COORDINACIÓN POLICIA CIENTIFICA

CRIMINALISTICA.
LABORATORIO

Técnica de Extracción de DNA en Saliva

Objetivo: Extracción de DNA genómico de muestras de Saliva.

Pruebas de orientación y confirmación en el diagnóstico de restos

de saliva

Pruebas de orientación se basan en la detección de actividad alfaamilasa.

Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentra también en el

páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en los fluidos
vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia de saliva
ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto de fluidos
orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfa-
amilasas) y en plantas (tipo beta-amilasas).
Su detección en el laboratorio se basa en la utilización del sustrato propio de la
enzima, el almidón, marcado con una molécula coloreada formando un
complejo insoluble. La acción hidrolizante del enzima liberará la molécula
coloreada, que se vuelve soluble, apareciendo un producto coloreado que
puede apreciarse a simple vista y cuantificarse en un espectrofotómetro.
El test puede realizarse en un tubo que contenga una porción de la mancha
cuestionada, o bien utilizarse para rastrear la presencia de restos de saliva en
una prenda determinada (test de contacto). En este caso se utilizará un papel
de filtro impregnado en la solución reactiva que se pondrá en contacto con la
prenda cuestionada. Allí donde se encuentre
alfa-amilasa, aparecerán manchas de color en el papel de filtro «mapeando
» la situación de los posibles restos de saliva.
Para la confirmación de presencia de restos de saliva deberán observarse
células del epitelio bucal en los extractos de las muestras.
Extracción de ADN
Es muy frecuente que los indicios en los que se sospecha la presencia de
saliva sean muestras mínimas, por lo que a menudo el laboratorio se halla en el
compromiso de decidir entre la identificación del vestigio o preservar lo más
posible los restos para destinarlos al estudio de ADN
En muchos casos será de mayor utilidad conocer la fuente del vestigio
(su posible donante) que su naturaleza, ya que ésta puede inferirse en algunos
casos como en sellos, sobres, chicles, colillas…
En ocasiones, la metodología para una correcta recogida de la muestra la
invalida para el diagnóstico previo, por ejemplo, en la recogida de marcas de
mordeduras o de zonas besadas, los hisopos se humedecen primero para
asegurar la mayor recuperación de células, diluyendo los componentes
solubles de la saliva.

Extracción de DNA a partir de isopado de saliva

1. Utilizando un tip estéril, tomar la muestra de saliva (raspar un poco la

mucosa bucal) y pasarlo a tubo estéril de 1.5 ml.
2. Agregar 200 ul de 5% de Chelex (homogenizar bien antes!) a la muestra.
3. Agitar los tubos vigorosamente durante 10 segundos.
4. Incubar a 56 ºC por 30 min.
5. Agitar vigorosamente (vortex) durante 10 min.
6. Incubar en un baño de agua hirviendo durante 8 min.
7. Agitar vigorosamente 10 seg.
8. Centrifugar a máxima velocidad por 3 min.
9. Estimar la cantidad de DNA por gel de agarosa.

La muestra está lista para realizar la PCR. Almacenar a 4 ºC o a -20 ºC.

http://genoma.unsam.edu.ar/cursos/genetica_humana/GH_Guia2007.pdf