La Transfeccin

Definicin = es un procedimiento que introduce cidos nucleicos

extraos en las clulas para producir clulas modificadas
genticamente.

El propsito principal de la transfeccin es estudiar la funcin de

los genes o productos genticos mediante el mejoramiento o la
inhibicin de la expresin de genes especficos en las clulas, y
para producir protenas recombinantes en clulas de mamfero.
Ejemplos son:
1. La terapia gentica - introduciendo un gen de inters en la
clula para curar una enfermedad o mejorar los sntomas.
2. Generacin de clulas madre pluripotentes (clulas iPS)
inducidas mediante la transfeccin de tres o cuatro factores
de transcripcin
3. Procedimientos
knock-down
de
pequeos
RNA
de
interferencia (siRNA)
4. La produccin de activador plasmingeno de tejido humano
en clulas inmortalizadas de ovarios de hmster chinos
(CHO) para fines teraputicos.

Es una herramienta analtica poderosa para estudiar la funcin de

los genes y los productos de los genes (productos genticos) en
las clulas, la regulacin y funcin de protenas.

Existen 3 mtodos:
1. Biolgicos
2. Qumicos
3. Fsicos
4. Nuevo mtodo - Combinacin de Transfeccin por puntosdirectos y de mRNA (RNA mensajero)

Estos mtodos han avanzado para hacer posible la introduccin de

cidos nucleicos a regiones subcelulares especficas de las clulas
a travs del uso controlado de sistemas precisos de microscopios
de lser. Cada mtodo tiene sus ventajas y desventajas, y el
mtodo optimo va a depender de dos cosas:
1. Diseo experimental
2. Objetivos

Cada mtodo usa diferentes enfoques dependiendo el tipo de

clula y propsito.

El mtodo ideal debe tener una alta eficiencia de la transfeccin,

baja toxicidad celular, efectos mnimos sobre la fisiologa normal, y
ser fcil de usar y reproducible.
Los materiales genticos introducidos (DNAs y RNAs) en las clulas
existen de manera estable o transitoria, dependiendo de la
naturaleza de los materiales genticos.

Transfeccin Estable
Es una tcnica mediante la cual
se introduce material gentico
que usualmente tiene un gen
marcador
de
seleccin
(Transgenes) se integran en el
genoma del husped y mantener
la expresin del transgen, incluso
despus de las clulas husped
se replican.

Transfeccin Transitoria
Genes
transfectadas
transitoriamente slo se expresan
por un perodo limitado de tiempo y
no se integran en el genoma (Fig.
1b)
[1].
Transitoriamente
transfectadas materiales genticos
se pueden perder por factores
ambientales y la divisin celular,
por lo que la eleccin de la
transfeccin estable o transitoria
depende
del
objetivo
del
experimento.

Los mtodos biolgicos

El mtodo ms comnmente utilizado en la investigacin clnica es la
transfeccin mediada por virus, tambin conocido como la transduccin [4]. La
transfeccin mediada por virus es altamente eficiente y es fcil de lograr la
expresin del transgen sostenible in vivo debido a la naturaleza viral de la
integracin en el genoma husped. Por ejemplo, el virus retrovirus de la
leucemia murina (MLV) se ha utilizado como un vector viral para establecer la
expresin transgnica sostenible en los seres humanos [7, 8]. MLV integra su
ADN en el genoma del husped y el ADN integrado se expresa en el husped.
El ADN MLV integrada replica que el genoma del husped hace. En

consecuencia, se segrega en las clulas hijas, lo que permite la expresin del

transgen sostenible.

Los principales inconvenientes de la transfeccin mediada por virus son

inmunogenicidad y la citotoxicidad. La introduccin de un vector viral puede
causar una reaccin inflamatoria y una mutacin por insercin, porque los
vectores virales se integran en el genoma del husped al azar, lo que puede
perturbar los genes supresores de tumor, activan oncogenes, o interrumpen
genes esenciales [9]. Otra desventaja de este mtodo es que un paquete de
virus ha limitado espacio para un gen extrao para mantener la infectividad.
Por estas razones, se ha hecho mucho esfuerzo para desarrollar mtodos de
transfeccin no virales a pesar de que la transfeccin mediada por virus es
altamente eficaz y fcil de usar.

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Los mtodos qumicos
Mtodos de transfeccin qumica son los mtodos ms utilizados en la
investigacin contempornea y fueron los primeros en ser utilizados para
introducir genes extraos en clulas de mamfero [10]. Los mtodos qumicos
comnmente utilizan polmero catinico (uno de los productos qumicos ms
antiguos utilizados), fosfato de calcio, lpido catinico (el mtodo ms popular),
y el cido amino catinico [10-12]. El principio subyacente de mtodos
qumicos es similar. Productos qumicos cargados positivamente hacen
complejos de cido / qumicas nucleicos con cidos nucleicos cargados
negativamente. Estos complejos de cido / qumicas nucleicos cargados
positivamente son atrados a la membrana celular cargada negativamente. El
mecanismo exacto de cmo nucleico complejos de cido / qumicos pasan a
travs de la membrana celular es desconocida, pero se cree que la endocitosis
y fagocitosis estn involucrados en el proceso. ADN transfectado debe ser
entregado al ncleo para ser expresado y de nuevo el mecanismo de
translocacin al ncleo no se conoce.

La eficiencia de transfeccin de mtodos qumicos depende en gran medida de

factores tales como el proceso resulta en una baja eficiencia de transfeccin de
cidos nucleicos / relacin de qumica, solucin de pH, y las condiciones de la
membrana celular, por lo que, especialmente in vivo, en comparacin con los
mtodos mediada por virus. Sin embargo, estos mtodos tienen mritos de
relativamente baja citotoxicidad, no mutagnesis, sin ADN extra-realizacin, y
no hay limitacin de tamao en el cido nucleico envasado. La eficiencia de
transfeccin qumica tambin vara dependiendo del tipo de clula.

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Los mtodos fsicos
Los mtodos de transfeccin fsicos son los mtodos ms recientes y utilizar
diversas herramientas fsicas para suministrar cidos nucleicos. Los mtodos
incluyen la inyeccin directa micro, suministro de partculas biolstico, la
electroporacin, y basado en lser de transfeccin [13]. En resumen, el mtodo
micro inyeccin inyecta directamente el cido nucleico en el citoplasma o
ncleo [14, 15]. Este mtodo proporciona cidos nucleicos en las clulas, pero
exige habilidad, a menudo causa la muerte celular, y es muy intensivo en
mano de obra. Suministro de partculas biolstico emplea partculas de oro que
conjugan con los cidos nucleicos [16, 17]. Los conjugados de cido / partculas
nucleicos se dispararon a continuacin, en las clulas receptoras a una
velocidad alta ("pistola de genes"). Este mtodo es sencillo y fiable pero
requiere instrumentos caros y provoca dao fsico a las muestras. La
electroporacin es el mtodo fsico ms ampliamente utilizado. El mecanismo
exacto es desconocido, pero se supone que un impulso elctrico corto perturba
las membranas celulares y hace agujeros en la membrana a travs de la cual
pueden pasar los cidos nucleicos [18]. Debido a que la electroporacin es fcil
y rpido, que es capaz de transfectar un gran nmero de clulas en un corto
perodo de tiempo una vez que se determinan las condiciones ptimas de
electroporacin. Laser-transfeccin mediada (tambin conocido como
optoporation o phototransfection) utiliza un lser de pulso para irradiar una
membrana celular para formar un poro transitorio [19-22]. Cuando el lser
induce un poro en la membrana, cidos nucleicos en el medio se transfieren a
la clula debido a la diferencia osmtica entre el medio y el citosol. El mtodo
lser permite a uno observar la transfeccin de clulas y para hacer poros en
cualquier ubicacin en la clula. Este mtodo se puede aplicar a clulas muy
pequeas, ya que utiliza un lser, pero requiere un sistema de lser
microscopio caro. Adems de los mencionados anteriormente, hay otros
mtodos fsicos utilizando ultrasonido (sonoporacin) y el campo magntico
(magnetofection) [23-25].

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La transfeccin de ARN
La transfeccin de mRNA tiene varios mritos ms de transfeccin de ADN
[26]. Los mritos incluyen ningn riesgo de integracin en el genoma del
husped, la eficiencia de transfeccin del ciclo celular independiente, sin
necesidad de vectores inducibles inmunes, y la expresin regulable y rpida.
Uso de mRNA transfeccin, se puede introducir cualquier nmero de mRNAs en
una clula, superando as la sobreexpresin de los genes. Estas ventajas se
originan principalmente en el hecho de que el ARNm no necesita ser situado en
un ncleo para ser expresado. ADN transfectado debe llevar a una clula
husped o promotor especfico de tejido que se transcribe a ARNm y el nivel de
expresin se determina por la fuerza del promotor. En contraste con la

transfeccin de ADN, se puede ajustar los niveles de expresin cambiando la

cantidad de mRNA transfectadas y la frecuencia de transfeccin en el ARNm de
la transfeccin. Otros fuertes ventajas de mRNA transfeccin son:

mRNAs transfectadas pueden ser expresados en cuestin de minutos despus

de la transfeccin, ya que se salta el proceso de translocacin al ncleo y de la
transcripcin; y
transcriptoma (poblacin de ARNm) se puede utilizar para la transfeccin, que
es prcticamente difcil en la transfeccin de ADN (Fig. 2) [20, 27, 28].
ig. 2
Micrografas de la neurona del hipocampo de rata lipotransfected con transcrito
in vitro-in-rata Gria4-GFP mRNA. Imagen (a) DIC. (B) Imagen de fluorescencia
antes de la transfeccin. c, d, e, y f. Las imgenes de fluorescencia 2, 4, 6, y 8
h, respectivamente, despus de ...
Por estas razones, la transfeccin de RNA est atrayendo inters con fines
teraputicos [29]. Sin embargo, tenemos que reconocer que madurado ARNm
se compone de cinco estructuras significativas (la capitalizacin, la regin 5 'no
traducida (5'UTR), marco de lectura abierto (ORF), 3' regin no traducida
(3'UTR), y poli-A la cola ) y se somete a modificaciones de nuclesidos, que son
importantes para la traduccin del mRNA [30, 31]. Por tanto, el plsmido usado
para la transcripcin in vitro debe ser diseado con la consideracin de todos
los factores que afectan a la estabilidad y la eficiencia de traduccin. Manejo
de mRNA exige ms precaucin pero mRNA transfeccin alienta alternancia
con la transfeccin de ADN para muchas aplicaciones.

ARN de interferencia (RNAi) es una poderosa herramienta para knock-down

genes especficos y observar los consiguientes cambios de fenotipos [6, 32].
Pequeos RNAs inhibidores introducidas (siRNA) forma silenciar complejo
(RISC) en la clula y el RISC ARN inducida inhibe la expresin de la expresin
del gen diana. Los mtodos ms comunes utilizados para entregar siRNA son
lpidos entrega / polmero mediada y entrega mediada por virus. A pesar de la
amplia utilizacin de siRNA, todava se estn haciendo grandes esfuerzos para
desarrollar ms eficaz, seguro, y mtodos fiables para entregar siRNAs en las
clulas, debido a la gran potencial de RNAi en uso clnico para el tratamiento
de enfermedades [33]. Ambos relativamente nuevos mtodos de transfeccin,
mRNA y siRNA transfeccin, conducen a nuevas formas de ejecutar la
investigacin de clulas con sus propias ventajas distintivas.

Transfeccin de una sola clula

Cada clula tiene distintos patrones de expresin de genes, incluso cuando

comparten similitudes morfolgicas. Debido a que las funciones de una clula
se determinan por su ubicacin y hora, resolucin de una sola clula de la
expresin gnica es importante para dilucidar la funcin del gen. Para
conseguir una resolucin de una sola clula de la funcin gnica, se necesitan
mtodos de transfeccin de una sola clula fiables. Algunos mtodos de
transfeccin fsicas se han aplicado a la transfeccin de una sola clula con
buenos resultados. Ejemplos son:

microinyecciones utilizando una aguja de vidrio muy pequea, nano-aguja,

femtosyringe. y-microscopa de fuerza atmica (AFM) consejos [34-37];
electroporacin utilizando una micropipeta llena de cidos nucleicos y un
campo elctrico [38]; y
phototransfection utilizando un lser multi-fotn [20].
Todos los mtodos se realizan bajo un microscopio de manera que las clulas
transfectadas se pueden perdan en tiempo real. Micro-inyeccin es sencillo y
eficiente, pero todos los tipos de inyectores realmente perforar las membranas
celulares resultantes en dao fsico a las clulas. Electroporacin de clulas
individual proporciona de manera eficaz cidos nucleicos en clulas
individuales y se puede aplicar fcilmente in vivo. Electroporacin de una sola
clula de aumento de protena de fluorescencia verde (EGFP) plsmido ha
demostrado las caractersticas de morfologa y el crecimiento de una sola
neurona in vivo [38]. Phototransfection es el medio ms exacto de la entrega
de los cidos nucleicos (Fig. 3). Debido a que los nmeros y tamaos de
agujeros en la membrana celular se pueden ajustar, este mtodo es la forma
ms adecuada de la entrega de mRNAs de poblacin. La ventaja adicional de
phototransfection es que podemos dictar localizacin subcelular a travs del
cual pasan los cidos nucleicos (por ejemplo axn o la dendrita de la neurona),
que no es posible por electroporacin. La introduccin de cidos nucleicos en
una ubicacin subcelular es importante para el estudio de las clulas
polarizadas individuales en la que diferentes dominios celulares realizan
actividades distintas. Las neuronas, sobre todo, tienen soma, dendritas y
axones, cada uno con una funcin diferente y localizada la expresin gnica.
Por ejemplo, la transfeccin de la protena E-26-like 1 (Elk-1) mRNA en las
dendritas de las neuronas de rata primario intacto muerte celular inducida pero
la introduccin de Elk-1 mRNA en el cuerpo celular no causar la muerte celular
[20]. Este experimento demostr que la localizacin de ARNm especfico altera
significativamente la funcin del ARNm, que era imposible hacer usando
mtodos de transfeccin tradicionales. El experimento no se pudo realizar sin
una combinacin de mRNA de la transfeccin y de la transfeccin de
localizacin subcelular. Por lo tanto, la combinacin de mRNA transfeccin y
phototransfection es una poderosa herramienta para el estudio de la funcin
gnica en clulas individuales en virtud de la entrega de punto dirigida y la
accin inmediata de mRNA.

Fig. 3
Fig. 3
Una ilustracin de phototransfection. Los rayos lser (flashes verdes) crean
agujeros en regiones especficas de una sola clula (localizaciones
subcelulares) y cidos nucleicos (puntos rojos) se entregan en las reas locales
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Panorama
Mtodos de transfeccin estn evolucionando rpidamente. Incluso dentro de
una clase, muchos productos y tecnologas nuevas se ponen en marcha cada
ao con una mejor eficiencia y menor citotoxicidad. Desde el mtodo mediada
por virus al mtodo lser mediada, cada mtodo tiene sus propias ventajas y
desventajas por lo que la seleccin del mejor mtodo depende de objetivos
experimentales del experimentador.

Tecnologa de transfeccin futuras deberan ampliar en dos direcciones, siendo

lo suficientemente precisa para transfectar regiones subcelulares y hasta la
transfeccin de todo el individuo. La capacidad para suministrar cidos
nucleicos extranjeros (especialmente de mRNA) en localizaciones subcelulares
(por ejemplo, los axones o dendritas) y orgnulos (por ejemplo, las
mitocondrias, aparato de Golgi, o ncleo) se abrir una nueva era para la
investigacin gentica porque va a cambiar la forma de pensar y evaluar la
funcin de los genes en una clula. Adems de los perfiles de expresin gnica
global de una clula, la localizacin de productos gnicos expresados juega un
papel crucial en la determinacin de la funcin de una clula [20]. Mientras
tanto, se necesitan mtodos de transfeccin seguros y confiables que pueden
ser aplicables a los seres humanos para establecer la teraputica clnica.

En resumen, la metodologa de transfeccin se ha desarrollado

rpidamente y diversa. En consecuencia, ahora tenemos un montn de
opciones para elegir, bien colocado entre nuestras necesidades
experimentales o clnicos. Sin embargo, como la investigacin con
clulas progresa, las tecnologas de transfeccin ms avanzados se
encuentran todava en la demanda