PRÁCTICA 6

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL

De todas las moléculas de

importancia biológica, las proteínas son de
las que más se estudian por ser las más
versátiles. Muchas proteínas tienen actividad
biológica, como por ejemplo las enzimas y
las inmunoglobulinas. Otras son proteínas de
transporte que facilitan o controlan el
movimiento de sustancias a través de las
membranas en las células. Otras actúan como
hormonas (ej: insulina) y otras como parte
estructural de las células (ej: microtúbulos y
microfilamentos del citoesqueleto). El
Biólogo molecular puede obtener proteínas a
partir de fraccionamiento celular. Una vez se
separa la célula en sus componentes se
procede a aislar las proteínas para su estudio.
Lo más importante a seguir en la purificación es la recuperacion de la
proteína que nos interesa. Esto puede hacerse por ensayos enzimáticos si es una
enzima, bioactividad si es no-enzimática o algún otro método que sea conveniente,
como electroforesis o cromatografía de columna.

Lo segundo es conocer la cantidad de proteína presente en la muestra.

Existen varios métodos de análisis cuantitativo. El que se use dependerá de la
cantidad de proteína esperada, si la muestra analizada debe ser recuperada o si no
importa que la muestra sea destruída.

Determinación del Nitrógeno según Kjeldahl

Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación
del nitrógeno en una amplia gama de muestras. La determinación del nitrógeno Kjeldahl
se realiza en alimentos y bebidas, carne, piensos, cereales y forrajes para el cálculo del
contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de
nitrógeno en aguas residuales, suelos y otras muestras.

El método Kjeldahl sirve para determinar el contenido en nitrógeno en muestras

orgánicas e inorgánicas. Se basa en la digestión de la muestra en ácido sulfúrico
concentrado a ebullición, con la adición de un catalizador. La muestra se digiere hasta
disolución y oxidación de la muestra. El nitrógeno contenido en la muestra se convierte
en Amonio Sulfato.

Añadiendo un exceso de solución de sodio hidróxido, el ion amonio es liberado en

forma de amoniaco, destilado y recogido sobre una solución de ácido bórico o sobre una
solución valorada de ácido sulfúrico. El amoniaco recogido es determinado con una
solución valorada de ácido o se valora por retroceso con solución de sodio hidróxido de
concentración conocida, si se recogió sobre ácido sulfúrico.

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

Universidad Ricardo Palma
Facultad de Ciencias Biológicas-Escuela de Biología
Curso: Nutrición
Ciclo 2008-I
Los resultados se pueden expresar en % N, % NH3 o proteína (%N x factor).

PROCEDIMIENTO:

Se pesó 0.5 gr. de K2SO4 y 0.5 gr. de CuSO4,

luego ambas sustancias fueron introducidas en un
tubo con el pico largo y angosto cuya finalidad es
evitar que los gases se escapen en el proceso de la
digestión.

La cáscara de piña deshidratada o con un peso

neto (de 3.3 gr.), también fue introducida con el
objetivo de obtener la proteína total. Luego se
echó 3 ml. de H2SO4

a) Digestión de la muestra
En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son oxidados hasta dióxido de
carbono y agua, mientras que el nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la
acción de un agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un catalizador. Se han
desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador ó el agente oxidante,
pero en todos los casos, el objetivo final de la etapa de digestión es el de convertir el
nitrógeno proteico en sulfato de amonio. Ocurren dos reacciones:

Mat. Org. +H2SO4 ------------ CO2 + 2SO2+ 2H2O

2NH3 + H2SO4 ---------- SO4(NH4)2

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

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 b) Destilación

En la etapa siguiente, se utilizó

NaOH, que es una base fuerte
y su función es liberar el
amoniaco de la sal de amonio.
Se agregó 10 ml. de hidróxido
de sodio en el tubo grande y
luego se añadió la piña
digerida.

En el erlenmeyer se coloca
ácido bórico (de color rosado)
que, al actuar con el hidróxido
de amonio (resultante del
calentamiento de la mezcla del NaOH y la piña digerida) se transforma en borato de
amonio, fácilmente reconocible por el cambio de coloración (a verde). Se espera que
haya 50 ml. de borato de amonio en el erlenmeyer y se apaga la estufa retirando antes el
erlenmeyer para evitar que todo el líquido contenido en este retorne al tubo grande que
está siendo calentado.

Se puede apreciar como gracias al hidróxido de amonio el ácido bórico

reacciona con este para convertirse en borato de amonio. La reacción es
fácilmente identificada por el cambio de coloración.

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

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 c) Titulación
Al final, se hace la titulación con ácido sulfúrico 0.0025 N (aunque también puede
utilizarse ácido clorhídrico a 0.05N). Se echa H2SO4 hasta que la solución vuelva a
adquirir un color rosado, luego se anota el volumen gastado de la titulación y se hacen
los cálculos respectivos.

Erlenmeyer con la solución titulada

CALCULOS:

%N = 0. 583

RESULTADOS:

a. Porcentaje de nitrógeno en la muestra: 0.583 %

b. Porcentaje de proteína bruta en la muestra: 0.583 x 6.25 = 3.644 %

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

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CUESTIONARIO:

a. ¿Cómo se obtiene el factor 6.25? Explique

El factor 6.25 se deriva del hecho de que la mayoría de las proteínas contiene 16 %
de Nitrógeno. De este modo, 100 entre 16 dará como resultado 6.25.

b. ¿Qué se entiende por proteína bruta o total?

Se entiende por proteína bruta o total al nitrógeno total de la muestra expresada
como proteína. El método empleado no es apto para aquellas sustancias que
contienen enlaces N-N, NO u NO2

c. ¿Qué críticas se le pueden hacer al método utilizado?

Existen otros tipos de mezclas catalíticas (siendo las más empleadas hechas a base de
selenio o mercurio). Estas mezclas catalíticas tienen como objetivo acelerar el proceso
de digestión, que se puede prolongar durante varias horas. En síntesis, aunque el método
utilizado es seguro, podemos utilizar otras mezclas catalíticas para acelerar la digestión.
Claro que debe tenerse en consideración, que la mayoría de estas mezclas catalíticas son
tóxicas y es necesario el uso de la campana extractora para evitar ser contaminados.

APLICACIÓN:

Se tomó dos muestras de pasto y se determinó la cantidad de proteína por el método de

Kjeldahl

MUESTRA 1 MUESTRA 2

Gasto de HCl : 4.6 ml Gasto de HCl : 4.4 ml

Normalidad de HCl : 0.0544 N Normalidad de HCl : 0.0505 N
Peso de la muestra : 0.300 gr. Peso de la muestra : 0.300 gr.
Meq. Nitrógeno : 0.014 Meq. Nitrógeno : 0.014

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

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Ciclo 2008-I
Entonces:

Hallando la proteína total en Muestra 1:

% N = 4.6 x 0.0544 x 0.014 x 100

0.300
% N = 1.17
% de proteína bruta: 6.31

Hallando la proteína total en Muestra 2:

% N = 4.4 x 0.0505 x 0.014 x 100

0.300
% N = 1.03
% de proteína bruta: 6.44

BIBLIOGRAFÍA

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/FigT4/tema4.pdf

http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/laboratorio2.htm

http://www.panreac.com/new/esp/productos/docs/re_esp.pdf

http://64.233.169.104/search?q=cache:ujNsG1vU784J:www.monografias.com/trabajos1
0/acig/acig.shtml+factor+6.25&hl=es&ct=clnk&cd=1&gl=pe

http://xtec.es/~ffernan5/castellano/05001.htm

Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

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