TEMA 3

MICROSCOPIO
PTICO
COMPUESTO
(campo claro)

INSTRUMENTOS BSICOS EN
UN LABORATORIO

MO
LUPA

CONCEPTOS ASOCIADOS AL MO

Apertura numrica (AN):

Expresa el dimetro del haz luminoso que puede recoger el objetivo.

AN = n x sen
n = ndice de refraccin del medio que se encuentra entre la muestra y el objetivo
(aire n aprox = 1; vidrio o aceite n = 1.51
sen = semi ngulo del cono de luz que entra al objetivo

AN
Cono luminoso frente
al objetivo

sen
muestra

Rayo de luz

APERTURA NUMRICA

APERTURA NUMRICA

 Resolucin ( R): es la capacidad de un

sistema ptico discriminar como entidades
distintas dos puntos muy prximos entre
si.

R = / 2 AN
R (resolucin, m)
(longitud de onda de la luz empleada)
2 AN (aperturas numricas del objetivo y del condensador

(b)

(a)

Comparacin entre la informacin obtenida en las imgenes tomadas con

un microscopio ptico y uno electrnico con una magnificacin
comparable
(a) Fotografa del tejido muscular esqueltico que se impregno en plstico, se
corto a 1 m y se fotografi con un microscopio ptico con una lente de
objetivo para aceite de inmersin. (b) Corte adyacente al empleado para la
parte a que se corto a 0.025 m y se examino al microscopio electrnico con
una magnificacin comparable a la imagen en a. (CORTESA DE DOUGLAS E. KELLY Y M.
A. CAHILL.)

Lmite de resolucin (LR): Menor distancia a la

cul dos puntos A y B pueden ser observados de
manera independiente (separados).
A

LR

LR

A+B

A+B

Lmite de Resolucin= 0.61 / n x sen

AN

LR= 0.61 / n x sen

Factores que afectan el LR

Longitud de onda
ndice de refraccin del medio
Apertura numrica
Aumento

AN

LR= 0.61 / n x sen

LR depende de:
- Longitud de onda
- Apertura numrica
(objetivo-aumento)
Concepto inverso al poder de resolucin
= un instrumento con gran poder de resolucin
tiene un valor numrico de LR muy pequeo.

PODER DE RESOLUCIN (PR)

Se define como el inverso de la mnima distancia
que tiene que haber entre dos puntos A y B, para que
ambos se observen como unidades independientes.

PR = 1/LR
LR, PR, R son conceptos relacionados

LR aprox. 0,1 mm

LR= 0,1- 0,2 m

Conceptos bsicos

x10

MAGNIFICACIN VS RESOLUCIN

b
c

Magnificacin
vaca

PROFUNDIDAD DE CAMPO (PC)

Profundidad de campo: capacidad de ver enfocados
simultneamente distintos planos de la preparacin
o muestra.

PUNTO FOCAL Y DISTANCIA FOCAL

Punto focal

Punto donde
confluyen los
rayos luminosos
refractados
despus de
atravesar la lente

Distancia focal

Distancia que separa el punto focal del centro ptico de la lente.

Distancia desde la lente frontal del objetivo a la preparacin
enfocada.

Microscopio ptico compuesto

Microscopio ptico compuesto-Tipos

MO binocular de visin mltiple

Partes del Microscopio ptico compuesto

Sistema ptico: Constituido por dos

juegos de lentes
Lentes Oculares
(segundo aumento )

Lentes Objetivas
(primer aumento)

Lente objetiva

Cdigo de color en los objetivos del MO

ESTRUCTURA DE LOS
OBJETIVOS

OBJETIVOS SECOS/OBJETIVOS DE
INMERSIN
Difieren por la naturaleza del medio
impuesto entre el cubre objeto de la
muestra y la lente frontal del objetivo.
OBJETIVO SECO: medio (aire, n= 1)
OBJETIVO DE INMERSIN: medio
(aceite, n= 1,515, semejante al n del vidrio
del porta y cubre objeto)

Objetivo
de
inmersin
Objetivo seco

Objetivo
de
inmersin
Objetivo seco

El ndice de refraccin de un medio (n), es una medida

para saber cunto se reduce la velocidad de la luz, dentro
del medio transparente en estudio.
n= ndice de refraccin
c= velocidad de la luz en el vaci
v= velocidad de la luz en el medio
material transparente

n= c/v

Aceite de cedro

1,515

Lente ocular
Aumento adicional de la imagen proporcionada
por la lente objetiva.
Valores inscritos (10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x).

Otras anotaciones:
UW: Ultra wide, oculares con campo de visin
amplio.

H: alto punto focal (observado con lentes)

Plan-comp: oculares que corrigen curvatura de
campo y dan campos planos

Ocular Periplan. Diseo avanzado

Lente ocular

CAMPO DEL MICROSCOPIO: crculo visible que se observa

a travs del ocular (general). Rectangular (hematologa y coprologa)

Sistema de iluminacin
Luz artificial
Luz natural

Bombillas de tungsteno y halgenas

Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz)

Sistema de iluminacin

http://ofershop.com/microscopios/index.htm

Diafragma o Iris con mecanismo para variar la apertura.

Tomado de Cross M, Cole M. Modern Microscope (70).

CARACTERSTICAS DE LA
IMAGEN-MO CAMPO CLARO

Corte transversal msculo esqueltico

Imagen plana (eje x,y)

Imagen aumentada
(hasta 1000 x (2000x)
Imagen invertida
Imagen virtual
40x
http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/

Imagen plana (eje X,Y)

Y
4

Imagen aumentada

Primer aumento
(Objetivos)

Segundo aumento
(Oculares)

AUMENTO TOTAL = Aumento del objetivo x Aumento del ocular x cte (1)

Imagen invertida
Que ocurre en los objetivos del microscopio ?????

El objeto (muestra) est colocado un poco ms all del foco.

La imagen ser real e invertida y cada vez ms grande
cuanto ms cerca este el objeto del foco

Imagen invertida
Que ocurre en los oculares del microscopio ?????

Lente ocular: Emplea la imagen formada

por el objetivo (imagen intermedia) para
formar una imagen virtual y aumentada
del objeto (muestra).

http://ofershop.com/microscopios/index.htm

Imagen invertida
Que ocurre en los oculares del microscopio ?????

Formacin de la imagen virtual

Son imgenes subjetivas que no podrn ser recogidas o proyectadas sobre una
pantalla o pelcula fotogrfica.
Son percibidas gracias a la posibilidad que tiene el globo ocular de seguir por
detrs del objeto observado, la proyeccin de rayos divergentes y los hace
confluir en la retina para constituir la imagen virtual.

TERCER SISTEMA DE LENTES

La crnea se comporta como una lente tipo menisco y el cristalino como

una lente biconvexa.

CALIBRACIN DEL MICROSCOPIO

Micrmetro o
retculo ocular

SE REQUIERE

Micrmetro objetivo

Micrmetro ocular

Placa de vidrio

Escala de referencia

Micrmetro objetivo
Portaobjeto
10 div. pequeas

10

CALIBRACIN DEL MO
http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo2.pdf

Obj. 4x = X m
Obj. 10x = X m
Obj. 40 x = X m
Obj. 100 x = X m

Clculo de aumentos (MO y fotografa)

ESCALA

Clculo de aumentos

3 m

Microscopi invertit

MICROSCOPIO INVERTIDO
Estructura invertida en
comparacin con el MO
convencional.
Fuente de luz ubicada
por encima de la platina.
Principio de
funcionamiento y
formacin de la imagen,
igual que el MO
convencional.

APLICACIONES- microscopio ptico invertido

Usado en la
observacin de
cultivos celulares
(clulas vivas) sin
preparacin previa.

Estudios fisiolgicos
21

22

Alkaline phosphatase activity in a coculture of two intestinal cell lines. Localization

of alkaline phosphatase activity (in red) was identified by cytochemistry in a coculture
of the human intestinal cell lineages Caco-2 and HT29-5M21.

APLICACIONES- microscopio ptico invertido

Usado en estudios
FIV (manipulacin
de vulos).

FIV: Microinyeccin espermtica

FIV: Microinyeccin espermtica

Consiste en la introduccin mecnica de un espermatozoide dentro del ovocito

Ejemplo de microscopio invertido: Microscopio confocal

ANALISIS DE IMAGEN

Ordenadores

Microscopio

+
Cmara de vdeo

Se trabaja sobre la imagen

con programas informticos

Imagen ptica u electrnica

directa de los microscopios
(imagen analgica= imagen convencional)

Sistema electrnico

Imagen digitalizada
(imagen de pxel)

ANALISIS DE IMAGEN

Microscopa virtual: amplio uso en

el diagnstico patolgico

Microscopa virtual-Aplicaciones
Uso a distancia de recursos
interactivos para el diagnstico
y la investigacin
Docencia (acceso a bases de
datos remotas de imgenes
microscpicas)
Reconstruccin 3D a partir de
mltiples microgrficas.
Permitir compartir bases de
datos de las diversas
instituciones

Microscopa virtual-Ejemplo

MATERIAL COMPLEMENTARIO

Partes del MO. Funcionamiento

Relacin de vdeos
http://www.youtube.com/watch?v=AC_X87DexiY&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=0Tunrrm3OlM&NR=1

http://www.youtube.com/watch?v=KzNsuiqW1LQ&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=L6d3zD2LtSI
http://www.youtube.com/watch?v=-A9tVEsTi9w&NR=1

http://www.youtube.com/watch?v=XbLD2zJDEzs&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=dqdKGjG_nR8&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=KfqQErL64cY&feature=related

TEMA 4
TCNICAS DE PREPARACIN DE
MUESTRAS PARA MO.
APLICACIONES ESPECFICAS DE LA
MICROSCOPA PTICA EN
BIOMEDICINA

USO DEL MO COMPUESTO

Observacin directa de clulas vivas Cultivos celulares

Observacin de preparaciones temporales

-Directamente de la muestra
clnica
-A partir de cultivos
microbianos

- Citoqumica

Observacin de preparaciones permanentes

- Histoqumica

Observacin de preparaciones temporales

Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas
7

Espermiograma

Micosis oportunista
Candidiasis (Candida albicans)

Observacin de preparaciones temporales

Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas. Se
realiza un fresco con KOH
8

Pitiriasis versicolor

Malassezia furfur

Observacin de preparaciones temporales

Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas
(Hongos dermatofitos de los gneros: Microsporum, Trichophyton, Epydermophytom)

Trichophyton mentagrophytes

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Tincin Gram (Citoqumica)
11

Bacillus brevis

12

Bacillus anthracis

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Tincin Hematoxilina-eosina en sangre humana (Citoqumica)
13

Eje. Tincin de verde malaquita para endosporas bacterianas (Citoqumica)

Endospora

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Prueba de Papanicolau (Citoqumica)
14

16

15

Observacin de preparaciones permanentes

Eje. Observacin de tejidos (Histoqumica)
Smooth muscle, muscularis externa of colon, H&E, x132

Ovary, medulla containing multiple blood vessels, H&E, x33

17

18

19

20
Epidermis, H&E, x100

Heart, H&E, x130

MICROSCOPIOS PTICOS ESPECIALES

1

Modifican la manera en
que incide la luz sobre el
espcimen: emplea
condensadores o filtros

Modifican la fuente emisora

de luz: cambia la luz
blanca por la luz ultravioleta
o rayos lser (tambin emplean filtros)

- Microscopio de campo oscuro.

- Microscopio de polarizacin.

- Microscopio de contraste de fases.

- Microscopio interferencial
o de ptica Kormaski.

- Microscopio de fluorescencia o de
luz ultravioleta.
- Microscopio confocal