UNIVERSIDAD NACIONAL DE

INGENIERA
Facultad de Ingeniera
Ambiental

INFORME DE
LABORATORIO N 5:
Accin bacteriosttica selectiva de cristal violeta y accin
oligodinmica de los metales pesados

DOCENTE: Jorge Tello Cebreros

MICROBIOLOGA SANITARIA 1
ALUMNA: Alarcn Olivera Ambar Tiffany

Lima-Abril 2015
LABORATORIO N 5
OBJETIVOS
-Observar el efecto del cristal violeta ,en diferentes concentraciones ,sobre el
crecimiento de microorganismos.
-Observar el efecto de la accin oligodinmica de metales pesados ,sobre el
crecimiento de microorganismos.
-Reconocer mediante la tincin de Gram ,los tipos de microorganismos
afectados por el cristal violeta y la accin de metales pesados

INTRODUCCIN
Muchas sustancias qumicas son capaces de inhibir o matar a los
microorganismos.Van desde elementos metlicos pesados, como la plata y el
cobre hasta molculas orgnicas complejas como los compuestos de amonio
cuaternario. Las diversas sustancias ejercen su efecto antimicrobiano por
diferentes caminos y sobre diferentes grupos de organismos. Tambin varan
los efectos que tienen sobre las superficies o los materiales sobre los que se
aplican; algunos son compatibles, mientras que otros son destructores. Debido
a estas y otras variables, es necesario saber el comportamiento de un agente
qumico antes de utilizarlo para una aplicacin prctica determinada. En el
siguiente laboratorio se realizan los procedimientos para caracterizar el cristal
violeta y la accin del metal pesado, usados para controlar poblaciones
microbianas; vamos a describir sus modos de accin y a indicar sus
aplicaciones prcticas.
FUNDAMENTO TERICO
Caractersticas de un desinfectante ideal:
Ningn agente qumico antimicrobiano es el mejor para todas las
finalidades,Esto no es sorprendente a la vista de la vaiedad de condiciones bajo
las que los agentes pueden ser utilizados,las diferencias en su modo de accin
y los muchos tipos de clulas microbianas que hay que destruir .Si hubiese un
desinfectante ideal debera poseer una formidable coleccin de
caractersticas.Nunca ser posible encontrar un solo compuesto que rena
todas estas propiedades.Sin embargo,lo que se especifica ms adelante es lo
que se debe tratar de conseguir cuando se preparan nuevos agentes
antimicrobianos y debe considerarse tambin al hacer la valoracin de los
desinfectantes para uso en la prctica.

1. Actividad antimicrobiana: la sustancia qumica a baja concentracin deber

tener un amplio espectro de actividad microbiana.
2. Solubilidad: la sustancia deber ser soluble en agua y otros disolventes.
3. Estabilidad: los cambios de estabilidad debern ser mnimos en la sustancia y
no afectar la condicin germicida.
4. No deber ser toxica al hombre u otros animales: la sustancia deber ser letal
para los microorganismos y no para el hombre u otros animales.
5. Homogeneidad: la preparacin deber ser uniforme en su composicin de
manear que los ingredientes activos se encuentren en cada aplicacin.
6. No deber reaccionar con material orgnicos extrao: cuando se usan estos
desinfectantes en situaciones en las que adems de bacterias hay cantidades
considerables de material orgnico, muy poco, si no es que nada del
desinfectante, estar disponible para actuar contra los microorganismos.
7. Toxicidad para los microorganismos a la temperatura ambiente y a la del
cuerpo: para usar el compuesto, no ser necesario elevar la temperatura de la
existente en el ambiente donde se usara.
8. Capacidad de penetracin: a menos que la sustancia pueda penetrar atraves
de las superficies, su accin germicida se limitara al sitio de aplicacin.
9. No deber corroer ni teir: no deber producir rin u otras alteraciones en los
metales o teir o daar las telas.
10. Propiedad desodorante: lo ideal es que el desinfectante por si mismo tenga olor
agradable o sea inodoro.
11. Capacidad detergente: un desinfectante que a la vez sea detergente (agente
limpiador) lograra dos objetivos pues la accin limpiadora aumentara la
desinfeccin.
12. Disponibilidad: el compuesto deber estar disponible en grandes cantidades y a
precio razonables.

Seleccin de un agente qumico antimicrobiano:

Algunos de los factores que deben tenerse en consideracin al hacer la
seleccin de un agente qumico antimicrobiano para su aplicacin prctica
son :

1.- Naturaleza del material que se va a tratar.Un agente qumico usado para
desinfectar utensilios contaminados puede ser muy poco satisfactorio para su
aplicacin sobre la piel,es decir,puede daar seriamente las clulas de los
tejidos.En consecuencia,la sustancia seleccionada debe ser compatible con el
material al cual se plica.
2.-Tipo de microorganismo. No todos los microorganismos son igualmente
susceptibles a la accin inhibidora o mortfera de un agente qumico
especfico.Por ello,debe saberse que el agente seleccionado es efectivo contra
el tipo de microorganismos que hay que destruir.Por ejemplo,las esporas son
ms resistentes que las clulas vegetativas.Las bacterias Gram-positivas y las

Gram-negativas se diferencian en su susceptibilidad; Escherichia coli (Gramnegativa) es mucho ms resistente a los desinfectantes catipnicos que
Staphylococcus aureus (gram positivo).Diferentes cepas de la misma especie
varan tambin en cuanto a su susceptibilidad a un agente antimicrobiano
determinado.
3.-Condiciones ambientales. La temperatura ,pH ,tiempo,concentracin y
presencia de materia orgnica extraa,pueden tener influencia sobre la tasa y
la efectividad de la destruccin microbiana.El uso con xito de un agente
antimicrobiano requiere el conocimiento de la influencia de estas condiciones
sobre el agente determinado,de manera que pueda ser empleado bajo las
condiciones ms favorables.

Principales grupos de agentes qumicos antimicrobianos.

-Fenol y compuestos fenlicos
-Alcoholes
-Halgenos y sus compuestos
-Metales pesados y sus compuestos
-Detergentes
-Aldehdos
-Quimioesterilizantes gaseosos

GRUPO
PRINCIP
AL
Fenol y
compues
tos
fenlicos

CARACTER
ISTICAS

MODO DE
ACCION

Desnaturali
zan las
protenas ,
daan la
membrana
celular

Alcohole
s

Desnaturali
zan
protenas;ag
entes
deshidratan
tes;accin
detergente

Los
derivados
(hexilresorc
inol)reduce
n mucho la
tensin
superficial
Cuantos
ms
carbonos
tiene el
alcohol,es
ms
germicida

COMP
UESTO
S
Cresole
s (ms
germici
das
que el
fenol )

USO
RECOMEN
DADO
Desinfectan
te general

LIMITACION
ES

Metlic
o
(menos
bacteri
cida,m
s
txico);
etlico,
proplic
o

Antispticos
para l
apiel ; la
concentraci
n del 60
por ciento
mata a los
virus si no
hay materia
orgnica
extraa

Antisptico

Efectividad
microbiana
limitada;
irritantes y
corrosivas

Halgen
os ,Iodo

Halogenaci
n de la
tirosina;inac
tiv enzimas
y otras
protenas

Efectivo
contra
bacterias y
esporas

Cloro (y
compues
tos)

Se
combinan
con las
protenas de
la
membrana
celular y
con enzimas

El cloro se
usa para
desinfectar
el agua; los
compuesto
s de cloro
son ms
fciles de
usar y
tienen
muchas
aplicacione
s

Aldehdo
s

Rompen
enlaces de
hidrgeno;d
esnaturaliza
n protenas

Quimioe
steriliza
ntes
gaseoso
s

El xido de
etileno
alquila
compuestos
orgnicos;
inactiva
enzimas

Efectivos
contra
todos los
microorgani
smos
excepto
esporas
bacterianas
Mata todas
las formas
de vida

Compues
tos de
amonio
cuaterna

Desnaturali
zan
protenas;
daan la

Ms
germicidas
que otros
detergente

Tintura
de iodo
(disuelt
o en
alcohol
);
iodfor
os ( +
agente
s de
superfi
cie)
Hipoclo
ritos
(higieni
zan
utensili
os y
equipo
s)
clorami
nas
(agent
es
oxidant
es)
Glutara
ldehdo

Desinfecta
la piel

Irritante de
las
membranas
mucosas

Desinfecci
n del agua

Inactivados
por la
materia
orgnica;efe
ctividad
dependiente
del Ph.sabor
olor
objetables si
no se
controlan

Esterilizaci
n de
instrumento
s,fumigaci
n

Estabilidad
limitada; no
son
esporocidas

Oxido
de
etileno

Esterilizaci
n de
materiales
sensibles al
calor;
instrumento
s,equipos
grandes y
colchones
Desinfecci
n de la piel;
agentes
higienizante

Inflamable,p
otencialment
e explosivo
en forma
pura; accin
relativament
e lenta

Cloruro
de
cetilpiri
donio ;

No son
esporocidas

rio
(deterge
ntes
catinico
s)

membrana
celular

s;ms
bactericida
s contra
bacterias
Gram.positi
vas
fungicidas.

Zephir
an ;
Phemer
ol

Cristal violeta.
El violeta de metilo, comnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el
nombre dado a un grupo de compuestos qumicos empleados como indicadores de pH y
colorantes.
Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas.
Cuanto ms metilado est el colorante, su color ser de un violeta ms oscuro:

Tetrametilo (cuatro metilos) es conocido como Violeta de metilo 2B, y encuentra

usos especficos en qumica y medicina.

Pentametilo (cinco metilos) es conocido como Violeta de metilo 6B, y es ms

oscuro como colorante que 2B.

Hexametilo (seis metilos) es conocido como Violeta de metilo 10B, o

especficamente violeta cristal. Es mucho ms oscura que la 2B, y an ms oscura
que la 6Bk.

Aplicaciones.

El principal uso del violeta de metilo (por volumen bruto usado mundialmente) es el
de tintura textil de color prpura y para dar tonos violeta oscuro en pinturas y tinta
de impresin.

El violeta de metilo 2B (llamado sencillamente violeta de metilo) es usado en

qumica como un indicador de pH para probar los intervalos de pH de 0 a 1,0. En
el extremo cido de su intervalo de medicin, toma un color amarillo. En el
alcalino, se hace violeta azulado. El Violeta de metilo puede ser suministrado como
papel de prueba de pH, o puede ser suministrado como cristales puros y disueltos
en la muestra a ser probada.

En medicina, el violeta de metilo 10B es conocido como violeta de genciana y es el

ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias. El
violeta de genciana destruye clulas, y es usado en desinfectante de intensidad
moderada externo. El violeta de genciana es muy venenoso para la mayora de los
animales, cachorros y gatos incluidos; no debe ser usado para desinfeccin de la
piel de estos animales.

El violeta de metilo tiene tambin la habilidad de conectarse al ADN. Por lo tanto,

en ciencias biomdicas, es usado para ensayos de viabilidad celular. La conexin
al ADN puede tambin causar rupturas en el proceso de replicacin del ADN, el
cual puede llevar a mutaciones y cncer.

Normalmente es formulado para uso como indicador de pH en la variedad de

violeta de metilo como una solucin de 0,01 a 0,05 % en m/v y en la variedad de
violeta de cristal como una solucin de 0,02 % en m/v en agua.

En el rea de fsica, por su alta hiperrabilizidad, el violeta-cristal se utiliza como un

trazador fluorescente y en experimentos de emisin de efectos de ptica no-lineal.
Por ejemplo en la generacin del segundo-armnico-ptico. De hecho su
estructura multipolar (octupolar) representa una excelente ruta para observar
efectos pticos no-lineales en comparacin con los compuestos dipolares.

Estructura.

Propiedades fsico-qumicas:
Fragmentos o polvo verde oscuro o verdoso con brillo metlico y olor muy
dbil. Es soluble en agua y cloroformo. Es parcialmente soluble en alcohol (1
gramo se disuelve en 10 mL de etanol) y en glicerol (1 gramo se disuelve en 15
mL de glicerol). Es insoluble en ter.
Mecanismo de accin El mecanismo de accin es desconocido.
Espectro de actividad Antisptico de baja potencia. Activo frente a algunos
Gram positivos (especialmente Staphyloccocus spp.) y algunos hongos
(Candida spp.). Su actividad es mucho menor en Gram negativos y es
totalmente inactivo frente a esporas, virus y bacterias cido alcohol

resistentes. Su actividad se incrementa al aumentar el pH

Metales pesados y sus compuestos :
La mayora de los metales pesados,bien solos o en ciertos compuestos,son
dainos para los microorganismos.Los ms efectivos son el mercurio,la plata y
el cobre.

Metales pesados (Accin oligodinmica).Cantidades extremedamente

pequeas de ciertos metales,en particular de plata,pueden ejercer un efecto
letal sobre las bacterias;esto se conoce como accin oligodinmica por
derivarse de dos palabras griegas:oligos,que significa pequeo , y dynamis
que significa poder .El fenmeno se pone de manifiesto en el
laboratorio,colocando un trozo de metal limpio (cobre o plata,moneda) sobre
una placa inoculada.Despus de la incubacin una zona de inhibicin (no hay
crecimiento) rodea al metal.La cantidad de metal necesitada para este efecto
inhibitorio es extremadamente pequea,solo unas cuantas partes por milln.

Compuestos de metales pesados.Numerosos compuestos de metales pesados

tienen actividad germicida o antisptica.Los ms destacados compuestos
antimicrobianos de metales pesados son los de mercurio,plata y cobre.El
cloruro mercrico,que en una poca fue un popular desinfectante,ya no se
utiliza; sin embargo,varios compuestos orgnicos de mercurio
(mertiolato,mercurocromo y metaphen) son utilizados como antispticos.El
nitrato de plata ha sido usado durante mucho tiempo para la prevencin de las
infecciones gonoccicas de los ojos en los recin nacidos.Los compuestos de
cobre son ampliamente utilizados como fungicidas,en la agricultura.
Uno de los modos de accin de los metales pesados y de sus compuestos es
mediante la desnaturalizacin de las protenas.En el caso del cloruro
mercrico,la inhibicin va dirigida a enzimas que contienen grupos
sulfhidrlicos.

TINCIN DE GRAM
Tincin de Gram.Una de las tcnicas de tincin diferencial para bacerias,ms
importante y ms ampliamente utilizada,es la tincin de Gram.En este
procedimiento la extensin de clulas previamente fijada se somete a las
siguientes soluciones en el orden que se indica: cristal violeta,solucin de
yodo,alcohol (un agente decolorante) y safranina u otro colorante de contrste
adecuado.Las bacterias teidas por el mtodo de Gram caen dentro de dos
grupos.Uno de ellos ,el de las bacterias Gram positivas,conservan el colorante
cristal violeta y,por tanto,aparecen de color violeta oscuro.El otro grupo de las
bacterias Gram negativas pierden el cristal violeta al ser lavadas con el alcohol
y al teirse con el colorante de contraste safranina,que es rojo,aparecen de
color rojo.
Por qu el procedimiento de tincin de Gram tie de violeta a unas bacterias y
de rojo a otras? La respuesta parece hallarse en las diferencias existentes en la
estructura qumica de su superficie.

Soluciones en el
orden de su
aplicacin
1 Cristal violeta CV
2 Solucin de iodo I

3 Alcohol

REACCION Y ASPECTO DE LAS BACTERIAS

Gram-positivas
Gram-negativas
Las clulas se tien de
Las clulas se tien de
violeta
violeta
Se forma un complejo
Se forma un complejo
CV-I dentro de las
CV-I dentro de las
clulas. Las clulas
clulas. Las clulas
continan violetas
continan violetas.
Las paredes celulares se Se extraen lpidos de las
deshidratan, los poros
paredes celulares, los
merman; la
poros se agrandan y el
permeabilidad de la
complejo CV-I es
pared celular y de la
eliminado de la clula;

4 Safranina

membrana disminuye ;
el complejo CV-I no
puede salir de las
clulas ; las clulas
permanecen color
violeta.
Las clulas no se
afectan; permanecen de
color violeta

las clulas quedan

incoloras.

Las clulas toman este

colorante y se ponen de
color rojo

PROCEDIMIENTO :

Accin bacteriosttica selectiva del cristal violeta.

Preparar agar nutritivo, en 20 tubos de ensayo (4 para c/grupo), cada tubo con 15 ml de
agar nutritivo con la proporcin de 23g de Agar por cada 1000ml y calentarlos a ms de
45C.
Tomar 3 tubos de ensayo y echar 9ml de agua destilada, a cada tubo, con una pipeta.
Preparar una solucin acuosa de cristal violeta de (0.1%) y transferir 1ml de la solucin a
uno de los tubos con 9 ml de agua. Esto da una dilucin de 1:10 000; si de esta ltima
solucin preparada, transferimos 1ml al tubo de 9ml de agua destilada, tendremos la
dilucin de 1:100 000. Similarmente repitiendo el proceso anterior, si transferimos 1 ml a
otro tubo de 9ml de agua destilada obtendremos la dilucin de 1:1000 000.
Despus de llevar autoclave

Transferir 1ml de la dilucin 1:10 000 a una placa petri.

Transferir 1ml de la dilucin 1: 100 000 a otra placa petri.
Transferir 1ml de la dilucin 1:1000 000 a otra placa petri.

Verter el agar fundido en las tres placas de petri y mezclar bien el colorante con el agar
rotando suavemente la placa, para obtener una distribucin uniforme del colorante.
Verter el contenido del ltimo tubo de agar en la placa de petri sin colorante. Cuando haya
solidificado el agar, invertir las placas y dividir cada una en dos partes iguales parte A y
parte B; en estas dos zonas se debe inocular colonias preparadas anteriormente.
Invertir las placas e incubarlas a 37C por 48 horas.

Accin oligodinmica de metales pesados:

Lavar la moneda con agua destilada
Colocar la moneda al centro de una placa petri esterilizada.
Se inoculo el tubo con agar una gotita de cultivo del laboratorio de la determinacin de
calidad del agua.
Verter el agar dentro de la placa de petri que contiene la moneda
Dejar que se solidifique el agar.
Invertir las placas e incubarlas a 37C por 48 horas.

RESULTADOS:
Accin selectiva del cristal violeta:
Concentra
cin
1/10000

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 4

Grupo 5

A
+

A
+

A
+

A
+

B
+

B
+

B
+

B
+

1/00000
+
+
+
+
1/1000000 +
+
+
+
Sin
+
+
colorante
(+) Hay crecimiento
(- )No Hay crecimiento
*Escherichia coli : Gram negativo
*Bacilus : Gram positivo

Grupo
N 1
N 2
N 3
N 4
N 5

+
+

+
+

Colonia A
Gram (+)
Estreptobacilos
Gram (+)
Estafilococos
Gram (+)
Estafilococos
Gram (-)
Estafilococos
Gram (-)
cocos x

+
+
+

+
+
+

+
+
+

+
+
+

Colonia B
Gram (+)
Estreptobacilos
Gram (+)
Cocos x
Gram (+)
Estreptobacilos
Gram (+)
Cocobacilos
Gram (-)
Estreptococos

Discusin de resultados.
Teniendo en cuenta :
1:10 000 inhibe gram + : inhibe gram 1:100 000 inhibe gram + : no efecto gram 1:1000000 no efecto gram + : no efecto gram 1.- 1:10000 hubo crecimiento en todos los grupos ,no se ejerce funcin
bacteriosttica.
2.- 1:100 00
grupo 1 : debi de haber inhibido a las 2 colonias; sin embargo, la tabla de
datos muestran crecimiento.
grupo 2: debi de haber inhibido a las 2 colonias; sin embargo, la tabla de
datos muestran crecimiento.
grupo 3: no se inhibi el crecimiento de las colonias, las colonias en este grupo
son gram + ,segn la concentracin ,se debi haber inhibido el crecimiento.
grupo 4: la colonia A es gram (hubo crecimiento ) ,lo cual el cristal violeta
para esta concentracin no hace surgir efecto, la colonia B es gram + (hubo
crecimiento ) ,el cristal violeta debi haber actuado e inhibir el crecimiento.
Grupo 5 : las colonias A y B son gram - (hubo crecimiento ), el cristal violeta a
esta concentracin no tuvo efecto.

3.- 1 : 1 000 000 en todos los grupos ,donde hay colonias gram + y gram
(hubo crecimiento ) el cristal violeta no tuvo efecto sobre su crecimiento.

4.- sin colorante en los grupos 1,2,4 y 5 hubo crecimiento en todos las
placas, sin el cristal violeta las bacterias crecen normalmente.

ACCIN OLIGODINMICA DE METALES PESADOS

DISCUSIN DE RESULTADOS:

GRUPO 1 :

Se observ la zona oligodinmica

alrededor de la moneda.La moneda
fue acuada el ao 2010.

GRUPO 2:

A diferencia del grupo 1 ,en

esta placa se muestra
uniformidad ,y el halo de la
zona oligodinmica es
notorio.El ao de la acuacin
de la moneda fue 1995 .peso
del latn estimado es de 3.50
g.Se presenta la zona de
estimulacin y la zona de
crecimiento normal.

GRUPO 3:

En este grupo se mostr

solamente una zona
oligodinmica.Las colonias
crecieron tambin
alrededor de la moneda.El
crecimiento en toda la
placa fue de crecimiento
normal.

GRUPO 4

Se muestra una zona

oligodinmica,donde no hubo
crecimiento de bacterias,se
observa la zona de estimulacin
y la zona de crecimiento normal.

OBSERVACIONES
1.-Los resultados de los grupos no concuerdan con la teora de inhibicin y
accin bacteriosttica del cristal violeta en la mayora de casos.
2.-En las placas del grupo 3 ,se verti solamente 1ml del colorante .Se observ
una consistencia cremosa al momento de recoger las placas de la incubadora.

2.- Se observa que en las placas hubo crecimiento de bacterias no inoculadas

en estras.
3.-Los resultados del experimento no fueron los esperados,lo que pudo deberse
a una incorrecta manipulacin de los instrumentos ,no seguir debidamente las
indicaciones y no tener cuidado de la contaminacin al momento de realizarse
el experimento.

CONCLUSIONES

1.-El efecto del cristal violeta a diferentes concentraciones nos muestra que no
es eficiente en este experimento ,ya que bacterias gram + y gram - se
desarrollaron an cuando el colorante debi haber actuado. La placa sin
colorante muestra el crecimiento de bacterias del mismo modo que una placa
con concentraciones diferentes de colorantes.
2.-En todos los grupos se muestra al menos una zona oligodinmica, lo que nos
indica que los metales pesados (cobre ,zinc) inhiben el crecimiento de
bacterias alrededor de estos.
3.- Mediante la ayuda de la tcnica de la tincin de Gram se puede identificar
que tipos de bacterias podran ser inhibidas a diferentes concentraciones de
cristal violeta.

RECOMENDACIONES

1.- Verter adecuadamente las concentraciones de cristal violeta sobre la placa

Petri ,en caso no hacerlo, no verter la cantidad que resta cuando el agar ya
est solidificando.
2.-Al momento de contabilizar el crecimiento de bacterias ,se recomienda
contar solo el crecimiento de las bacterias inoculadas en estras.
3.-Manejar adecuadamente los instrumentos,inocular correctamente y tener
en cuenta la higiene al momento de realizar el experimento.
4.-No limpiar las monedas con alcohol para realizar el experimento.
5.-Realizar nuevamente el experimento para obtener resultados lo ms acorde
a la teora.

Referencias Bibliogrficas.

1.- Michael Madigan,John Martinko,Jack Parker ,Biologa de los microorganismos

,Madrid,Editorial Pearson ,2004.
2.-Michael J.Pelczar ,Elementos de Microbiologa ,Mxico,Editorial Mc-Graw Hill,1984.
3.- M Concepcin Casado Gonzlez,Factores qumicos contra microorganismos .
[Consulta : 28 abril 2015 ] Disponible en :
http://bc.inter.edu/facultad/yserrano/factoresfisicosqui.htm
4.- Dr.Victor Silva,Control de microorganismos [consulta :28 abril 2015 ] Disponible en :
http://clasedecontroldemicrorganismos.blogspot.com/

ANEXOS

COMPOSICIN DE LA MONEDA DE DIEZ CNTIMOS:

FOTOGRAFAS TOMADAS EN LABORATORIO :

ESTREPTOBACILOS GRAM +