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TRABAJO de LABORATORIO Grupo-3 (BIO 257301 - 2015)

PROTOCOLOS
1.- METODO de HEMATOXILINA - CROMOTROPO
MATERIAL UTILIZADO:
1.- Aorta de cerdo fijado en formalina
2.- Biopsia de aorta humana fijado en formalina
(Donacin: Anatoma Patolgica, Fac Medicina, UdeC)
1) DESPARAFINIZACION: Cortes de tejido incluidos en parafina se pasan por 5 min en baos
sucesivos de XILOL: 1, 2 y 3.
2) HIDRATACION: Cortes provenientes del Xilol se someten a lavados sucesivos en:
Etanol absoluto: 5 min, etanol 95 (1 y 2): 5min, etanol 70: 5 min, lavado breve en etanol 70 y se
pasan al agua destilada.
3) COLORACION NUCLEAR: Incubar los cortes hidratados en una solucin de HEMATOXILINA de
HARRIS durante 2 min (Ncleos: azul oscuro a violeta).
4) VIRAJE de la COLORACION NUCLEAR: Dejar los cortes en agua corriente durante 10 a 15 min y
controlar al microscopio hasta que los ncleos adquieran la coloracin adecuada. Pasar por agua
destilada antes de continuar con el paso siguiente.
5) Pasar los cortes durante 2 min a alcoholes de grado creciente: 50, 70 y 80.
6) TINCION CITOPLASMATICA: Introducir los cortes en un bao de CROMOTROPO 2R al 01% en
etanol de 95 (0.1 gr de Cromotropo 2R en 100 ml de etanol 95, filtrar y adicionar 1 gota cido
actico) por 3 min.
7) LAVADO: Lavado en alcohol de 95 y continuar con la deshidratacin.
8) DESHIDRATACION: Pasar los cortes por baos sucesivos de:
Alcohol absoluto (1 y 2): 5 min.
Si la deshidratacin no ha sido completa se contaminarn los baos posteriores de xilol (se
tornan lechosos), por lo que es necesario volver a deshidratar y eliminar el xilol contaminado.
9) MONTAJE: Pasar los cortes por baos sucesivos de: Xilol (1, 2 y 3): 5 min. Los cortes permanecen
en el ltimo xilol hasta el final del montaje. Importante tener cuidado con la orientacin de los cortes
(para evitar daarlos al limpiar). Cubrir con cubreobjeto limpio en presencia del medio de montaje
entelln.
10) LIMPIEZA Y ROTULADO: Los preparados se limpian del exceso de medio de montaje, y rotulan
utilizando el nmero de protocolo, nombre de la tincin, nmero del grupo y ao.
11) OBSERVACION al microscopio y ANALISIS de resultados de acuerdo a los objetivos propuestos.
SELECCION de muestras para ser fotografiadas y utilizadas en el informe y presentacin final.

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RESULTADOS:

Ncleos: negros,
Mitocondrias: negras
Estriaciones clulas musculares: negras.

2.- TINCION TRICROMICA de GALLEGOS

(Vvoli, F. A. 1969. Tcnica Microgrfica. Ed. Rosalo. Bs. As. 544 pp.)
1) Desparafinar e hidratar los cortes hasta el agua destilada (segn protocolo Hematoxilina
Cromotropo)
2) Teir por 5 min a temperatura ambiente en solucin de FUCSINA de ZIEHL BASICA FENICADA:
Mezclar una parte de solucin madre (Fucsina Bsica al 1%, 10 ml de Etanol 96, Fenol al 5%)
con 9 partes de agua destilada.
3) Secar cuidadosamente el preparado entre papel filtro para retirar el exceso de agua.
4) Diferenciar introduciendo brevemente el preparado en dos baos de Virofijador (20 ml formalina al
40%, 10 ml cido actico glacial, 100 ml agua destilada). Controlar al microscopio.
5) Teir por 20 a 30 segundos en Indigo Carmn al 0.25% en sol. saturada de Ac. Pcrico recin
preparada y filtrada.
6) Pasar rpidamente por 2 alcoholes absolutos.
7) Montaje: Pasar las preparaciones por 3 baos sucesivos de Xilol durante 5 min en cada uno y
montar en blsamo de entelln.
8)

Continuar con puntos 10 al 12 de tcnica de Hematoxilina Cromotropo.

RESULTADOS: Ncleos y fibras elsticas: rojo

Citoplasmas y queratina: amarillo
Fibras colgenas: azul - verdoso
Fibras reticulares: azul - verdoso menos intenso.

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3.- METODO de ORCEINA para COMPONENTE ELASTICO
1) Desparafinar e hidratar los cortes hasta el alcohol de 70.
2) Teir por 30 min a temperatura ambiente en solucin de Orcena al 1% (1 gr. orcena en 100 ml de
etanol al 70% y 2 ml de cido clorhdrico concentrado). La mezcla es estable.
3) Eliminar exceso de colorante en lavado breve de alcohol de 70.
4) Diferenciar rpidamente en alcohol-cido (alcohol 70 en ac. clorhdrico al 1%) Controlando con el
microscopio.
5) Lavado en agua destilada: 2 cambios por 5 min cada uno.
6) Tincin nuclear con HEMATOXILINA de HARRIS. Seguir pasos 3 y 4 en Tcnica de Hematoxilina Cromotropo, sin pasar por la solucin de alcohol-cido.
7) Deshidratacin: Pasar los cortes rpidamente por 2 baos de alcohol 96 y posteriormente 5min en 2
baos de alcohol 100.
8) Monaje, Limpieza y Rotulado: Seguir pasos 9 al 12 de Tcnica Hematoxilina Cromotropo.
RESULTADOS:

Fibras elsticas: Caf - rojizo

Nucleos: Azules
Colgeno: Eventualmente tincin de fondo muy suave.

ANALISIS FINAL DE LAS MUESTRAS:

Analizar las caractersticas histolgicas de la muestra normal y comparar con la biopsia humana en
base a las distintas tinciones topogrficas realizadas.
BIBLOGRAFIA

- ROBBINS Y COTRAN, PATOLOGA ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL. Kumar, Abbas y Fausto,

2010 Ed. Interamericana
- THEORY AND PRACTICE OF THE HISTOLOGICAL TECHNIQUES J.D. Bancroft,
M. Gamble 5 ed. 2002. Churchill Livingstone.
- PRACTICAL HISTOCHEMISTRY, Chayen J, Betinsky, L, Butcher R. John Wiley and
Sons, 1973.
- CELLULAR PATHOLOGY TECHNIQUES, CFA. Culling. RT. Allison, WT. Barr.
Butterworth, 1985.
- "UNDERSTANDING HISTOCHEMISTRY", RW. Horobin, John Wiley and Sons, 1988.
- FIXATION HISTOCHEMISTRY, Stoward P.J. Chapmanand Hall, 1973.