enzimas que existen en los tejidos, Por ejemplo, el control de las enzimas generadas du- rante la germinacién y crecimiento de la cebada es de importancia obvia en la preparacién de la malta de cervecerfa. Durante aos, las vacas lecheras han sido fando de elevar al maximo la produccién de grasa Iicteay, por xr plenamente las enzimas que intervienen en su biosintsis Cuando sea posible, el bromatélogo debe aprovechar los mecanismos naturales de distribucién de las enzimas para controlarlas antes del procesado (144). Por ejem- plo, el penacho de la cana de azticar contiene invertasa, que puede hidrolizar la saca- Tosa. Por tanto, es preciso tener la precaucién de retirar los penachos de la caia para actividades invertasa perjudiciales (144). El conocimiento de estos procesos de separacién fisica en las materias primas puede ayudar al cientifico de los alimen- 10s a conseguir el maximo rendimiento y a conservar los atributos de calidad deseados. La abundancia 0 ausencia relativas de sustrato o de enzima en las materias pri- cas. El empardeamiento de los aguacates depende principalem te-de los niveles de fenolasa y no de la concentracion de fenoles, presencia de inhi ores, tipos de isoenzimas 0 cambios en las propiedades de la enzima entre las dife- Tentes variedades de aguacates. En cambio, el desarrollo del aroma de las cebollas Se produce en funcién dé la concentracién de precursores y no de la de las enzimas ue intervienen en la formacién de las sustancias aromaticas. Las dosis muy altas de radiaciones ionizantes pueden desempefiar un papel en al- terar el equipo enzimético previo al procesado de ciertos alimentos de base vegetal. Sin embargo, el nivel de irradiaci6n necesario para llevar a cabo estos cambios es 10-20 ‘eces més alto que el requerido para la esterilizaciOn y afecta adversamente a la cali- ‘dad de la mayor parte de los alimentos (144).478 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS jad de las enzimas endégenas (144) 1. Control biolégico Las actividades enzimaticas de los vegetales (y de los animales) pueden ser poten- cciadas por la administracién de hormonas, mediante pricticas adecuadas de cultivo (© de crianza) y controlando su germinacién, crecimiento y maduracién. Aunque el stress inducido por las condiciones meteorolégicas o por el agua puede dar lugar a pérdidas de calidad por las actividades enzi también puede, en algunos ca- sos, aumentarla. Los efectos del stress sobre los vegetales pueden conducir al det ro de las membranas celulares y organulares, lo que, a su vez, puede dar lugar a reac- ciones enziméticas «no naturales». 2. Control bioquimico Las actividades enzimaticas pueden ser evocadas © potenciadas a ni co por joquimi- 1. Conversién de zimégenos inactivos (proenzimas) en enzimas activas. 2. Activacién por activadores y cofactores especificos o por eliminacién de inhibidores. 3. Ruptura o modificacién de las membranas celulares, permitiendo que las enzi- ‘mas entren en contacto con sus sustratos, 4. Modificacidn de los sutratos (por ¢j., almidén) para hacerlos sensibles al ataque enzimatico. Como sugiere Schwimmer (144), los fenémenos que se producen tras la cién o el sacrificio son el resultado de una secuencia de procesos fisicos, a y-enzimaticos que siguen a la modificacién de la integr Como se representa en la Figura 23, las res permiten la ul vierten luego en productos secundarios e: cian, favorable 0 desfavorablemente, k jo con su complejo restaurar su calidad y su aroma original Lo légico es que el procesado haya destruido las enzimas, dejando disponible un ex- cceso de sustratos. La adicién de enzimas frescos del mismo alimento o de microorgs nismos apropiados pretende producir el aroma deseado mediante una adecuada mo- ficacién enzimatica de tales yOOIFICACION DE LA CELUI ENZIMAS 479, IMPACTO INICIAL XN INACTIVACION ‘COMPONENTES: DELALIMENTO + | propucTos PRIMARIOS cenzimas en los alimentos. Representacién de Figura 23. Consecuencias de la accién de tap modificacién de lainteridad de la membrana iacidn de las enzimas endégenss celular. (Reproducida de la Ref. 144). La regeneracion de la actividad de las enzimas tras haber sido inactivadas durante rado tradicionalmente no deseable. Sin embargo, Schwim- ise controla adecuadamente, este fenémeno puede ser explo- tado por los bromatdlogos para potenciar la calidad de los alimentos, especialmente de los congelados. Control de tas enzimas exsigenas Ademés de las enzimas endégenas de los alimentos, también las exdgenas, proce- is Ss) ade age gSq 382 utilizar, expresada en poreentaje respecto al alimento atratar, varia, en general en A oe cea gee 53 tre 0,082 y 0,00000026 %, dependiendo del efecto que se desee y de la concentracién i i gis Sag 2." 555 de la enzima en la preparacién, Asi pues, normalmente se precisan cantidades extre- £ ZEs zed Sen 383 madamente pequehas de enzima, 2 252 ae aaa 2 Tho pancetco animal ——ydacigicwsen scaly robin talon ta boss egos 3 Aspens oem vars dos rs ites Goch concede de eke depos) 4 Aaperts miter ar i 1, Ordo mutase a Cain 1 Ae ie va hOi—e aH:O + 0; iin eH, esd as eset 2 Mirren hod te i each ya rade he iin : Mende io ST Ws01 ave ea dea ab de ase oss 1. Glo oxida Asperger vt. Geom + Or-#e sito ina arte eos hos pr ta ‘catalasa ae ‘empardeamiento y ts aparicién de aromas ain + 101 Snore un sa detain: ina Oy dee bets ior de ns ami0.s##62140 + 0: fain para ea on tomar armas 9 Jar la estabilidad durante el almacenamiento; rnejora el color y a textura de los productos tratados al horno y Iss propiedades mecdnicas Lipoosigenasa Haina de soa Linoleato (y otros cidos ‘sos polinsaturados 14pen- tadienoicos) + 0; —- LOOH {os hidroperxidos decolran lor carotenahes en el pan y oxidas los grupos til del gluten mejorando las propledades reokipicas ls (crepes) fortes ¥, tomers 2 Gon omen 1 Aeinopane a microns Choos frcona———_Comvert a acon en fracas en a pegrt 2. Bacillus coagulans idm de med clon de uabes de mals de cloado conta 3. Streptococcus olivacens Xilosa_ xilulosa, ‘en fructosa, oe 4. Simpiococeus ovochromogenes 5. Streptococcus rubisinosus svwiza488 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS que continie su actividad para que desarrollen el aroma y la textura deseables, pero. nunca se reutilizan. Del mismo modo, en aplicaciones ans una sola ver y para un solo andlisis. Los recientes avances en la tecnologia de las enzi- mas han conducido a la preparacién de enzimas, células microbianas u orgénulos ce- lulares inmovilizados que, en principio, pueden ser usados repetidamente en opera- ‘en sus movimientos, de tal forma que puede ser fisicamente recuperada del medio de reac ino, el control de la formacién de productos, la mayor variedad de disefios para procesos cor ite y 1a posibilidad de una ma- yor eficacia en las reacciones en varias etapas consecutivas. Ademds, la inmoviliza- cién hace también posible modificar selectivamente las propiedades de la célula 0 cenzima, En principio, las enzimas, las células microbinas y los orgénulos celulares, tanto s, pueden ser inmovilizados por uno de ss cinco métodos generales 1. Enlace covalente a una matriz insoluble. 2. Inclusién entre las mallas de un gel o (micro-encapsulacién con membranas semipermeables. 3. Adsorcién sobre una hidrofébicas y de afinidad. 4. Entrecruzamiento para formar agregados insolubles. 5. Adsorcién seguida de entrecruzamiento. icluyendo la adsorcién por interacciones El grado de utilizacién de las enzimas inmovilizadas en las industrias alimenta- ras es bastante decepcionante en comparacién con los grandes esfuerzos realizados para explotar esta tecnologia. Existen nes obvias en su empleo, entre ellas 10s liquidos com- icin de queso (170), tuyentes del alimento que poseen actividad superficial, espe- las proteinas, lo que impide estéricamente la interaccién enzima-sustrato. de un reactor de enzimas inmovilizadas puede resultar por ello demasi do corta para que sea rentable econémicamente. La aplicacién de enzimas inmovili- zadas al tratamiento de sistemas alimentarios complejos, tales como la leche, es, por €l momento, menos prometedora que su empleo en los sistemas mds simples. Otros factores que pueden dar lugar a un descenso en la actividad de las enzimas inmovili- zadas durante su uso son la presencia de sustancias inhibidoras en algunos alimentos y la separacién de las enzimas del soporte. ENZIMAS 489 adas. Esto resulta especialmente difi- las favorables temperaturas de opera- de microorganimos indeseables. Los ios concienzudamente, utilizando, ademas, desinfectantes, vos sobre las enzimas inmo- reactores deben ser limpi Evidentemente, el desifectante no debe tener efecto: vilizadas en cuestién. ‘Se han utilizado con este fin algunos desinfectantes de calidad alimentaria, como el perbxido de hidrégeno (139). Desde luego, los pocos sistemas de enzimas inmovilizadas que han sido comercia- lizados se han obtenido por procedimientos de inmovilizacion simples, fables y at6- xicos y se aplican al procesado de disoluciones de sustratos relativamente Desgraciadamente, la mayoria de los numerosos métodos de inmovilizacién de enzi mas son demasiado ineémodos, ineficaces 0 costosos ¥/o emplean productos qui i6n, es bastante dif das, pero se han hecho algunos céleul B. Aplicaciones de las enzimas y células microblanas Inmovilizadas en los sistemas sllmentarlos En Japén se ha obtenido cierto éxito en la aplicacién de enzimas y células bianas inmovilizadas a diversos procesos (172). En menor extensién, la teamericana también ha explotado est La Tabla 6 resume las a nes comerciales conoci las enzimas inmovilizadas. 1. Células microbianas vivas inm: {ructivo para atrapar células viables en un de uso comiin en la industria alimentaria ara la obtencién de muchos product s (Tabla 7) y en la detoxicacién de resi os industriales (Tabla 8). Hagerdal (72) ha postulado recientemente la coinmov’ zacién de enzimas con células microbianas. La enzima inmovilizada seria utilizada Convertir el sustrato inicial, resistente al ataque de los gérmenes, en compuestos ido, todo ello se deduce que la inmovilizacién de microorganismos vivos puede ofre- er a la industria alimentaria nuevas posibilidades de tratamiento,490 ‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Tabla 6. Aplicaciones comerciales de las enzimas inmovilizadas en las industrias alimenta: rias y relacionadas (20, 134, 197, Enzimas 0 células inmovilicadas Sustraros Leaminodcidos ios + Ha0 uumarato + NHy ——Laspartato Aminoacilasa Fumarasa Fumarato + HO Lemalato Brevibacterium ammoniagenes ‘Glucosa isomerasa D-glucosa D-fructosa Streptomyces sp Bacillus coagulans Actinoplanes missouriensis Arthrobacter sp @-Galactosidasa Rafinose Dezalactosa y ‘Tabla 7._Produccién de compuestos tiles empleando células microbianas vivas inmovillzadas. Soportes para la Compuestos utiles Cétutas microbianas inmovilzacién Etanol Saccharomyces carlsbergensis Carrageno Saccharomyces cerevisiae Poliacrilamida Cervera Saccharomyces carlsbergensis Cloruro de polivinilo Saccharomyces cerevisiae Alginato céleico Lisoleucina Serratia marcescens Acido acttico Acetobacter sp. ‘Acido LActico Cultivos mixtos de lactobacilos y levaduras Arthrobacter oxidans Poliacrilamida Acido a-cetoglucénico Serratia marcescens Coligeno Bacillus sp Polneriamide Clostridium butyricum Rhodospiriliium rubrum Fuente: Ret 28. -ENZIMAS 491 1. Descomposicién de compuestos téxicos mediante células microbianas vivas inmo- Compuestos Soporses pore toxicos Cétulas mierobianas __inmonilizacion os Fenol Candida tropicalis Benceno Pseudomonas putida vo mixto de ‘Agua residual Micrococcus denitrificans Pseudomonas sp ___Carbén activado Desnitrificacién Fuente: Ref. 28 2. Encapsulacién La retencién de enzimas solubles de lisados microbianos en unidades de ultr zar las proteinas del retenido a péptidos y aminodcidos, que pueden luego ser recupe- rados en el permeado de UF. Greco y col. (67), han propuesto recientemente el uso de una célula de UF como reactor plurienzimatico en el que una serie de capas de varias enzimas podria ser inmovilizada sobre la membrana de UF para llevar a cabo de reaceién complejas. Olson y colaboradores (103) estan desarrollando un sistema para la maduracién de queso en el que extracios lulas se encapsulan con sus sus- tratos y cofaci Seheryseadaorohatioen Raper de enzima, sustratos y cofactores permite la potenciacién y la Tegulacién del desarrollo del aroma en el queso. 3. Anilisis de alimentos ‘de un producto. La incorporacién del adecuado permite registrar su respuesta. Se han puesto a pul492 (QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Los sistemas de inmunoensayo enzimético (enzyme inmunoassay, EIA) reci lados sobre la base de las especificidades enzimas como indicadoras, mas que como reactivos especificos de su sustrato (144). La técnica representa un cambio de concepto respecto al bien conocido radioinmu- noensayo, y permite cuantificar cantidades traza de los componentes de los alimen- El inmunoensayo enzimatico se basa en el desarrollo de anticuerpos especificos para el analizado. No es necesario que el analizado mismo sea antigénico; normal- ‘mente puede adquirir antigenicidad siendo acoplado co\ antigénica. Pueden obtenerse, en un animal adecuado, anticuerpos contra compues- tos no antigeni i se inyectan en forma de iad comercial de estos compuestos hapténicos, itada. Por otra |A cs la competencia entre el analizado y el complejo analizado-enzima por el anticuerpo (144), ky Analizado 4 (analzadoensima) + antcuerpo ==> (analzade-ancuero) 2 + (analizado-enzima-anticuerpo) ky >> ky (79) lizado acoplado a la enzima indicadora (analizado-enzima) interacciona es- pecificamente con el anticuerpo, lo que inhibe o evita la reaccién de la enzim iversas deshidrogenasas, lisozima, lactasa, fosfatasa al- tema el analizado problema, compite cuerpo. En ausencia del compuesto a ado al anticuerpo en el grado méximo posible y, por tanto, la actividad enzimatica serd minima, A medida que aumenta la concentracién del compuesto problema, queda disponible para reaccionar con el ial del compuesto a analizar, resultante seré proporcional a la cantidad del ‘analizado problema. Por tanto, partiendo de una gréfica de calibracion adecuada pree parada con concentraciones conocidas del compuesto a determinar, puede obtenerse n, ademds, diversas variantes (144). Si se incorporan istopos radiactivos al sis- tema, pueden efectuarse andlisis por ELA ultrasensibles (144). ENZIMAS 493 4, Dispositivos de control han disentado XII, MODIFICACION DE LOS ALIMENTOS POR ENZIMAS ENDOGENAS ccausan deterioros indeseables o fermentaciones beneficiosas, las sustancias q endégenas, que sufren cambios, como la autooxidacién, y las enzimas endégenas, ue producen numerosas modificaciones, deseables e indeseables. Las alteraciones icas pueden abarcar areas enteras de la ciencia de los alimentos, como la fi- de las plantas tras su recoleccién o la fisiologia postmortem de los . La maduracién de las frutas o la conversién del miisculo en carne, p \n el resultado de complejos cambios bioquimicos catalizados por enzim: reacciones bioquimicas implicadas en estos procesos se discuten en los Capitulos 12 ¥ 15,y en textos especializados (50, 80, 96), por lo que no es adecuado tratar de aqui. En esta seccién se considerardn tinicamente las enzimas endégenas de Primordial para el bromatélogo en cuanto a modificaciones del color, textura, olor ¥ valor nutritivo de los alimentos. Por tanto, esta discusién se limitar& pr 2 las actividades de las hidrolasas y oxidorreductasas, y sOlo las més importat rn estudiadas en detalle, Pueden encontrarse tos de las enzimas endégenas en el textd de Schwimmer (144). As Enzimas pécticas (5, 35, 128, 129, 133, 1 , 144) i. 24). Los polimeros altamente esterificados (pectinas muy metoxiladas) son los mejo= 7S sutratos para las pectina liasas (pectintransel494 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS ee c06CH,; = cooH coocHy —coocHy recinesasa coocls 0, Pectina asa coon coon 0, 0. OH OK on oo on oe 00H coon coon coon °, eee ao, on LOKon eon a Kol on on om ba be Polgaactrorasa coo coon coon coon 0, oe °. °, Kon DeKon be" —= Kon Gon Lo” on on ou oe 4 Pecit isa goo, covers Gooey co0es 3. hee 3 0 “Kon Kon bo” = KG nr ho” ons os on oe on Pecina tase ‘Figwa 24. Degradacién enzimética dela pectina por la poligalacturonasa, pectato Hasa, pectina. ENZIMAS 495 idicos adyacentes a un éster metilico por una reaccién de f-elimina- tos enlaces gli 24). Son produci- ‘cidn, dando un doble enlace por cada enlace glicosi das, en general, por hongos y no se encuentran en bact ‘Las pectinas en las que los grupos metoxilo has (pectinas poco metoxiladas) o completamente (écido s sustratos para las pectato liasas. En este caso, la ugar en una posicién adyacente a un grupo carboxil tenzimas tipicamente bacterianas. Sélo unos pocos mohos las producen y no existen en los Vegetales superiores. Las pectin esterasas retiran el etanol de los grupos carboxilo esterificados, dan- 4o lugar a pectinas poco metoxiladas y dcido poligalacturénico. Junto con la endo- fonasa, que hidroliza los enlaces glucosidicos internos, la exopoligalactu- hidroliza los externos, y las pectato liasas, la pectinesterasa completa una mezela de enzimas capaz de despolimerizar las pectinas altamente esterificadas. ‘Como las sustacias pécticas son elementos estructurales de las capas intermedia jores, las alteraciones en su grado ‘cambios en la textura de las fru- 10 0 durante su pro- cesado. Las pectinesterasas y poligalacturonasas nativas de la planta pueden alterar las sustancias pécticas endégenas. Las enzimas pécticas exdgenas, producidas indus- trialmente a partir de hongos, son utilizadas para facilitar el procesado, principal- ‘mente en la extraccién y clarificacién de zumos. Las enzimas pécticas de los microor- ganismos pueden ser responsables, en gran parte, del deterioro y la putrefaccién tras la recoleccién, asi como de los cambios de textura que tienen lugar en ciertas frutas y verduras frescas. Por todo ello, las enzimas pécticas poseen un gran interés para la ciencia de los alimentos. Los efectos de las pectinmetilesterasas sobre la textura irectos: desmetilan los grupos carboxilato de las sustancias pécticas, permi- tiéndoles participar en reacciones de entrecruzamiento, via el Ca? , que incrementan la firmeza de productos tales como las judias verdes B. Amilasas (38, 133, 144, 164) Son enzimas que hidrolizan el almidén. Dos de ellas han sido est detalle, la a- y la -amilasa. La a-amilasa, una endo-enzima, |.4-glucano, aparentemente al azar. El ataque al azar de la o-amilasa sobre la amilo- sa en disolucién da lugar a un rapido descenso en viscosidad y en su capacidad de rodueir un complejo coloreado con el iodo, as{ como un aumento en el poder reduc- tor por la aparicién de grupos reductores. Dado que basta romper unos pocos enla- ‘es glucano internos para provocar un gran descenso en la viscosidad, los efectos so- bre ésta son proporcionalmente mayores que el aumento en capacidad reductora. iin embargo, los pun- dos, por lo que se forma una pequefta can- estos enlaces a-1,6. tidad de panosa, el trisacdrido que conti Esta amilasa suele ser denominada «enzima licuante», debido a su répida accion en reducir la viscosidad de las disoluciones de almidén. El tratamiento de la amilosa © la amilopectina con a-amilasa da como resultado una mezcla de maltosa, glucosa496 ‘QUIMICA DE LOS ALIMENTOS y también una cierta cantidad de panosa si la reaceién continia durante un largo periodo. La B-amilasa es un exoer de almidén. Mas espe I de las cadenas Como la mal- disolucién de almidén, la G-amilasa se denomina El término en la 8-amilasa hace referencia a la inver- n del enlace a-1,4 del almidén a la configuracién 8. No ataca los enlaces 1,3 que aparecen ocasionalmente en la amilosa ni los 1,6 de la amilopectina, lo que da lugar ‘que la degradacién del almidén sea incompleta. Si se encuentra presente una enzi- ma capaz de romper las ramificaciones, la actividad de la 6-amilasa continuara. Con Ja amilopectina, la actividad de esta enzima se detiene dos o tres antes del punto de ramificacién, denomindndose a las mole nas limite». Se sabe que la 8-amilasa existe s6lo en los lasas son importantes en la madus jarabes y aziicar de maiz, en general, la hid para la post ‘én por microorganismos, azticares reduct pardeamiento no enzimati textura, la palatat F de los alimentos afectados. Las ami- lasas endégenas de la malta de cebada y del trigo juegan un papel crucial en la pro- duccién de cerveza y en la panificacién, con frecuencia actuando en conjuncién con. otras carbohidrasas endégenas y exdgenas (144). C. Catepsinas (38, $1, 119) Las catepsinas son proteinasas intracelulares de los tejidos animale ‘cidos. Estas enzimas se ingue de otras proteasas, como la tripsina y la quimot por las cé Se han descrito cinco catepsinas, designadas con las letras A, B,C, Dy E (119). Ademés, se ha aistado también una carboxipeptidasa catéptica, Las catepsinas pueden estar implicadas en los cambios observados durante el en- vejecimiento de las carnes, Son liberadas de los lisosomas de las células musculares al reducido pH del tejido postmortem y, presumiblemente, se difunden a través del jido determinando la ruptura de las miofibrillas y de los tejidos conectivos extrace- ares, como el coldgeno. Son especialmente 1D. Proteinasa neutra activada por el calcio (CANP) (38, 51, 163) Esta enzima (calcium-act nasa, que requiere un grupo ha sido estudiada princi se encuentra.a con: damente 6. Es posi iciones bajas, y puede operar a pHs por debajo de aproxima- le que la CANP del musculo contribuya al ablandamiento de ENZIMAS. 497 Jas cares provocando la ruptura de cierta proteinas miofibrilares especificas, lo que daria lugar ala desintegracién de los discos Z y a dafos en las lineas M, las proteinas enlazando os filamen- tos finosy los gruesos, espectivamente, El tipo de CANP aislado inicialmente se ac- tiva por el Ca?* y el Mg?” a concentraciones milimolares, por lo que las coneentra- ciones de estos iones en los tefi a un-grado significative. Sin embargo, se han aislado recientemente tipos de CANP ac- tivados por concentraciones micromolares de Ca** , que es mas probable sean act jo muscular postmortem y que puedan actuar, durante la conversion del nasa alcalina de a serina, con una espe- Esta proteinasa esta estrechamente relacionada la plasmina de ta sangre. Hi a 6-caseina dando lugar ‘a y-caseinas, mas hidrofbicas; puede hidrolizar también las a,-caseinas, pero no la sccaseina, La proteinasa de la leche contribuye a la proteolisis durante la maduracién del queso y, por ser relativamente estable al calor, puede part aelificacién de la leche UHT. Su funcién de convertir la @-caseina en 7-caseina puede proteinas lécteas en varios pro- 5 2 Monoacillicerol (80) 2,3-Diacilglicerol Sin embargo, hay excepciones dependiendo de la especificidad, tanto posicional ‘como respecto a los dcidos grasos, de la enzima. Esta secuencia de reaccién corres- Pende a las lipasas con especificidad Por el éster primario, que parecen ser el tipo Predominante. Algunas lipasas, no obstante, atacan al enlace éster en cualquiera de Jas tres posiciones, sgEttY Cuatro tipos de especificidad asociados alas lipasas: de aciglicero, de pos ‘in, de écido grasoy estereoespecificidad. La especificidad de acillicerolsecaracte-bse QUIMICA DE LOS ALIMENTOS riza por mostrar preferencia por sustratos de peso molecular alto. ciemplo mejor conocido de especificidad posicional es el de la lipasa pancreé- ue hid te los ésteres primarios de los triacilgliceroles. Las prepa- izan los acidos grasos de las posiciones primaria y secun- iceroles, probat ienen mas de una enzima, tal vez una cilgliceroles de bajo peso molecular respecto idénticas moléculas de tr dad de dcido graso de la de aé Se trata de la especificidad or el cide ol cin en la molé lizado preferentemente con independencia de su posi- cerol, Sin embargo, libera también pequenas cantida- liceroles pue- 'minar la aparicion de sabores y olores deseables o desagradables. La lipasa ipoproteinas de la leche tiene una enorme importante porque libera Acids grasos de cadena corta a partir de la grasa lactea, dando lugar a su enranciamiento hidrolti- co (39, 58) 2. Fosfolipasas (138) Existen diversas fosfolipasas que reaccionan con los. zan los grupos acilo esterificados en las posiciones sn: lados del grupo fosforilo [Ec han sido realizados con 3-sn-fosfatidileolina (I folipidos responden de un modo similar si las las necesidades del sistema, icerofosfolipidos. Hidroli- mes de hidrélisis se ajustan a c—R, (1) de estos enlaces éster son denominadas fosfolipa- ratura pueden encontrarse también otros términos, La fosfolipasa A, llamada ahora lecitinasa A o fosfolipasa Az 0 fosfatido acilhi- drolasa (presente en los venenos de serpiente y abeja), hidroliza los grupos éster en ENZIMAS, 499 EI compuesto resultant ina y posee una fuerte actividad de supert 1, por lo que es designada como fosfolipas tinasa B, hidrol adecuadas. Las preparaciones de fosfolipasa A2, por lo que serdn atacados ambos grupos ac cuentra normalmente en colina, dando lugar a posicién 2 de los glicerofosfc nasa y dan lugar a cambios en el aroma de I del sabor y olor en los alimentos vegetales afectad ten los pescados congelados puede dar lugar a modifieaciones per tura (144), G, Tiaminasas I y II (15, 18, 144) En algunos alimentos existen enzimas que degradan la ti actia como una transferasa que cataliza la escisiOn de la tiamina, usando aminas co- ‘mo cosustratos: Pir—CH;—Tiaz* + R-NH;——*Pir—CH:—NH—R + Tiaz + H* (82) ina Amina ya: (83) La tiaminasa Il es una hidrolasa que cataliza la hidrolisis de Pir—CH.OH + Tiaz + H* Pir—CH,—Tiaz + H;0 sn muy comunes entre los peces de agua dulce y en muchos de los de origen marino. Estas enzimas son parte intrinseca de la carne o bien aparecen en ella accidentalmente a partir de microorganismos, En la ‘mayor parte de los casos se inactivan durante el cocinado. Entre los pescacios que poseen actividad tiaminasa cabe citar los siguientes: Caplin, arenque, sébalo, aguja, pescadilla. 108 de truchas, foxino Las enzimas con actividad tiaminas Especies marinas: Especies de agua dulce: Carpa, coto, ciertos Muchos mariscos poseen también actividad tiaminasa I. El consumo de pescado y marisco erudo, de arenques salads 0 curados y de pro- dluctos de pescado fermentados y no sometidos a tratamiento térmico, que se practica ‘en Asia, puede contribuir a la aparicién de enfermedades por déficit en tiamina, co-500 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS mo el beri-beri, o, al menos, incrementar las necesidades dietéticas de esta vitamin, Se ha demostrado que, si se aftade tiamina a preparados de arenque salado, al cabo de 6 horas se ha destruido un $0-60 % de ésta. ‘Ademas del pescado, algunos productos vegetales presentan actividad tiaminasa, Los helechos son especialmente ricos en tiaminasa. También se ha descrito esta enzi- ma en el arroz deseascarillado, en las judias secas y en la semilla de mostaza. Las personas que se alimentan exclusivamente de arroz, es probable que no cubran sus H. Fitasa (144) El Acido fitico, mioinositol-1,2,3,4,5.6-hexadihidrégeno fosfato, se encuentra muy difundido entre las plantas como reservorio de fsforo y existe también en la sangre de aves, anfibios y reptiles. Se cree que La fijacién de minerales en complejos proteina- ciales para la actividad enzimética (por ¢., Ca? *) (150). El significado fi de estas observaciones es oscuro. la iroliza los residuos de fostato del dcido fitico, detruyendo, por tanto, la esencia de su fuerte afinidad por los minerales. Asi pues, la fitasa puede aumentar nerales y alterar la textura de los alimentos vege- en las plantas, aunque se enctent te, se ha propuesto control endégenas mani Peratura y ay para reducir los niveles de dcido fitico en los 1 egetales (144). Eventualmente, las fitasas de origen exdgeno podrian ser también utiles con el mismo fin en los alimentos de base vegetal 1. ATPasa de la miosina (107, 120) Esta enzima parece jugar un papel clave en el acortamiento por el frio y en el pleerde denrenesinchiie, ene Gteetan 6 4 Gules ¥ Caneeaed @xeunda Gee ENZIMAS so. cién como el pueden ser atribuidos a la jco (un entramado de tibulos extremadamente fino que se extiende a través del i para retener el Ca?” . El Ca? funde a través de las proteinas contracticles, donde libera, a su ver, adenosina (ATP) de su complejo inerte con el magnesio y estimula a la ATPasa de Ja miosina, La consiguiente hidrétisis del ATP proporciona la energia necesaria para -cién muscular. Para mayor informacién sobre este tema, véase el Capitulo 12. J, Pardeamiento enzimatico (50, 98, 133, 144) to la oxidaci6n del dcido ascOrbico y el pardea- rmiento por la fenolasa. Los tres primeros no son de naturaleza enzimética (la oxida- cign del écido asc6rbico es catalizada por enzimas en algunos casos) y no serdn trata io por Ia fenolasa o enzimatico (pardeami izado por enzimas) tiene importancia comercial, particularmente en frutas y leoumbres, que suelen contener fenolasas (144) En el tejido Ios sustratos fendlicos se encuentran separados de la fenola- we no se produce pi >. Se observa éste en las superficies de corte mas que 25, polifenol oxidasas, tirosinasas o catecolasas. La cl es confusa y controvertida. Schwimmer (144) prefiere referirse genérico de «fenolasas». Las fenolasas que han sido aistadas de alimentos son olig6meros y contienen tn tio de cobre por subunidad. Se produce pardeamiento si los tejidos de a planta han sido sufientemente dafados y hay oxigeno y cobre. Las operaciones de las con el nombre Como muestra la ailaci6n A (ae ‘ortoquinona. Con tirosina como sustrat ‘én a DOPA y, en una segunda etapa, la n incluyen oxidaciones no enzimati- 6-quinona a pigmentos meténicos pardo, Las melaninas pueden, ademés, interaccionar con proteinas, forman- do complejos. La hidronilacion de los mono enoles es la etapa limitante de la veloc dad. Por lo tanto, los monofenoles sufren la lenta reaccién de hidroxilacién antes de 5 oxidacién a ortoquinonas. Por otra parte, algunas de las fenolasas, como la del02 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS ENZIMAS 503 1 tabaco y los boniatos, no hidrolizan los monofenoles. La de las setas y la de jHcxcH-COOH COOH on las patatas ciones. Aunque la tirosina es uno de los sustratos prioritarios para ciertas fenolasas, tame bién son aceptados como tales otros compuestos fendlicos de las frutas, por ejemplo, los dcidos cafeico y clorogénico. Estos compucstos son (Fig. 26) ortodifenoles, ffi. el componente catecolasa de la fenolasa. Sin embargo, como puede wo} on on on froon on on $ a hate do-cncnl \-on EK PROTOCATEQUICO cAFEICO ACIDO CLOROGENICO ceatéquico no es oxidado en absoluto. Los dos cn la mayor parte de los tejidos vegetales son En general, la fenolasa es activa entre pH 5-7 y no tiene un pH éptimo muy defi- nido, Se inactiva irreversiblemente a valores de pH menores de aproximadamente 3, ‘También Ia inactivan los reactivos que forman complejos con el cobre o lo.retiran de la enzima, El pardeamiento inducido por fenolasas constituye uno de los principales facto- res en el desarrollo del color deseable de algunos alimentos, tales como sidra, té y Figura 26. Algunos de los o-difenoles aceptados como sustratos por las fenolasas. indeseables en frutas ¥ verduras porque los colores pardos que producen no son agradables. En consecuencia, se han desarrollado diversos métodos para inhibir el pardeamiento enzimati ponentes esenciales, es d ’ TIROSINASA og ae ea Para la inactivacin de | 0 ng ee ee aplicacién de diido de azufeosulfios. Su Hola? -bicoo Tuy LENTA™ Hol dxcoon Fusion” 0A neon cidn de la cantidad suficiente de un x ees x x “onl ea eee rete can El oxigeno puede ser excluido del sistema por envasado a vacio 0 sumergiendo los " ae tejidos vegetales en una salmuera 0 en un jarabe azucarado. Los sustratos fendlicos é [Panion Pueden ser protegidos de la oxidacién por reaccién con boratos, pero st uso Ho on 0 entos no esté autorizado. Ho J+ C2 FetarivAMENTE mea RAPIDA HO 500K LENTA ee " ¥ q . q S6.01KIDROXINDOL HALACROMO (ROJO) LEUCO DERIVADO PAPIDA + 0 . s Tabla 9. _Accidn de la fenolasa de albérhigo sobre varios sustratosfenslicos Cha a 2 CK dk es ee Soar (MEUANINA = = 222 J en od x oH ERNAMENTE 8" ph 62 My __Aerividad INDOLS.8.QUINONA AGIDO 5.6.D\HIDROXIINDOL ont 2.CARBOXILICO. on OOTP 4 5 Oy Feet 2T Dap) 2 ia eo sen" x = nas ‘Acido ferilico ° t ‘ ‘Acido protocatéquico ° pate ick anes oP HALACROMO Deatequina 250 o ° Figura 25, _Formacién de pigmentos melinicos como resultado de la oxidacién dela tirosina por la fenolasa. (Reconstruida de la Ref. 98, por cortesia de a American Physiological Society). uence: Reproducida de ia Ref. 102 por corteia dl Intute of Food Technologiesos QUIMICA DE LOS ALIMENTOS K, Lipooxigenasas (4, 62, 133, 167) gumbres y unos pocos vegetales mds, pero es ahora jamente difundidas en los reinos vegetal y animal (62). Las LOX vegetale: cu ‘guisantes y los cacahuetes; en los cereales, como el arroz, el trigo, la avena, el centeno y en las frutas, como las peras, las manzanas, las fresas y los tomates; y en las patatas (62). En los animales, estas enzimas aparecen principalmente en los teji- izados, como en lo y en ciertas células de la serie blanca, yen un grupo de enzimas heterogéneo y diverso, En, i varias isoenzimas; por ejemplo, la soja cor isoenzimas en su especi las lipasas pueden liberar dcidos grasos, proporcionando asi sustratos para'las LOX ‘que utilizan como tales los acidos libres. ‘Ms en concreto, las LOX oxigenan estereoespecificamente los dcidos grasos po- insaturados y/o sus ésteres y los acilgliceroles que contienen el doble enlace cis, 4-pentadieno localizado entre los carbonos 6-10 a partir del extremo metilado. Por tanto, los productos de esta reaccién son, necesariamente, hidroperéxidos Opti- camente activos. Con el dcido linoleico, los principales productos de oxigenacién son los isomeros Spticamente activos del 9 y el 13-hidroperéxido. wean et i CHy-ICHylg-C—C-CHy-C=C~ICHgl-COOH Acido 9-D-ridropereni = 10 = (trans) \ stadecaaienoco 40) \° a. oH rit (CHy(CHp)q-C-C=C-C=C-ICH 9) ,-COOH. hoo ciao cio 19Lhiroperox! = Wcis\*t = (rans) = Cetadecacionoice Se cree que la enzima extrae primero estereoespecificamente un dtomo de hidro- geno de la posicién 11 de la molécula de acido linoleico y aftade luego estereoespect- ficamente uno de oxigeno a uno de los dos lados (9 para dar un hidroperdxido épticamente activo. La re meros 9 y 13 producidos puede variar dependiendo de do, Ademds, las diversas isoenzimas de LOX existentes en la misma planta pueden atacar a los ésteres y a los triacilgliceroles con preferencia a los dcidos grasos, dando ENZIMAS, 505 \droperdxidos. No obstante, los resul tados obtenidos al estudiar la formac jmeros por las LOX pueden ser det fos, si las condiciones de trabajo no se controlan correctamente, a artefactos por futooxidacién del sustrato y por la isomerizacién no enzimatica de los hidroperdxi- dos resultantes. ‘se sabe ahora que, al menos la LOX de soja, necesita un étomo de hierro no he- mo en el centro activo. Por tanto, esta enzima cataliza la oxidacién via un ciclo redox gobernado por el oxigeno y por el sustrato poliinsaturado. ‘La Figura 27 presenta un posible mecanismo para la oxigenacién de los acidos ‘grasos poliinsaturados. El estado del oxigeno involucrado en la actividad LOX es os- podria ser el de superdxido inm LOX tienen importancia préctica para » que pueden sufrir peroxidacién por LOX. El desarrollo de olores anormales en la soja y derivados es altamente depend de la accién de varias peroxidasas endégenas, pu \dados es debida a la LOX; los fallos en el escaldado de los ne esta enzima pueden dar lugar a un répido desarrollo de olores andmalos. En el caso de los guisantes, la fuente primaria de los carbonilos que imparten los olores no deseables puede ser una isoenzima de la LOX que soporta bien el almacenamiento (disponen también de otras que se inactivan durante éste). Por lo tanto, para minimi- zar la actividad de estas y otras enzimas en las verduras, es preciso escaldarlas antes tarlas. Es importante record imento puede afectar a su respuesta al cal el centro que en la iad peroxidasa es mas de olor desarrollado en los alimentos afectados puede reflejar la disponi dad de un dcido graso determinado y los carbonilos especificos que resultan de los diferentes procesos de descomposici6n de cada uno de los isémeros de los hidroperé- ‘idos (144). Los productos de la actividad de las lipooxigenasas pueden, asimismo, sufrir otras transformaciones secundarias, enzimaticas y no enzimaticas, para dar lu- E-Fe*L00" ¢—_________ &-Fr**Loo- Figura 27. Mecanismo propuesto paral hidroperoxidaciGn del dio lnoleco por aenasa de soja (Efe). (Reproducida de la Ref. 62), ipoo-506 (QUIMICA DE LOS ALIMENTOS ENZIMAS, 07 gar a una amplia variedad de productos que ejercen efectos muy marcados sobre la Las lipoxigenasas pueden ejercer un efecto, no deseable, de decoloracién de calidad de los alimentos, los cambios en la calidad de los alimentos en los que i ipooxigenasa. Tabla 10, Resumen a indirectamente, A. Cambios de color. De hecho, la reaccidn catalizada por la LOX es tan destructiva que la enzima se inac- tiva a si misma por un proceso de primer orden respecto a ella (154). Se cree que las LOX del trigo ejercen un importante efecto sobre las propiedades reoldgicas de las pastas de harina. Ademas, las harinas de trigo suelen ser suplemen- tadas con harinas de las verduras cong Destruccidn de la xan ‘dad de los piensos, (n0 deseable). ademas de como mn de enlaces disulfuro por imbio tiol-disul que intervienen los A la vez, se dos que, se supone, ‘an la formacién de la pasta asegurando de algin modo la retencién de gas du- rante la expansién de ésta en el horno (144), ‘Quemaduras superficiales en las manzanas sometidas a almacenam B. Cambios en el sabor/olor, Producci6n de componentes volatiles espoi dluras frescas, tales como tomates, judias secas, plétanos Produccién de sabores/olores anormales en las verduras cong alimentos procesados, Produccion de L.Peroxidasas (133, 144) Las peroxidasas constituyen un ubicuo grupo de enzimas, presente en todas los superiores que hat ads y en los leucocitos. Existe también una ‘mejores fuentes de esta enzima conocidas (58, 84) De las peroxidasas vegetales, la que ha sido estudiada més ampliamente es la del rabano, Las peroxidasas suelen contener un grupo pro: 1X). No obstante, también pueden utilizar otros grupo: Catalizan la siguiente reaccién: Produccidn de efectos favorables sobre las propiedades reoldgicas hharina y,eventualmente, de los product SS-SH y de la fijacin hidrofdbica de los lipidos al gluten. D. Cambios en ta calidad a Destruccién de la vitamina A y de su provitamina. Destruecién de los acidos grasos poliinsaturados esenciles para la nutricién. Interaccin de los productos dela actividad enzimatica con algunos aminodcides esencia- les, reduciendo la calidad nutritiva de las proteinas y su funcionalidad, emo (ferriprotoporfirina 144), ROOH+ AH) —+H,0+ RON +A (85) El proceso catalitico de la peroxidasa parece producir la oxidacién transitoria del E nes in vivo. : jon férrico (Fe?) a estados de valencia mas alta (Fe! * o Fe**), El perdxido (ROOH) isin en 8 blogénss de etilenocreando el oxigen activo necro para conser uede ser perdxido de hidrégeno o un perdxido orgénico, como el metil o etl perdxi- cot Deters no do componda See. oe hidrogeno, En la DerSxido se ve reducido a la vez que re- mn de cartenoides en fel crecimiento de Ia planta, sulta oxidado un donador de electrones Pueden operar como tal el ascorbato, Conversion del écido araquidénico, Acido graso insaturado mamario, en hidroxicidos los fenoles, las aminas y otros compuestos organicos. Destruccidn anaerdbica de peréxidos en los tejidos lesionados, osee, en muchos casos, una coloracién SS See I U8 Colorimétrica de Fuente: Ref 144, ‘ de peroxidasas '2.o-dianisidina, aunque ha de sefalarse que es de compuestos pueden ser can-ICA DE LOS ALIMENTOS 508 ou cerigenos y deben manejarse con cuidado. Estas reacciones coloreadas de las peroxi- de glucosa mediante la te modo: slucosa onidasa dcido glucénico + Hi02 (86) Glucose + O2 El HO; puede ser determinado mediante la reaccién peroxidasa, con lo que, a partir de la estequiometria de la reaccién glucosa oxidasa, puede calcularse la con- ‘ra ampliamente difundida en I nada por prucbas colorimé cador de la eficacia de los tratamientos térmicos subes s. Se acepta que ruccién de la peroxidasa va acompafada por la de todos los demas enzimas de terés. de vista del valor nue dad peroxidasa pue- de producir la destruccién oxidativa de la vitamina C (13). Asimismo, se ha demos- trado que la peroxidasa cataliza la decoloracién de los carotenoides en ausencia de dcidos erasos insaturados (7) y la de las antocianinas (68). La peroxidasa, como la mayor parte de los pigmentos hemo, cataliza la degradacién peroxidativa no enzimé- tica de los 4cidos grasos insaturados, produciendo carbonilos volatiles de fuerte aro- uuyen a Ia aparicién de olores a oxidado. Al parecer, los pigmentos hemo, como el de la peroxidasa, catalizan la descomposicién de los con formacién de radicales libres, como se indica en la Figura 28 libres producidos pueden provocar la destruccién de una amplia v P) puede jugar un papel particular- dos de la leche y como componente aos lipidos. Estas enzimas se encuentran en la leche a concentraciones muy eleva- das, la XOD asociada, principalmente, a la membrana del glébulo graso y la LP en Ja fase acuosa (58). Aunque en la leche précticamente no existen los sustratos natura~ les de Ia XOD, esta enzima poseen una especificidad de sustrato bastante amplia ¥ puede utilizar aldehidos de diversas estructuras que podrian aparecer en la leche por varias vias. El oxigeno, como aceptor de electrones, es transformado a superxido Y perOxido de hidrogeno, ambos eficaces prooxidantes de los lipidos. La LP parece ser un fuerte prooxidante para los ferrihemo y puede utilizar el H,O2 (producido por la XOD) para catalizar diversas oxidaciones. Se ha propuesto que las reacciones combinadas de la XOD y de la LP ENZIMAS 509 LO-+LH —eLon+e: L:+02 —=Loo- Loo-+LA —= Loon+L: Figura 28. Mecanismo de 1 peroxidacidn de los lipidos insaturados catalizada por la hema- ‘ina. (Reproducida de la Ref. 167, por cortesia de AVI Publishing Co). M. Ascorbato oxidasa (13, 50) La ascorbato bre, cat ido Lascérbico + '40;——wdcido dehidroascérbico + H:0 «) ‘Al contrario de lo que ocurre con algunas oxidasas, Ia reaccién produce agua, en lugar de perdxido de hidrégeno. Sin embargo, en presencia de oxigeno atmosféri- £0 y ausencia de enzima, el écido ascérbico, en una reaccién catalizada por los iones cobre, es oxidado a dehidroascérbico y peréxido de hidrégeno, el cual, a su vez, de- '@ una ulterior destruccién del citado dcido. Se encuentra ascorbato oxidasa en todas las especies del género Cucumis, en las semillas, en los granos y en ciertas frutas (144). La oxidacién enzimética del dcido ascdrbico es importante en la industria de lo Se produce en las naranjas y estan, se supone, compensadas por nal de dcido ascérbico por la inte uctasas sufren un mayor dao durante la extraccién de los zum. 8 las oxidasas destruir el dcido ascérbico, Por lo tanto, ¢s impor cién de la AAO empleando zumos frescos, acortando al méximo la fase de mezcla } clectudndola a bajas temperaturas, desaireando el zumo para retirar el oxigeno ¥, ‘inalmente, pasterizandolo para inactivar las enzimas oxidantes. de Li destruccin del dcido ascOrbico de la piel de la naranja durante Ia preparacion ‘© mermelada se considera debida a oxidacién enzimatica, Las pérdidas se reducen Sensiblemente hirviendo en agua la piel rallada,S10 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS bre la pasta del pan podria proceder de n-reduccién que determinasen la apari- El efecto favorable del Acido ascérbico reacciones enzimiticas acopladas de oxi cidn de procesos de entrecruzamiento del gluten por la formacién de enlaces disulfu- 10 (144), oxidasa 2Ascorbato + Oz 2dehidroascorbato (DHA) + H20 (88) reductasa 2DHA + gluten (SH): gluten S—S gluten + 2ascorbato (89) ‘También catalizan la destruccién del dcido ascérbico otras oxidasas, como la ci- trocromo oxidasa, la peroxidasa y la fenolasa. N. Enzimas antioxidantes ‘Como se ha mencionado anteriormente, algunas oxidorreductasas pueden actuar ‘como pro-oxidantes en los alimentos, directa o indirectamente. Por o! $s pueden desnaturalizar a tales enzimas y convertirlas en metalo-proteinas pro-oxidantes inespecificas, dado que a mayor parte de ellas son metaloenzimas. 1. Catalasa (144) Esta enzima destruye el H:02 por la siguiente reaccién 21,0, —+30, + 21,0 (0) 122 2+ Hy El oxigeno resultante va no se encuentra en una forma activada, sino en su estado normal. 2. Superdxido Dismutasa (SOD) (144) Como indica su nombre, la SOD cataliza la dismutacién del superéxido 0} +0, +30, +130) wn) geno producido se encuentra en forma no activada, esta enzirpa ge- “almente nocivo. Ha sido patentada como antioxidante para su uso pero deberia ser mas eficaz en presencia de catalasa, para destruir el H2O2. Pueden observarse los efectos ‘estas dos enzimas cuando se afiaden al sistem: La SOD es muy ubicua, existiendo en gran niimero de tejidos, aunque a concen- traciones bajas. Contiene en su centro activo Fe, Mn, o Cu y Zn, dependiendo del sistema bioldgico de procedencia. Ciertos complejos de cobre de bajo peso molecular poseen una sustancial actividad SOD (9). ENZIMAS. 5 2, Glutatién peroxidasa (169) + ROOH —+ ROH + 1130 + GSSG (92) ida a las membranas, en forma de agregados hidrofé- bicos (161). Cataliza la oxidacién de los tioles para dar disulfuros y HO: 2R-SH +0, —> R-S-S-R +1130, (93) El H,0> resultante puede actuar como prooxidante, pero, aparentemente, también puede ser utilizado por la lactoperoxidasa sin que induzca reacciones de prooxida- cidn (162), ejerciendo la combinacién de estas dos enzimas un posible efecto antioxi- dante en la leche. Las enzimas mencionadas anteriormente podrian, si fuesen suficientemente acti- ‘vas en los alimentos, protegerlos frente a los cambios oxidativos y de las alteraciones no deseables del color, aroma y textura ©. Enzimas del aroma La formacién de compuestos que afectan al aroma de los alimentos, particular ‘mente en frutas y verduras, ha sido asociada a la accién de enzimas. Pueden éstas tamente, por la conversién de sustancias precursoras a las responsa- ‘abor y olor, o indirectamente, generando agentes oxidantes 0 precursores 0s mecanismos de formacién del aroma, incluyendo los enzimaticos, se discu- fen con mas detalle en el Capitulo 9. El concepto de flavorasa ha sido tratado en la Seccién X (véase también el Cap. 9) P. Enzimas degradadoras En las plantas existen clorifilasas y antoci lizan la destruccién de clorofila y antoci jasas que, sino son s, respectivamente (26, XIV. -INHIDORES ENZIMATICOS (12, 28, 52, 89, 95, 100, 132, 133, 157, 174) Los microorganismos y algunos tejidos animales y vegetales producen una amplia Variedad de inhibidores naturales de las enzimas hid ‘Taw ends extodindion de:52 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS ‘EeEIMAS a3 icas de la tripsi- ¢stos inhibidores son los que muestran actividad antiproteinasa. Los multiples inhi- inasas han sido agrupados en familias, en funcién de sus caracte- ibidores de los cuatro grupos de proteinasas ; carboxil- o metalo-proteinasas) (180), pero los que han sido estudia- ladamente son los de las proteinasas de serina (95). En su mayor parte, 1a en los extractos de soja (97). Se supone que el grupo tiol de la s inhibidores son de natureza proteica y se piensa que se comportan de un modo Teacciones de intercambio tiol-disulfuro con el(los) inhibidor(es), determinando la de- a los inhibidores andlogos al estado de transicién (transition state analog in- ‘tegracién de su estructura y su inactivacién. El hecho de que basten tratamientos itors, TSAD, en los que el grupo carboni icos moderados para inactivar a estos inhibidores en presencia de cisteina, puede adquiere n el disefo de procesos de purificacién que conserven mejor las propiedades vas de las proteinas de soja. le lo que lo hace en Tuctura se parece 0 es andloga a idores mucho mas eficaces Distribucién de los inhibidores en ismo. Por lo general, la K, para un TSAI es mucho La mayor parte de los inhibidores de las proteinasas se han descubierto en semi- Js. Sin embargo, no se encuentran restringidos a esta parte de la planta. Por ejem- fo, se ha encontrado un inhibidor de la tripsina en el tubérculo y en las hojas del cido, pero, en general, es probable que cumplan la funcién de evitar a deseables (95). Aunque estos cioso en el control de la accién de las enzimas en los productos alimentici que algunos de ellos plantean a los consumidores problemas nutricionales y s bidor de la qui- A. Inhibidores en las plantas (12, 89) 2. Importancia nutritiva y sanitaria de los inhibidores de las proteinasas Ya en 1917, Osborne y Mendel observaron que las ratas alimentadas con semillas de soja no crecian a menos que ésta fuese sometida a coccién durante varias horas, observacién que se extendié después a diversos animales de experimentacién, La su- plementacién de la harina de soja no tratada al calor con metionina (el aminodcido limitante en la soja) o cistina, mejora la utilizacién proteica a basicamente el mismo mentacién mundial. nivel que un tratamiento térmico adecuado, Como es de esperar, la harina de soja sada térmicamente y suplementada con metionina tiene mayor valor nutritivo que la enriquecida con metionina y no sometida a tratamiento térmico. Se ha observado les que contienen s6lo el minimo a, argini- para cubrir las necesidades nutrivas, cuando se ‘Sufre una con harina de soja no tratada pueden dar lugar a carencias de estos ami- rmicos breves a 80 °C, que ios. Todo ello parece sugerir que estos inhibidores interfieren el proceso de di- inhibidor de Kunitz inhibe mn de las proteinas. arte, existen evidencias que apuntan a que el efecto estudiadas, dada la importancia de las legumbres, los cereales y las patatas en la ali- a la tripsina de varias especi El inhibidor de Bowman-Birk parece ser mas estable a la desnaturalizacién que Las preparaciones desecadas de aquél no pierden su actividad incluso por calentamiento a 105 °C y, en disoluciones acuosas al 0,02 %, soporta trata tos de 100 °C durante 10 minutos. Es destruido por e cin al autoclave, 20. nutos a 121 °C, Es estable en medio cide (pH 1.5, 2 horas, 37 °C) y a la digestion » Paraciones: intestino, por lo menos en el caso de los roedores. Por ejemplo, la soja day las preparaciones del citado inhibidor no deprimen la actividad proteol tracto intestinal de las ratas y ratones. Por otra parte, se ha demostrado que las pre- tvas de antitripsina tambien inhiben el crecimiento de los roedores cuandosi4 QUIMICA DE LOS ALIMENTOS se incorporan a dietas que contienen proteinas predigeridas o aminodcidos libres. Asi scOmo retarda el crecimiento de las ratas el inhibidor de la tripsina sin afectar tada da lugar también a hipertro- 1a podria causar la depresion del de algin modo, , através de esta v de las ratas son consecuencia de la fuerte afinidad de su(s) a or la trip de rata, que nhibicién por retroalimentacién de la biosintesis de trip- ina en el pancreas. Esto, a su vez, provocaria una biosintesis de tripsina excesiva que

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• The 7 Habits of Highly Effective People

  

  Da Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People

  Stephen R. Covey

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (353)
• The Art of War: A New Translation

  

  Da Everand

  The Art of War: A New Translation

  Sun Tzu

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (3045)
• The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  

  Da Everand

  The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  Mark Manson

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (20105)
• The Handmaid's Tale

  

  Da Everand

  The Handmaid's Tale

  Margaret Atwood

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (13282)
• Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  

  Da Everand

  Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  Jane Austen

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (20479)
• Good Omens: A Full Cast Production

  

  Da Everand

  Good Omens: A Full Cast Production

  Neil Gaiman

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (10972)
• Remarkably Bright Creatures: A Novel

  

  Da Everand

  Remarkably Bright Creatures: A Novel

  Shelby Van Pelt

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (5781)
• Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  

  Da Everand

  Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  Chris Voss

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (3313)
• And Then There Were None

  

  Da Everand

  And Then There Were None

  Agatha Christie

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (9007)
• The Hobbit

  

  Da Everand

  The Hobbit

  J. R. R. Tolkien

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (25285)
• Art of War: The Definitive Interpretation of Sun Tzu's Classic Book of Strategy

  

  Da Everand

  Art of War: The Definitive Interpretation of Sun Tzu's Classic Book of Strategy

  Stephen F. Kaufman

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (3321)
• Freakonomics Rev Ed

  

  Da Everand

  Freakonomics Rev Ed

  Steven D. Levitt

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (7879)
• The 7 Habits of Highly Effective People: The Infographics Edition

  

  Da Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People: The Infographics Edition

  Stephen R. Covey

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (2487)
• The Hobbit

  

  Da Everand

  The Hobbit

  J. R. R. Tolkien

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (24589)
• American Gods: The Tenth Anniversary Edition

  

  Da Everand

  American Gods: The Tenth Anniversary Edition

  Neil Gaiman

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (12956)
• Habit 3 Put First Things First: The Habit of Integrity and Execution

  

  Da Everand

  Habit 3 Put First Things First: The Habit of Integrity and Execution

  Stephen R. Covey

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (2508)
• The 7 Habits of Highly Effective People

  

  Da Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People

  Stephen R. Covey

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (2572)
• Habit 1 Be Proactive: The Habit of Choice

  

  Da Everand

  Habit 1 Be Proactive: The Habit of Choice

  Stephen R. Covey

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (2559)
• Habit 6 Synergize: The Habit of Creative Cooperation

  

  Da Everand

  Habit 6 Synergize: The Habit of Creative Cooperation

  Stephen R. Covey

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (2499)
• How To Win Friends And Influence People

  

  Da Everand

  How To Win Friends And Influence People

  Dale Carnegie

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (6700)
• American Gods [TV Tie-In]: A Novel

  

  Da Everand

  American Gods [TV Tie-In]: A Novel

  Neil Gaiman

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (12556)
• Good Omens

  

  Da Everand

  Good Omens

  Neil Gaiman

  Valutazione: 4.5 su 5 stelle

  4.5/5 (12072)
• Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  

  Da Everand

  Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  Emily Bronte

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (9975)
• The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  

  Da Everand

  The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  Homer

  Valutazione: 4 su 5 stelle

  4/5 (5734)