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A tcnica da Eletroforese

para a anlise de DNA e


protenas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Histrico

1952, Markham and Smith

1955, Smithies

Gis de acrilamida com maior resoluo e


permitem separar ainda molculas
grandes de DNA

1980, Schwartz and Cantor

Gis de amido funcionam bem para


separar protenas do soro humano

1967, Loening

Ao estudarem hidrlise de RNA percebem


que molculas de diferentes estruturas
tm sua mobilidade diferenciada quando
aplicadas num papel e submetidas a um
campo eltrico

Eletroforese em campo pulsado separa


fragmentos enormes

hoje impossvel imaginar um


laboratrio de biomol sem eletroforese
acontecendo a todo instante...

Vou ali
correr um
gelzinho e
j volto

Tenho que ir
seno vou perder
meu gel

Eletroforese
Movimento de partculas
dispersas num fludo sob
influncia de um campo eltrico
uniforme
DNA, carga negativa
Tem tendncia a se dirigir ao
polo positivo quando sujeito a
um campo eltrico

Serve para separar molculas


por tamanho/carga eltrica
Protena deve ser desnaturada
com detergente (SDS)

Tcnica utilizada exausto em


trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas
1.Preparao do gel
2.Aplicao das amostras
3.Eletroforese
4.Colorao
5. Anlise dos resultados

Preparao
do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida

Aplicao das amostras

Definio do mapa
das amostras por
canaleta

Corrida do gel
Aplicao do campo
eltrico
Fonte eltrica gera
fluxo de ons atravs
da soluo tampo
Terminais positivo e
negativo
Tempo adequado,
seno o DNA sai do gel

Colorao das molculas


Brometo de etdio
Agente intercalante do DNA
Cancergeno!

Composto fluorescente luz UV


Gel de agarose

Prata
Gel SDS-PAGE
PoliAcrilamide Gel Electrophoresis

Melhor resoluo

Coomassie blue, etc

Eletroforese em campo
pulsado

Grandes
fragmento
s de DNA

PCR
a reao em cadeia da
polimerase
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
http://dotsub.com/view/53
8a719f-927b-4192-8e95-18a
92a9e95a5

Reao em cadeia

Amplificao do DNA

Sntese de DNA in vitro


Polimerase Chain Reaction
Reao em cadeia da Polimerase

Amplificao in vitro de
molculas de DNA
In vivo X In vitro X In silico

Procedimento anlogo replicao do DNA


Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampo; dNTP

Etapas da PCR

Ciclos da PCR
Separao das fitas 96C
Anelamento dos primers
60C
Sntese do DNA 37C

Problema inicial da tcnica


Durante a etapa de quebra
das pontes de H e separao
das fitas (DNA melting) a 96C,
a enzima polimerase era
desnaturada e precisava ser
acrescentada ciclo a ciclo...
No permitia automao

Histria da PCR

Qumico, 1966

Doutor em bioqumica, 1972


2 anos de ps-doutorado numa industria farmacutica

Deixou a academia para escrever fico cientfica, foi dono de


padaria por dois anos; voltou indstria

1983 Teve a idia de utilizar um par de primers para amplificao


enquanto voltava para a casa noite ao lado da namorada

Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR,


demorou um ano para padronizar a tcnica

Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de qumica


(1993)

1986 utilizao da enzima polimerase de Thermus aquaticus

Permitiu finalmente a automao da tcnica

Controvrsias: Surfista, j foi divorciado 3 vezes, um dos que


acredita que o HIV no causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD
na dcada de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada
tcnica!

Taq
polimerase

Kary Mullis,
1944

PCR
Sistema de reao:
DNA molde (100 ng)
Iniciadores (5 M)
dNTPs
Tampo com MgCL2
Taq polimerase

Protocolo de amplificao:
Desnaturao: 95 C
Anelamento: 45-60 C
Extenso: 72 C

Filmes como tcnica


didtica
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ

Interldio explicativo
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Bioqumica +
Biomol

Enzimas so protenas,
portanto:

1. So formadas por
sequncias de aminocidos
2. Derivam de informaes
dispostas por genes no
DNA, que deve ser
transcrito e,
posteriormente, traduzido
3. Podemos saber a sequncia
delas, tanto de aminocidos
quanto de nucleotdeos

>gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear


gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA
GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA
CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG
CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA
TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC
AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG
GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA
TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT
TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG
TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG
CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA
TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC
TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC
TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT
AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT
GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG
GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC
AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG
TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG
CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT
TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC
TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA
CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC
CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG
CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG
ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA
GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG
CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC
CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC
AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG
AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT
ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT
GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG
GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG
GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA
CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG
ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC
TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC
CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT
CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC
AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG
GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC
AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG
AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG
TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG
CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA
TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG
CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC
CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG
GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG
TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA
TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC
GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens]


MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS
IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK
RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT
VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE
IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH
NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH
PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR
MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY
AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG
HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ
GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG
QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA
VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR
LRTEASS

917
aminocid
os

917 x 3 = 2751
3617-2751 =
866
3617 bp
3,6 kb

Sequenciamento de
protenas

Degradao de Edman
Quebra-se o aminocido N-terminal
Identifica-se o aminocido
quebrado
Sequenciamento de 50 a 70 aas

Espectometria de massa
Quebra-se a protena em diversos
pontos e verifica-se a massa dos
fragmentos
Comparaes com massas
conhecidas dos aas identifica a
sequncia dos mesmos

Tcnicas com limite de


automao
No permitem produzir dados em
larga-escala
Para saber-se a sequncia de um
protena, muitas vezes sequenciase o DNA do organismo de
interesse

O Sequenciamento
de molculas de DNA
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724
IMAGE:3163058), complete cds
GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA
GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC
ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT
CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC
TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT
CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA
GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA
CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG
ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)
TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC
AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT
TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT
CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT
CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT
TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Frederick Sanger
nico vivo dentre os 4 indivduos que j
venceram dois prmios Nobel
~1955: publicou a primeira sequncia de
aminocidos da insulina
Ganhou o Nobel de qumica em 1958

1964: descobriu que as protenas de bactria iniciavamse com o aminocido formil-metionina


1967: desvendou a sequncia do RNA ribossomal 5S
1975: inventou o mtodo didexi para o
sequenciamento do DNA
1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro
de um organismo, o bacterifago phi X 174
11 genes in 5386 bases sequenciadas mo
Ganha o segundo Nobel de qumica em 1980

O mtodo de Sanger,
1975
Polimerizao do DNA a ser sequenciado (molde)
na presena de:
DNA polimerase
primer
tampo
dNTPs (desxinucleotdeo)
ddNTPs (didesxinucleotdeo)

O que faria um nucleotdeo que,


ao invs da extremidade 3OH,
tem uma extremidade 3H?

http://www.youtube.com/watch?v=M
z-4LSfecM4&feature=related

Como acontece a sntese de


molculas de DNA?

Amplificao interrompida
com didesoxinucleotdeos
Desoxinucleotdeos
dNTP

O didesxinucleotdeo no tem a
extremidade 3OH livre
(...)
e, portanto, no permite a
incorporao de novas bases
a 3 quando adicionado,
(...)
interrompendo a formao da
nova cadeia definitivamente

ddNTP
Didesoxinucleotdeo

C
T

G
T

A
G

A G T
T
C A
A
C
AC T
T
C A
G
G
G T
T
A
G
C
C
A
C A
C
G
T
5
3
G
A
ATGCTTC
|||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

T T
G
C
A
C A
T
A
G T
A
AC T
T
C A
G
G
G T
G
T
C C
AG
A C C
TC A G
5
3
G
A
ATGCTTC
|||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

A
A GA T T
C
C CA
AC T
T
G
G T
A
G
T
G C
A
G
C
A
C A
C
G
T
5
3
G
A
ATGCTTCTG
||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

T C

C
AT G C
A T TT
T G
T
C A
T

T AC
C

CA

A GC
G
G T
G AC A
A G
A C
GC
5
3
ATGCTTCTGGCAGATCT
|||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

T GAA
G
A
T
T
G
T
T
T
GA G C
C
T
A
T
T C A
GT G
C C
A
GC A T
C
G
C
AC
CC
5
3
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

A
CC
A
T
T
G
A
T
T T
G
A
G
C
T
A
C
A
T
T
A
G
T
C
G
G
GA
T
G
T
CA
C G C
C C
AC
5
3
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

A
G

C A
G
T C
AC

T
T GAA CC
T
A
T
G
T
T
G
C
T
T
G
AA
T
C
T G
C G
GC A
C
CA

ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Populao
de
molculas
Incorpora
o aleatria
do didesxi
Quantidade
precisa
entre
didesxi e
desxi
5

ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

ddGTPs

molde
polimerase
dNTPs

ddATPs

ddTTPs

ddCTPs

ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

G A T C

ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

Modelo original
Etapa 1
Amplificao
Tipo-PCr

Marcao do
primer
4 reaes
necessrias, uma
para cada base

Etapa 2
Eletroforese

Eletroforese
separa fragmentos
de diferentes
tamanhos
Leitura manual da
sequncia de
baixo pra cima

Sanger e o fago Phi 174

De fato, esse tipo


de sequenciamento
manual continuou
acontecendo por
dcadas...

Modelo moderno
Applied Byosystems, 1986
Marcao fluorescente do
ddNTP
1 reao necessria, todas
as bases lidas ao mesmo
tempo
Eletroforese separa
fragmentos de diferentes
tamanhos
Leitura da automtica
sequncia, de baixo pra cima,
por um laser

http://www.youtube.com/
watch?v=ezAefHhvecM

Leroy Hood,
1938-

Cromatograma

As mquinas necessrias
para o sequenciamento
Primeira etapa: junta-se os
reagentes em poos de
placas e coloca-se na
mquina de PCR para a reao
de amplificao interrompida
Diferenas com relao ao PCR
Utilizao de um s primer
Utilizao dos ddNTPs

Uma vez prontas, as sequncias de diferentes


tamanhos contendo os didesxi amplificados
devem ser enviadas ao sequenciador de DNA
mais prximo

O que faz um
sequenciador de DNA?

Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar


O sequenciador executa a eletroforese em gis capilares
ultra-finos
Um sensor responsvel por emitir um laser e verificar qual
o comprimento de onda emitido pelo didesxi

Exerccio
D a sequncia de DNA da canaleta apontada
azul = Guanina
amarelo = Timina
vermelha = Adenina
verde = Citosina

http://www.youtube.com/watch?
v=dUjMf2ZezIw&feature=related

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