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Il controllo microbiologico dei prodotti non

obbligatoriamente sterili
Esecuzione delle analisi e convalida dei metodi
secondo la nuova monografia armonizzata

Bayer HealthCare

Gabriella Galimberti

Cristina Vigan

Bayer Healthcare Manuf.

Intendis Manuf.

Convalida di metodo (method suitability)


Che cosa richiedevano le Farmacopee precedenti?
European Pharmacopoeia 2.6.12
Se il prodotto da essere analizzato ha attivit antimicrobica, questa deve essere adeguatamente
neutralizzata. (Presente anche in 2.6.13)
Se per questo scopo si usano inattivanti, devono essere dimostrate la loro efficacia e la loro non
tossicit verso i microorganismi.
La scelta di un metodo pu essere basata su fattori come la natura del prodotto ed il numero di
microorganismi che ci si aspetta di trovare.
Ogni metodo scelto deve essere adeguatamente validato.
Effectiveness of culture media and validity of the counting method
Coltivare i ceppi separatamente in liquido (elenco ceppi, tempi, temperature, esempi di terreni).
Diluire in sol. fisiologica tamponata peptonata fino ad ottenere circa 100 ufc/ml. Per il controllo del
metodo di conteggio usare le sospensioni separatamente in presenza ed in assenza del prodotto.
Per la conta in piastra e per la filtrazione si deve ottenere una conta che non differisca di pi di un
fattore 5 (= 20-500%) da quella del controllo (inoculo). Per l
MPN il valore deve collocarsi entro il
95% del limite di confidenza dell
inoculo.
G. Galimberti, Bayer HealthCare Manuf.

C. Vigan, Intendis Manufact.

USP <61>
La validit dei risultati dei test descritti in questo capitolo si basa sull
adeguatezza della
dimostrazione che i campioni, nelle condizioni di test, non inibiscono la moltiplicazione
dei microorganismi che possono essere presenti.
In preparazione all
esecuzione del test, su una base regolare e se le circostanze lo
richiedono in seguito, inoculare campioni diluiti del materiale da testare con colture vitali
separate di S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e Salmonella. Ci pu essere fatto
aggiungendo 1 ml di una diluizione non inferiore a 103 di una brodo-coltura di 24 h del
microorganismo alla prima diluizione del campione e seguendo la procedura di test.
La mancata crescita di uno pi microorganismi invalida quella parte di test e necessita di
una modifica alla procedura per aumento del volume di diluente, aggiunta di uno o pi
agenti inattivanti (ad es. lecitina di soia 0.5%, polisorbato 20 4.0%), entrambi, usando il
metodo per filtrazione (vedi test di sterilit) se possibile.
Se con tutte le modifiche non comunque possibile ottenere il recupero, si deduce che il
prodotto ha attivit battericida e che, quindi, non pu essere contaminato da quelle
specie microbiche. Il monitoraggio deve comunque essere eseguito per valutare quale
sia lo spettro di inibizione e l
attivit battericida del prodotto.
Prima della conta fare il test per l
assenza di propriet antimicrobiche.
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USP <1227>
Questo capitolo una guida per la convalida dei metodi per i capitoli <51> Antimicrobial
Effectiveness Tests, <71> Sterility tests e <61> Microbial limit tests.
Sottolinea pi volte l
importanza della neutralizzazione delle propriet antimicrobiche
eventualmente possedute dal prodotto.
Fattori influenti
Natura del microrganismo usato per la prova (specie, ATCC, ambientale)
Preparazione dell
inoculo (popolazioni microbiche omogenee, preparazione e conservazione
standardizzate)
Condizioni del test (riprodurre le condizioni delle analisi - diluenti, temperatura, luce)
Condizioni del recupero (terreni, tempi e temperature di incubazione)
Metodi di neutralizzazione
Inibizione chimica, diluizione, filtrazione su membrana
Convalida del metodo di neutralizzazione
Efficacia del neutralizzante e sua non tossicit (tre gruppi: prodotto + neutralizzante,
diluente + neutralizzante, diluente).
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USP <1227>
Conteggio su agar: recupero > 70% - almeno tre repliche
con pi repliche possibile effettuare una valutazione statistica dei risultati.
Conteggio per filtrazione: fa riferimento al Test di sterilit. L
inoculo viene posto nel terzo
risciacquo. Consigliano di verificare la tossicit della membrana e l
eventuale aderenza dei
m.o. sulle pareti del dispositivo di filtrazione.
Recupero di microrganismi stressati
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e.Consigliano di fare alcune prove
per verificare la sopravvivenza dei m.o. nel prodotto ed il loro r
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terreni differenti. Accettabilit per terreni alternativi: max. 0.5 log di errore.
Stima del numero di ufc
Il numero corretto 25-250 per batteri e lieviti, 8-80 per le muffe (ceppi prescritti da USP).
Per conte su membrana e per altri ceppi si dovrebbe calcolare il range con il metodo fornito.
Conte molto basse hanno una percentuale di errore elevata (es. per 3 ufc nella dil. 1:10 la
conta di 30 ufc ha un errore del 58%.

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Che cosa prevede la nuova armonizzata


2.6.12 (<61>)
Deve essere stabilit la capacit del test di rilevare microorganismi in presenza del
prodotto.
L
adeguatezza deve essere confermata se vengono introdotti dei cambiamenti che
possono interferire con l
esito del test.
Inoculo e diluizione
Aggiungere al campione preparato e ad un controllo (senza prodotto) un volume di
sospensione microbica tale da ottenere un inoculo di non pi di 100 ufc. Il volume
del
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1% del volume del prodotto diluito.


Per dimostrare un recupero accettabile necessario utilizzare per il test il fattore di
diluizione pi basso possibile.Sec
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del campione o di una scarsa solubilit, si possono usare protocolli differenti. Se non
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adopo la neutralizzazione,
diluizione o filtrazione.

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Neutralizzazione/rimozione dell
attivit antimicrobica
Confrontare il numero di microorganismi recuperati dal campione con quelli del
controllo.
Si ha inibizione se il recupero ridotto di un fattore maggiore di 2 (= 50%). In
questo caso modificare la procedura, ad esempio:
aumentando il volume del diluente o del brodo colturale
aggiungendo un agente neutralizzante specifico o generico (vedi tabella)
usando il metodo per filtrazione
combianando i tre metodi sopra descritti.
Se non possibile trovare un adatto metodo di neutralizzazione, si deve assumere
che il prodotto abbia attivit microbicida. Questa informazione serve ad indicare
che il prodotto non a rischio di contaminazione da parte di quella data specie
microbica. Comunque sempre possibile che il prodotto inibisca anche altre specie
microbiche qui non considerate. Perci eseguire il test alla massima diluizione
compatibile con la crescita microbica e con lo specifico criterio di accettazione.

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Interpretazione dei risultati


La conta di ogni microorgansimo non deve differire per pi di un fattore 2 da quella
del controllo. Per l
MPN il valore deve collocarsi entro il 95% del limite di confidenza
dell
inoculo.
Se i criteri non sono soddisfatti per uno o pi microorganismi per l
analisi bisogna
usare il metodo e le condizioni di test che pi si avvicinano ai criteri.
Messa a punto del metodo
Nelle precedenti Farmacopee questa parte era inclusa in quella dell
analisi.
Generalmente per la messa a punto del metodo si usa 1 g diluito 1:10.
Diluenti suggeriti: soluzione fisiologica tamponata peptonata pH 7.0, tampone fosfato
pH 7.2, TSB. Se necessario correggere il pH in modo che si collochi tra 6 e 8.
Per i prodotti insolubili in acqua aggiungere dei tensioattivi
Attenzione all
indice HLB! (Hydrophylic/Lypophylic Balance).
<10: lipofilo
>10: idrofilo
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2.6.13 (<62>)
Se il prodotto da essere esaminato possiede attivit antimicrobica, questa deve
essere se possibile rimossa o neutralizzata come descritto al capitolo 2.6.12
(<61>).
Se sono utilizzati dei tensioattivi per la preparazione del campione, deve essere
dimostrata la loro assenza di tossicit verso i microorganismi e la loro compatibilit
con eventuali inattivanti usati, come descritto in 2.6.12 (<61>).

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Agenti inattivanti
Sostanza inibente

Metodo - Neutralizzante

Glutaraldeide, mercuriali

Sodio idrogeno solfito (sodio bisolfito)

Fenolici, alcoli, aldeidi, sorbato

Diluizione

Aldeidi

Glicina

Composti dell
ammonio quaternario,
parabeni, bi-guanidi

Lecitina

Composti dell
ammonio quaternario,
iodio, parabeni

Polisorbato (Tween)

Mercuriali

Tioglicolato

Mercuriali, alogeni, aldeidi

Tiosolfato

Sodio EDTA

Ioni calcio o magnesio

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Inoculation and dilution


Q: What is the sufficient volume of the microbial suspension of not
more than 100 CFU? What does 100 CFU refer to?
A: The micro-organisms are to be added to the diluted/suspended
product at the end of the preparation o after the neutralisation (in
the last fraction of the rinsing fluid in the case of filtration or
simultaneously with the preparation in/on the Petri dish in the
case of the plate count method). The 100 CFU refers to the
inoculum (e.g. what will be on the filter or on the plate).
Q: If I am going to validate a TAMC: should I use both C. albicans
and A. niger for my qualification? And if I am validating for yeast
and mould count should both C. albicans and A. niger be used
for the qualification?
A: Yeast and moulds must be recovered on both CSA and SDA.
Yes, you must validate with C. albicans and A. niger.
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Neutralisation/removal of antimicrobial activity


Q: Why is it necessary to demonstrate the efficacy of neutralising
agents? Has this to be performed by comparison of buffer
solutions with and without neutralising agents? From our point of
view it is not necessary, if recovery of micro-organisms in the
presence of product is given. It is very time consuming to test
different combinations of neutralising agents prior to the
validation test.
A: It is good practice to test the efficacy and the absence of toxicity
of the neutralising agent. Effectiveness is checked by
performing incubation of the product with and without
neutralising agent, absence of toxicity is performed on a blank
with neutraliser and without product. This can be done in
parallel.

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Suitability of the test method


Q: Does it mean that for each test strain, individual suitability tests
have to be performed, or is it possible to use a mixed inoculum of
all 4 strains?
A: The method states that the strains are inoculated individually. No
mixed inoculum is permitted.
Q: Test strains must be inoculated individually using a number of
micro-organisms equivalent to not more than 100 CFU, could you
clarify if this means that only the specific microorganism under
detection in the test method is inoculated into the growth medium
or if each of the 4 micro-organisms are added individually to the
growth medium for each of the specific test methods?
A: It is only the specified micro-organism under detection which is
inoculated.
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APPROCCIO ALLA
CONVALIDA / SUITABILITY DEL METODO

Convalida di metodo

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Chi
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o.
I capitoli della USP con il numero fino a <1000> (compendial
chapters) per definizione sono validati. Quindi, in realt, noi non
possiamo validare i metodi, ma solo dimostrare la correttezza del
recupero (method suitability).
Quindi, lo scopo di uno studio di correttezza del metodo (method
suitability) in microbiologia non quello di validare il saggio, ma di
dimostrare che il nostro metodo analitico corretto, o adatto, ovvero
che lo schema utilizzato permetta il recupero dei microorganismi
vivi, ovvero ancora che la crescita dei microorganismi non sia inibita
dal
l

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caresidua del prodotto.
Pertanto: Suitability del metodo
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Da Allegato 15 al Vol. IV delle EU GMP:

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gli elementi chiave di un programma di Convalida
dovrebbero essere chiaramente definiti e
documentati in un Validation Master Plan o
document
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Pianificazione mediante: VMP

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Definizione del
Validation Mast
erPl
an(VMP)
Documento di riferimento:
definisce lo scopo
le attivit nelle varie fasi della Convalida
la loro sequenza cronologica
le responsabilit
il team
la formazione del personale e le procedure
necessarie
documentazione
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Attivit descritte nel VMP:


FASE I: Convalida terreni
Terreni di coltura oggetto di convalida
Scelta dei fornitori dei terreni di coltura
Test Conformit dei terreni di coltura
FASE II: Convalida/Suitability dei metodi
dei prodotti finiti
delle materie prime
dei materiali confezionamento primario
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Convalida terreni (FASE I)


1)

Terreni di coltura oggetto di convalida:

Terreno
coltura

Propriet
Crescita

EEB

E.coli ATCC 8739


P.aeruginosa ATCC 9027

VRBGA

E.coli ATCC 8739


P.aeruginosa ATCC 9027

MCB

E.coli ATCC 8739

MCA

E.coli ATCC 8739

RVSV

S. typhimurium ATCC 14028

XLDA

S. typhimurium ATCC 14028

CTA

P.aeruginosa ATCC 9027

MSA

S.aureus ATCC 6358

Propriet
Indicative

Propriet
Inibitorie
/

S.aureus ATCC 6538

E.coli ATCC 8739


P.aeruginosa ATCC 9027
/

S.aureus ATCC 6538

E.coli ATCC 8739


/

/
S.aureus ATCC 6538

E.coli ATCC 8739


/

/
E.coli ATCC 8739

S.aureus ATCC 6358

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E.coli ATCC 8739

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Convalida terreni
(FASE I)
2) Scelta dei fornitori dei terreni di coltura:
selezione di due fornitori per ciascun
terreno sulla base della corrispondenza
della composizione riportata in Ph. Eur

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Esempio:

MacConkey Agar
Richieste Ph Eur

Fornitore 1

Pancreatic digest
of gelatin

17,0 g

Peptone from
casein)

17,0 g

Pancreatic digest of
gelatin

17,0 g

Peptone (meat
and casein)

3,0 g

Peptone from
meat

3,0 g

Peptone (meat and


casein)

3,0 g

Sodium chloride

5,0 g

Sodium chloride

5,0 g

Sodium chloride

5,0 g

Lactose
monohydrate

10,0 g

Lactose

10,0 g

Lactose

10,0 g

Bile salt

1,5 g

Bile salt mixture

1,5 g

Bile salt

1,5 g

Neutral red

30 mg

Neutral red

30 mg

Neutral red

30 mg

Crystal violet

1 mg

Crystal violet

1 mg

Crystal violet

1 mg

Agar

13,5 g

Agar-agar

13,5 g

Agar

13,5 g

Purified Water

1000 ml

Purified Water

1000 ml

Purified Water

1000 ml

pH

7,1 0,2

pH

7,1 0,2

pH

7,1 0,2

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Fornitore 2

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Convalida dei terreni


( FASE I)
3) Test Conformit dei terreni di coltura:
valutazione delle propriet
crescita, indicative e di inibizione
Inoculo 100 UFC

Inoculo 100 UFC

Ripetizione test su 3 lotti per ciascun terreno


di coltura

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RISULTATI
(FASE I)

Tutti i terreni selezionati presentano


buone propriet di crescita,
indicative e di inibizione ad eccezione di
XLDA e MSA
PROBLEMI EMERSI

E.Coli (germe
indicativo) - non
cresce su XLDA

E.Coli (germe inibitorio)


- parzialmente inibito
su MSA

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Convalida del metodo


(FASE II)
1. Convalida /Suitability deimet
odiperl

anal
i
si
microbiologica
dei prodotti finiti
delle materie prime
dei materiali di confezionamento primario
Ripetizione su 3 lotti

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Convalida metodo
(FASE II)
Operazioni preliminari:
Verifica del pH
presenza/assenza di attivit antimicrobica
Neut
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Diluizione
Agenti inattivanti
Filtrazione su membrana

Scelta del metodo

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Total aerobic microrganism count (TAMC) /


Total yeasts and moulds count (TYMC)
Il volume
dell
inoculo non
deve eccedere l
1%
del volume del
prodotto diluito.

10ml

0,1 ml

0,1 ml

1ml

10 gr prodotto

90 ml NAPP

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

A. niger

C. albicans

B. subtilis

S. aureus

P. aeruginosa

E. coli

103 -104
UFC/ml

103 -104
UFC/ml

103 -104
UFC/ml

103 -104
UFC/ml

103 -104
UFC/ml

103 -104
UFC/ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

5-7 gg
SABA

CSA

20-25 C

3-5 gg

3-5 gg
CSA

30-35 C

30-35 C

10 - 100 UFC/piastra

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1ml

Ricerca microrganismi specifici


Bile-Tolerant, Gram-Negative Bacteria (Absence/Presence)
1 ml

1 ml
10 gr prodotto

E. coli

10 gr prodotto

P. aeruginosa

10-100 UFC/ml
90 ml CSB

10-100 UFC/ml
90 ml CSB

10 ml

10 ml

EEB da 100ml

EEB da 100 ml

24-48 h 30-35 C

24-48 h 30-35 C

Subcoltura

Subcoltura

VRBGA
18-24 h 30-35 C

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VRBGA
18-24 h 30-35 C

C. Vigan, Intendis Manufact.

Ricerca Microrganismi specifici


E. coli

10 ml

1 ml

30-35C

10 gr

E. coli

prodotto

10-100 UFC/ml

90 ml NAPP

24-48 h

18-24h

90 ml CSB

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1 ml

42-44 C

Subcoltura
18-72 h
MCA

100ml MCB

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30-35 C

Ricerca microrganismi specifici


P. aeruginosa, S. aureus
1 ml
P. aeruginosa
10 ml

18-24h
30-35C

10-100 UFC/ml

Subcoltura
CTA

18-72 h
30-35 C

90 ml CSB
10 gr
prodotto
1 ml
90 ml NAPP
S. aureus
10-100 UFC/ml

18-24h
30-35C

Subcoltura
MSA

18-72 h
30-35 C

90 ml CSB

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Ricerca microrganismi specifici


S. typhimurium
Trasferimento diretto con pre-arricchimento
1 ml
18-24h
S. typhimurium

10 gr
prodotto

0,1 ml
18-24h

30-35C

30-35C
XLDA

10-100 UFC/ml
90 ml CSB

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Subcoltura

18-48 h
30-35 C

10 ml RVSB

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Valutazione e interpretazione dei


RISULTATI
Conta totale
Confrontare il numero di microrganismi recuperati dal
campione con quelli del controllo e calcolare il fattore di Recovery:
La conta di ogni microorgansimo non deve differire per pi di un
fattore 2 da quella del controllo, questo significa che,
Per es. con un inoculo di 100 CFU, sono accettabili conte
da 100/2 = 50 CFU a 100 x 2 = 200 CFU con un FR tra 2 e 0.5 calcolato
come CFU controllo
CFU campione

Microrganismi specifici
Crescita

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Esempio Prodotto 1 ( assenza di inibizione)


Microrg. Tests

Test in
ASSENZA
di prodotto

TAMC (CSA )

Test in PRESENZA di
prodotto
Lotto 1

Lotto 2

Lotto 3

Fattore
recovery

S. aureus ATCC 6538

65/70

62/70

71/75

62/66

1 0,9 - 1

P. aeruginosa ATCC 9027

89/95

86/96

97/99

98/100

1 - 0,9 0,9

E. coli ATCC 8739

39/31

35/30

37/38

33/35

1,1 0,9 - 1

B. subtilis ATCC 6633

52/62

47/52

44/51

50/51

1,1 - 1,2 1,1

C. albicans ATCC 10231

30/40

32/40

36/48

27/33

0,9 0,8 1,1

A. niger ATCC 16404

36/38

40/38

36/36

30/36

0,9 1 1,1

C. albicans ATCC 10231

37/36

32/38

42/44

39/42

1 - 0,8 0,9

A. niger

44/45

42/45

35/43

60/65

1 1,1 - 0,7

TYMC (SABA)
ATCC 16404

Microrganismi specifici : crescita


G. Galimberti, Bayer HealthCare Manuf.

C. Vigan, Intendis Manufact.

Esempio Prodotto 2 (antibiotico)


Microrg. Tests

Test in
ASSENZA
di prodotto

TAMC (CSA)

Test in PRESENZA di
prodotto
Lotto 1

Lotto 2

Fattore
recovery

Lotto 3

S. aureus ATCC 6538

65/70

P. aeruginosa ATCC 9027

89/95

E. coli ATCC 8739

39/31

B. subtilis ATCC 6633

52/62

C. albicans ATCC 10231

27/33

26/23

20/28

25/35

1,2 1,2 - 1

A. niger ATCC 16404

36/30

40/41

34/36

32/34

0,8 0,9 - 1

C. albicans ATCC 10231

46/50

57/60

50/58

50/46

0,8 0,9 - 1

A. niger ATCC 16404

37/39

36/37

30/39

39/44

1 1,1 0,9

TYMC (SABA)

Microrganismi specifici : nessuna crescita

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C. Vigan, Intendis Manufact.

Conclusioni
Sulla base dei dati di Suitability:
Stesura metodi relativi a ciascun prodotto per utilizzo del test di
routine
In caso di recovery > 2 per un dato microrganismo o Nessuna crescita per i
microrganismi specifici

Se non stato possibile trovare un adatto metodo di neutralizzazione, si deve assumere che il
prodotto abbia attivit antimicrobica. Questa informazione serve ad indicare che il prodotto non
a rischio di contaminazione da parte di quella data specie microbica. Comunque sempre
possibile che il prodotto inibisca anche altre specie microbiche qui non considerate.

Per la conta microbica totale


eseguire test alla massima diluizione compatibile con il criterio di
accettazione
Per la ricerca di microrganismi specifici

- Non eseguire il test

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- Eseguire comunque il test allo scopo


di rilevare gli eventuali ceppi resistenti
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Messa a punto del metodo


Valutare le caratteristiche del prodotto:
liquido, solido, acquoso, grasso, idrosolubile, pH, Aw,
filtrabilit,per
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Studi di ricerca e sviluppo sulla molecola?


Prove di preparazione del campione in modo non sterile.

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Water activity
Indice della presenza di acqua realmente utilizzabile da
parte dei m.o.
Rapporto tra la pressione di vapore acqueo del prodotto e
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aaw= P/Po.
uguale a 1/100 della RH generata dal campione in un
sistema chiuso.

P. aeruginosa: 0.97

Halobacterium halobium: 0.75

S. aureus: 0.86

Rhodotorula mucilaginosa: 0.92

Aspergillus niger: 0.77

Zygosaccharomices rouxii: 0.62

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Esempio 1: materia prima (antimicotico)


Problema: difficilmente solubile in acqua
1a soluzione del problema:
Preparazione del prodotto: 2 g + 10 g PEG 400 monoricinoleato + TSB
(dil. 1:300).
Non si scioglie.
2a soluzione del problema:
Preparazione del prodotto: 10 g + 15 g di sol. 0.1% di sodio tiosolfato
+ sol. fis. tamp. pept. (dil. 1:10)
sciolto completamente.

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Esempio 2: materia prima in polvere (inibente)


Problema: difficilmente solubile in acqua
1 tentativo:
Diluizione 1:10 con TSB + Tween 80: non si scioglie.
2 tentativo:
Il pH acido (3.44) tentiamo di correggerlo anche per
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one 7mldiNaOH 1N: pH 7.46
Si scioglie completamente.

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Metodo degli aloni


(Par-Test, test di Kirby Bauer)
Rapida valutazione della presenza di attivit inibitoria
Risultati non precisi, ma indicativi.

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Accettabilit del recupero


La correttezza dei limiti 70%, 50%, 70-130% per il
recupero sempre un acceso dibattito.
Sutton ha dimostrato con studi pratici e statistici che se i
tecnici hanno una buona manualit una variabilit entro
il 75% ampiamente ottenibile. Oltre il 130% pu
avere senso se indice di un metodo migliore.
Comunque dopo lunghe discussioni si scritto il 50%
perch sembra (senza prove scientifiche) pi
raggiungibile da tutti. Questo, per, non vuol dire che
sia valido per tutti i test (ad es. se non prescritto alcun
limite).
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Qualche consiglio:
Attenzione agli agenti inattivanti ed emulsionanti:
spesso creano pi danno che beneficio (es. il sodio
tiosolfato, il PEG 400 monoricinoleato, il TTC sono tossici
verso i Gram +).
Attenzione ai tempi di crescita dei m.o. nella fertilit
dei terreni selettivi (coincide con quelli della convalida?).
Attenzione al gap tra convalida ed analisi di routine
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Qualche dubbio:
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? Per i test preliminari posso usare un campione <10 g,
ma per le tre prove?
? utile usare un numero di piastre >2?

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Il lavoro di convalida lungo ed oneroso e se il metodo va
anche registrato...
Insieme al metodo base si pu convalidare qualche
alternativa. Ad esempio:
Permanenza dei brodi per le ricerche per pi gg in
incubatore.
Utilizzo di metodi differenti (pi di un terreno per le
ricerche o per le conte, pi di un metodo di
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Skip testing (ICH Q6A).
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Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +) e
pH basso (4.8)
1a soluzione del problema:
Preparazione del prodotto: dil. 1:20 in TSB con inattivanti*
Ricerche: TSB con inattivanti dil. 1:200 (= 2 litri!)
LB con inattivanti dil. 1:300 (= 3 litri!).
2a soluzione del problema:
Preparazione del prodotto: 10 g + 30 g di sol. fis. tamp. pept.,
correzione del pH con 4 ml di NaOH 4N, dil. 1:10.
Ricerche: 10 ml in TSB.
* 3% Tween 80, 0.5% sodio tiosolfato, 0.3% lecitina.
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Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +)
Problema: S. aureus non cresce.
Conta:
Prodotto diluito 1:10 + 103 e 104 cellule: nulla
Prodotto diluito 1:100 + 103 e 104 cellule: crescita scarsa (<20%).
Ricerca:
Prodotto diluito 1:10 + 108 cellule: nulla
Prodotto diluito 1:1000: crescita.
Conclusione:
Il prodotto non a rischio microbico per S. aureus.
La conta si esegue comunque, la ricerca non si esegue.
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Esempio 3: prodotto solido antinfiammatorio


Principio attivo inibente (soprattutto verso i Gram +)
Preparazione del campione: dil. 1:10 con sol. fis. tamp. pept.
Prova con Par test: dil. 1:10 inibente, dil. 1:100 no.
Conta:
Prodotto diluito 1:10 + ceppi: recupero nullo dei Gram +
Prodotto diluito 1:100 + ceppi: OK.
Ricerca:
Nessuna inibizione
Conclusione:
Il problema si risolto con la diluizione.

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Esempio 4: antisettico ad uso vaginale


Problema: inibizione verso S. aureus
Metodo di conta scelto: filtrazione su membrana
Risultati delle varie prove:
N LAVAGGI

Totale
lavaggio

Recovery
PT

Recovery
PT +
Tween 1%

Recovery
riferimento

3 aliquote da 100
ml

300 ml

15

83

86

4 aliquote da 100
ml

400 ml

17

80

86

5 aliquote da 100
ml

500 ml

10

81

86

Soluzione: uso di un inattivante (Tween 80).

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Bibliografia - 1
HABERER K.: New Microbiological Chapters of the European Pharmacopoeia - Internationally
Harmonized Methods for Microbiological Examination of Non-sterile Products. Presentata al 2
simposio AFI/BioMerieux L

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nnov
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one tecnologica nei controlli microbiologici delle produzioni
farmaceutiche - Firenze 23.11.06.
S. SUTTON: Microbial Recovery Studies - 50% or 70%?. Pharmaceutical Microbiology Forum
Newsletter - Vol. 13 (9).
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mposio A.F.I. del 1992 a Riva del
Garda.
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A.F.I:
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obbligatoriamente sterili: corretto approccio per la definizione el
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presentato al Simposio A.F.I. del 1995 a Riccione.
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A.F.I:
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microbiologico (Prodotti farmaceutici non obbligatoriamente steri
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oal
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a
conferenza I rischi microbiologici del 2000 nel settore alimentare, organizzata da Oxoid a Bologna nel
1995.
Gr
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A.F.I:
Contribution to the validation of microbiological
analysis methods. Control of non-s
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.S.
T.
P.Pharma pratiques 7 (1) 4044 1997.

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Bibliografia - 2
FARMACOPEA UFFICIALE DELLA REPUBBLICA ITALIANA XII ed. 2008 Requisiti microbiologici
delle preparazioni farmaceutiche. - I suppl. 1998 Requisiti microbiologici delle preparazioni
farmaceutiche.
EUROPEAN PHARMACOPOEIA 6.5 - 2.6.12. Microbiological examination of non-sterile products:
total viable aerobic count. - 2.6.13 Microbiological examination of non-sterile products: test for
specified micro-organisms. - 5.1.4. Microbiological quality of pharmaceutical preparations. - 5.1.6Alternative methods for control of microbiological quality.

THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA 32 - <61> Microbial limit tests. - <61> Microbiological
examination of non-sterile products: microbial enumeration tests. - <62> Microbiological
examination of non-sterile products: test for specified micro-organisms. - <1111> Microbiological
quality of pharmaceutical preparations. - <1227> Validation of microbial recovery form
pharmacopoeial articles.
W. MANU-TAWIAH, B.A. BRESCIA, E.R. MONTGOMERY: Setting threshold limits for the
significance of objectionable microorganisms in oral pharmaceutical products. J. Pharm Sci.
Technol. 2001 May-Jun; 55(3):171-5.
ICH - Specifications: test procedures and acceptance criteria for new drug substances and new
drug products. Q6A

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Bibliografia - 3
http://pharmtech.findpharma.com/
The Harmonization of the Microbial Limits
Tests
. Dec 2, 2006 By S. Sutton - Pharmaceutical Technology.
European Directorate for the Quality of Medicines. Help desk:
http://www.pheur.org/site/page_630.php?rubrique=446
US Food and Drug Administration, Bacterial Analytical Manual Online.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html.
US Food and Drug Administration, Guide to Inspections of Microbiological
Pharmaceutical Quality Control Laboratories. 7/93.
www.fda.gov/ora/inspect_ref/igs/micro.html.
http://www.emea.europa.eu/inspections/qwp/q02.htm
http://www.edqm.eu/site/Homepage-628.html
http://www.usp.org/
http://www.iss.it/farc/index.php?lang=1
http://www.socgenmicrobiol.org.uk/
http://www.microbiologyforum.org/news.htm
http://www.pharmig.org.uk/
http://www.doctorfungus.org/index.htm
http://www.fda.gov/CDER/comment.htm
http://pharmtech.findpharma.com/

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