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UNIVERSIDAD DE NARIO
FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
SAN JUAN DE PASTO
2011
0
UNIVERSIDAD DE NARIO
FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
SAN JUAN DE PASTO
2011
1
NOTA DE ACEPTACION
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
Dr. Andrs Hurtado Benavides.
__________________________________
Dr. Claudia Salazar Gonzalez.
__________________________________
Dr. Oswaldo Osorio Mora.
Dedicatoria
A Dios, por darme las fuerzas necesarias para luchar da tras da, por llenar mi vida
siempre de mil bendiciones y guiar mi camino, a la virgencita por ser mi compaera
incondicional.
A mis papitos, Campo y Cristina no tengo palabras para agradecerles todo los que han
hecho por m, al igual que a mi hermana Diana que es mi ejemplo a seguir LOS
AMO!!!!
Al resto de mi familia que siempre me han apoyado y confiado en mi.
A Diana agradecerle por todos los momentos que hemos pasado juntas y nos han hecho
consolidar una amistad que espero que dure para siempre.
AGRADECIMIENTOS
TABLA DE CONTENIDO
pg.
INTRODUCCIN
19
21
2. JUSTIFICACIN
23
3. OBJETIVOS
25
25
25
26
4.1 El organo
4.1.1 Caractersticas Generales
4.1.2 Taxonoma de Lippia origanoides Kunth
4.1.3 Produccin Nacional e Internacional de organo
4.1.4 Composicin y usos potenciales
26
26
26
26
27
29
29
31
34
35
37
37
5. DISEO METODOLGICO
40
40
5
41
41
41
43
44
44
44
45
45
45
47
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
48
48
48
52
52
99
52
62
62
65
68
75
77
84
84
88
91
7. CONCLUSIONES
106
8. RECOMENDACIONES
107
BIBLIOGRAFA
108
ANEXOS
118
LISTA DE CUADROS
pg.
46
47
48
49
53
55
58
60
61
63
64
66
67
68
70
70
72
76
77
78
79
80
81
82
83
83
85
85
86
87
88
88
89
90
91
91
92
93
94
94
99
100
100
102
10
LISTA DE FIGURAS
pg.
28
30
41
41
43
49
52
53
54
55
56
57
58
59
11
60
61
61
62
63
64
65
65
66
67
68
68
69
69.
12
70
73
74
75
76
77
78
78
79
80
81
82
83
13
84
85
86
87
87
89
89
90
91
92
92
93
94
95
95
14
96
96
100
100
100
100
102
103
15
LISTA DE ANEXOS
pg.
118
120
124
134
136
16
138
RESUMEN
El aceite esencial de organo esta constituido en su gran mayora por compuestos
fenlicos como el timol, capaz de ser usado como antioxidante y antifngico en el control
de distintos patgenos que atacan innumerables cultivos. Se valor la actividad
antioxidante mediante el ensayo DPPH y ABTS+, comparada con antioxidantes
convencionales: cido ascrbico, BHT y BHA. Para el ensayo de DPPH en valores de
EC50 (mL SE/mL DPPH) iniciando por el mejor, resulta: cido ascrbico 2,15*10-3, BHT
1,328, BHA 0,254 y aceite de organo 5,583. Sin embargo, dentro de la reaccin el efecto
que produce una misma concentracin de cada antioxidante genera un porcentaje de
inhibicin que varia el orden de actividad antioxidante as: cido ascrbico>aceite de
organo>BHT>BHA. Usando el ensayo ABTS+ se obtienen valores de TEAC (mg
Trolox/mL SE) al minuto 7 en el siguiente orden: cido ascrbico 0,175, aceite de organo
0,330, BHA 0,476 y BHT 0,679; y el TAA en orden descendente es: cido ascrbico>
BHA>aceite de organo>BHT. En sntesis, el aceite de organo muestra una alta
actividad antioxidante que supera al BHT y BHA, lo cual se debe a su composicin rica en
timol (73%) y la accin sinrgica de sus compuestos fenlicos, por tanto, se hace
susceptible para emplearse en la conservacin de alimentos o en dietas alimentarias de
animales. Asi mismo se evalu la actividad antifngica in vitro de este aceite sobre la
gota o tizn tardo causado por el patgeno Phytophthora infestans, el cual se constituye
en el agente fitopatolgico ms perjudicial de la papa en las zonas hmedas del mundo.
La evaluacin se realiz empleando el mtodo de dilucin en agar tomate, se utiliz un
diseo irrestrictamente al azar (DIA) con arreglo factorial con dos factores el factor A
correspondi al producto (aceite esencial de organo y Ridomil) y el factor B
correspondi a las concentraciones (10, 50, 100, 150, 200, 250 g.mL-1). Los resultados
obtenidos evidencian que al aceite esencial de organo silvestre (L. origanoides Kunth)
tiene un efecto inhibidor muy importante contra el fitopatgeno P. infestans, ya que desde
la dosis mnima probada de 10 g.mL-1 se present un porcentaje de inhibicin de 41,6%
en el desarrollo del patgeno y a partir de una concentracin de 150 g.mL-1 se inhibi
completamente su crecimiento, por lo cual se considera que es la concentracin letal.
Palabras Claves: aceite esencial, Lippia origanoides Kunth, Actividad antioxidante,
DPPH, ABTS+. Actividad antifngica, Phytophthora infestans.
17
ABSTRACT
18
INTRODUCCIN
20
Entre el norte del departamento de Nario y el sur del departamento del Cauca, se
encuentra la regin del Alto Pata, donde existen serios problemas de degradacin
de los recursos de suelo, agua y vegetacin, lo cual ha trado consecuencias de
variada ndole: sociales, econmicas y ambientales. All, la naturaleza sobrepas
los lmites de autorregulacin (proceso conocido como 'resciliencia') y, como parte
de la degradacin se desarroll una nueva vegetacin propia de regiones en
avanzado proceso de desertificacin (enclave subxeroftico). Adems, la
precipitacin es escasa y en algunos aos el fenmeno del Nio ha producido
eventos de sequa muy prolongados, ocasionando desplazamientos masivos de la
poblacin, principalmente hacia la carretera Panamericana, donde algunos se han
dedicado a mendigar y delinquir para poder sobrevivir.
Se hace importante determinar la viabilidad del uso del aceite esencial de organo
silvestre del Alto Pata para inhibir el crecimiento del patgeno Phytophthora
infestans, ya que se constituye en una alternativa frente al uso de agroqumicos, lo
que a su vez representa una opcin de aprovechamiento agroindustrial de esta
especie; dicha capacidad se atribuye a que el aceite de organo posee
compuestos fenlicos tales como timol y carvacrol, los cuales tienen propiedades
antioxidantes y esto le confiere potencialidad para ser utilizado como aditivo en la
conservacin de productos alimenticios (Arcila et al., 2004).
22
2. JUSTIFICACIN
La regin del Alto Pata es una zona socialmente deprimida con problemas de
sequia, donde crece de manera silvestre una especie de organo de la cual se
puede extraer un aceite esencial que tiene un gran potencial comercial por
presentar comprobados efectos antimicrobianos y antioxidantes.
24
3. OBJETIVOS
25
4.1 EL ORGANO
28
Los antioxidantes de los alimentos pueden ser definidos como cualquier sustancia
que es capaz de aplazar, retardar o prevenir el desarrollo de ranciedad en el
alimento u otro deterioro del flavor que se produzca como consecuencia de la
oxidacin. Los antioxidantes retardan el desarrollo de flavores inadecuados
prolongando el periodo de induccin por lo que su adicin al final de este periodo no
consigue retardar el desarrollo del enranciamiento. (Pokorny et al., 2001).
metanol, a temperatura ambiente. Los radicales usados son del tipo 2,2-difenil-1picrilhidrazilo (DPPH) y (2,2-azinobis-3-etil-benzotiazolina-6-sulfnico) (ABTS+).
(2)
Para el caso del organo Tafur et al., concluyen que la accin antioxidante de este
se debe a tres factores:
1) La presencia de compuestos fenlicos como timol y carvacrol, que puede
ejercer actividad similar al eugenol, BHA, BHT y vitamina E. sta es la causa
fundamental por la que el aceite esencial de organo presenta actividad
antioxidante (Pokorny et al., 2001; Puertas et al., 2002; Brand- Williams et al.,
1995).
31
32
Abss0 Absst
AA 1
*10 0
0
t
Absc Absc
(3)
Donde
AA
Abss0
Absc0
Abs
t
s
Abs
t
c
El desarrollo epidmico del tizn tardo, depende en gran parte del efecto que
tiene la humedad relativa y la temperatura sobre las distintas etapas del ciclo de
vida de P. infestans. La germinacin de los esporangios se reproduce a
humedades relativas superiores al 90%, con una temperatura optima entre 1015C, rango en el cual el fitopatgeno se desarrolla adecuadamente, esporula y
37
Los primeros sntomas se presentan como manchas de color verde claro a oscuro
en los bordes de las hojas inferiores. Estas manchas se extienden rpidamente,
formando zonas pardas y atizonadas con bordes irregulares. En el envs de las
hojas aparece la cenicilla vellosa, constituida por las hifas y los esporangios del
patgeno. Los foliolos afectados finalmente pierden consistencia y se necrosan.
En condiciones de alta humedad y temperatura fra, las lesiones se expanden
rpidamente, pudiendo afectar la totalidad de rganos areos de la planta,
provocando una marchites progresiva (Torrez, 1997).
Los sntomas en los tallos infectados se caracterizan por las lesiones necrticas
de color marrn oscuro generalmente ubicadas desde el tercio medio a la parte
superior de la planta, presentan consistencia vtrea, de tamao variable (hasta 10
cm de largo). Como consecuencia, las hojas se enrollan, los tallos se tornan
quebradizos y pueden romperse con la fuerza del viento o con el rozamiento de
las mquinas o personas que transitan por el campo (Torrez, 1997; Prez y
Forbes, 2008).
Los biocidas y/o bioinsumos son productos de origen natural que se utilizan para
el manejo y control de plagas y enfermedades en la agricultura orgnica. Estos se
consideran ambientalmente benignos porque se degradan rpidamente y su efecto
sobre los organismos benficos es menos perjudicial que el de productos
tradicionales (O'farril, 2004).
38
En la naturaleza existen una gama muy amplia de plantas que producen una
diversidad de metabolitos txicos, tal caracterstica les permite a stas plantas
actuar como antagonistas de patgenos biticos y plagas. Su potencial
antagonista se lo puede aprovechar mediante la preparacin de extractos o
infusiones a partir de sus tejidos con resultados promisorios en laboratorio e
invernadero (Zabaleta, 2000; Frayre, 1993; Granada, 2002).
39
5.
DISEO METODOLOGICO
Las observaciones realizadas en campo indican que se deben recoger las hojas
de las diez primeras ramas del suelo hacia arriba, con el objeto de que no se
destruya la planta ni se deje el suelo al descubierto, impidiendo la exposicin de
ste a la intensa radiacin solar.
Se debe resaltar que se trata de plantas que crecen de forma silvestre y que no
son sometidas a ningn tipo de prctica agronmica o de aplicacin de
agroqumicos. Las hojas son cosechadas de plantas maduras en la poca
posterior al periodo de lluvias debido a que es en este momento donde las plantas
tienen mayor cantidad de hojas.
40
Figura 3. Equipo de extraccin por arrastre con vapor a nivel de planta piloto.
Una vez extrado el aceite esencial se deshidrat con Na2SO4 anhidro, se tom
una alcuota de 30 L y se diluy en 1 mL de diclorometano para el anlisis
cromatogrfico.
42
A0 At
A0
*100
(5)
Donde:
Ao = Absorbancia en el tiempo 0
At = Absorbancia despus de un periodo de tiempo en reposo.
0,25 gr de CaCO3
9 gr de agar
9 gr de azcar
100 mL de jugo de tomate
100 mL de extracto de arveja
44
Se utiliz un diseo irrestrictamente al azar (DIA) con arreglo factorial con dos
factores, el factor A corresponde al Producto (aceite esencial de organo y
Ridomil Gold -Metalaxyl-M 4% + Mancozeb 64%) y el factor B corresponde a las
concentraciones (10, 50, 100, 150, 200, 250 g.mL-1).
Se tuvieron dos testigos, uno absoluto y otro aplicando Tween 20, se realizaron
cinco repeticiones.
Tratamientos
Productos
Metalaxyl
+
Mancozeb
Aceite
esencial de
Organo.
Tween 20
Testigo
absoluto
Concentracin (g.mL-1)
10
50
100
150
200
250
10
50
100
150
200
250
10
50
100
150
200
250
0
PC
Donde:
PC
DMCM
1,1 cm
DMCA
DMCM 1.1cm
*100
DMCA
(6)
= porcentaje de crecimiento
= dimetro medio colonia creciendo en tratamiento
= dimetro del cilindro con micelio
= dimetro medio colonia sin enmendar.
Sensibles (S):
Intermedio (I):
Resistente (R):
47
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
Densidad
Lecho (g/L)
Presin de
vapor (psi)
Rendimiento
% p/p
2,0
80,0
0,32
3,27
Con la extraccin por arrastre con vapor a nivel de planta piloto se obtuvo un
rendimiento de 3,27% (p/p) de aceite esencial de organo extrado el 8 de Octubre
de 2009, con el cual se realizaron todos los ensayos de esta investigacin.
logtrx logtrn
IK 100n N n
logtrN logtrn
Donde:
IK
n
N
trx
trn
trN
(7)
= ndice de Kovats.
= nmero de carbonos de la parafina anterior.
= nmero de carbonos de la parafina posterior.
= tiempo de retencin del compuesto a identificar.
= tiempo de retencin de la parafina anterior.
= tiempo de retencin de la parafina posterior.
48
T. retencin
11,258
11,566
12,291
13,549
% rea
0,393
0,343
0,031
0,049
49
IK e
927
934
951
977
Compuesto
Tricicleno
-pineno
Canfeno
-pineno
5
6
14,266
14,899
3,095
0,339
991
1004
Mirceno
Etil hexanoato
Cuadro 4. (continuacin)
N pico
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
T. retencin
15,424
15,982
16,257
16,707
17,324
17,849
18,349
18,599
19,090
24,290
27,757
28,906
31,456
31,740
32,031
32,248
32,765
33,59
31,631
37,373
38,248
% rea
1,141
10,509
0,142
0,077
2,914
0,125
0,087
0,095
0,411
0,862
73,698
0,882
1,829
0,072
0,061
0,746
1,136
0,242
0,284
0,283
0,155
IK e
1017
1031
1038
1048
1062
1073
1084
1089
1099
1232
1329
1358
1425
1433
1442
1448
1463
1487
1430
1587
1572
Compuesto
1,4-Cineole
-Cimeno
1,8Cineole
Fenil acetaldehdo
-Terpineno
-Cresol
Terpinoleno
Guaiacol
Etil Heptanoato
Citronolol
Timol
Eugenol
ionone
Cariofileno
Erucin
Acetona geranilo
-cariofileno
germacrenoD
(E) -bergamotene
Guaiol
Oxido de Cariofileno
50
Los compuestos fenlicos han sido foco de numerosos estudios por las
actividades antioxidante y antibacteriana que demuestran tener, y se ha
51
mnimos cuadrados a una recta cuya ecuacin se us para obtener los valores de
la concertacin de DPPH.
CDPPH
(mg/mL)
0,0
9,858*E-4
1,971*E-3
2,957*E-3
3,943*E-3
6,900*E-3
9,858*E-3
Abs (516nm)
0,0
0,0250
0,0505
0,0710
0,0976
0,1656
0,2416
53
54
% DPPHrem
21,24
19,26
16,81
15,61
12,46
10,09
55
Se podra afirmar que la EC50 para el aceite esencial de organo silvestre del Alto
Pata, es decir, la cantidad de aceite esencial necesaria para reducir la
concentracin inicial de radical libre DPPH en un 50%, es inferior a 11,9 mg/mL.
56
57
% I Ts
77,965
79,944
82,292
84,393
86,572
88,915
El tiempo estacionario promedio para las reacciones de DPPH con cada una de
las concentraciones de aceite de organo que describe en sta grfica, se
encuentra entre el intervalo de 90-120 minutos, haciendo un promedio de 105
minutos para stas concentraciones. Se observa que la disminucin de radical
libre DPPH en los primeros 30 minutos de la reaccin es significativo, y luego se
lentifica tomando una tendencia casi lineal hasta que finalmente se estabiliza.
Los valores de porcentaje de DPPH remanente a diferentes concentraciones de
aceite esencial de organo se presentan en la Cuadro 8.
59
% DPPHrem
87,59
66,07
46,73
27,81
60
% I Ts
12,3173
33,6842
52,8796
71,6667
61
De la Cuadro 9 se tiene que con una concentracin de 9000 ppm de AEO se logr
un porcentaje de inhibicin de 71,67% de radicales DPPH en el medio; segn la
ecuacin de la curva %I = 6,665*CAEO + 12,41 (R2=0,999), el valor IC50 que es la
concentracin de AEO que inhibe el 50% de radicales libres es de 5,640,035 mg
AEO/mL DDPH o sea 5640 ppm.
Las muestras de los patrones (cido ascrbico, BHA y BHT) se prepararon en las
siguientes concentraciones: 0.0085, 0.014, 0.039 y 0.102 mM y se convirtieron a
mg/mL segn el peso de cada patrn. Siguiendo el mismo protocolo empleado
para el aceite esencial se construyeron las grficas y cuadros correspondientes.
6.2.1.2.1 Ensayo de DPPH con cido ascrbico. Los resultados de las medidas
de absorbancia tomadas durante 8 horas para el ensayo con el cido ascrbico se
describen con detalle en el ANEXO C, en la Fig. 18 se muestran las curvas para
porcentaje de DPPH remanente en funcin del tiempo para diferentes
concentraciones de cido ascrbico.
Figura 18. Porcentaje de DPPH remanente frente al tiempo para diferentes
concentraciones de cido ascrbico (mg/mL).
62
Concentracin mg/mL
1,497*10-3
2,465*10-3
6,868*10-3
17,962*10-3
%DPPHrem
52,11
48,97
36,95
7,23
63
Con la ecuacin de la Fig. 19 se obtuvo que el valor EC50 para el cido ascrbico
es 2,147*10-3 0,024 mg AEO/mL DDPH, el cual es semejante al encontrado por
Cavero (2003), quien obtuvo en su estudio un valor de EC50 para ste antioxidante
de 2,28*10-3 mg/mL. Esta semejanza de resultados comprueba que la metodologa
fue aplicada correctamente.
Cabe anotar, que el mtodo utilizado por Cavero est basado en Brand-Williams et
al., (1995) (Cavero, 2003) con modificaciones.
Concentracin mg/mL
1,497*10-3
2,465*10-3
6,868*10-3
17,962*10-3
64
% I Ts
47,846
50,977
62,989
92,665
al
tiempo
para
diferentes
Con la ecuacin de la Fig. 21, se obtuvo que el valor IC50 para el cido ascrbico
es 2,17*10-3 0,024 mg AEO/mL DDPH; esto significa un alto poder antioxidante.
65
La Fig. 22 muestra que los porcentajes de DPPH remanente obtenidos para todas
las concentraciones superan el 90%, esto significa que el BHT en el intervalo de
concentraciones trabajado no tiene una buena actividad antioxidante.
Concentracin mg/mL
0,0019
0,0031
0,0086
0,0225
% DPPHrem
95,3123
95,3028
95,0935
94,6226
66
frente
al
tiempo
para
diferentes
Concentracin mg/mL
0,0019
0,0031
0,0086
0,0225
% I Ts
4,684
4,694
4,903
5,3736
67
Concentracin mg/mL
0,00153
0,00252
0,00703
0,01839
68
% DPPHrem
98,5224
98,2711
97,5008
95,2541
Con la ecuacin de la Fig. 27 se calcul que la EC50 del BHA es 0,254 3,24*10-3
mg AEO/mL DDPH.
69
frente
al
tiempo
para
diferentes
Concentracin mg/mL
0,00153
0,00252
0,00703
0,01839
% I Ts
1,476
1,727
2,497
4,742
AEO
Cpatrn
mM
Cpatrn
(mg/mL)
%DPPH
remTs
Ts
(min)
11,9
47,7
83,5
119,3
155,1
190,9
21,24
19,26
16,81
15,61
12,46
10,09
60
50
45
45
45
45
70
EC50
(mg SE/mL
DDPH)
< 11,9
%ITs
77,96
79,94
82,29
84,39
86,57
88,92
IC50
(mg SE/mL
DDPH)
< 11,9
AEO
cido
Ascrbico
BHT
BHA
*
Cpatrn
mM
Cpatrn
(mg/mL)
%DPPH
remTs
Ts
(min)
0,0085
0,014
0,039
0,102
0,0085
0,014
0,039
0,102
0,0085
0,014
0,039
0,102
0,1
3,1
6,0
9,0
0,0014
0,0024
0,0068
0,0179
0,0019
0,0031
0,0086
0,0225
0,0015
0,0025
0,0070
0,0184
87,59
66,07
46,73
27,81
52,11
48,97
36,95
7,23
95,31
95,30
95,09
94,62
98,52
98,27
97,50
95,25
125
115
95
90
480
465
240
100
60
55
55
50
55
60
60
60
EC50
(mg SE/mL
DDPH)
5,583
2,15*10-3
2,28*10-3 *
1,328
0,254
%ITs
12,32
33,68
52,88
71,67
47,85
50,98
62,99
92,66
4,68
4,69
4,90
5,37
1,48
1,73
2,49
4,74
IC50
(mg SE/mL
DDPH)
5,64
2,16*10-3
1,293
0,254
(Cavero, 2003)
Los valores de EC50 obtenidos en orden descendente fueron: cido ascrbico >
BHA > BHT > AEO. El valor EC50 para el aceite de organo es semejante a los
convencionales BHT y BHA y eso es destacable. Comparando con otros aceites,
Carhuapoma, et al., evaluaron que la actividad antioxidante del aceite esencial de
arrayn que present un IC50 de 43,35g/mL frente al cido ascrbico con un IC50
de 36,41g/mL (Carhuapoma et al., 2005).
Efecto de 5 ppm
% DPPH rem
% Inhibicin
87,45
12,44
42,27
57,66
95,21
4,77
97,83
2,16
EC50 (mg/mL)
5,583
2,14*10-3
1,328
0,254
mejores resultados en el siguiente orden: cido ascrbico > aceite de organo >
BHT > BHA.
73
74
75
Abs 1
0,652
0,596
0,480
0,391
0,292
Abs 2
0,733
0,575
0,483
0,385
0,290
Abs 3
0,722
0,591
0,494
0,370
0,291
Abs 4
0,678
0,570
0,477
0,380
0,260
Abs Prom
0,696
0,583
0,484
0,382
0,283
SD
0,038
0,012
0,007
0,009
0,016
76
Dado que 1mM de Trolox equivale a 0,250 mg/mL, utilizando la ecuacin y = 118x
+ 0,657 se calcul el porcentaje de inhibicin de 1mM de Trolox, que es de
30,16%, por lo tanto, 0,250 mg/mL de Trolox inhibe el 30,16% de radical ABTS+,
este dato se lo utiliz para calcula el TEAC de los antioxidantes evaluados.
Abs t=1
0,75
0,298
0,093
0,071
0,024
0,017
Abs t=1
0,745
0,241
0,113
0,081
0,026
0,013
77
Abs t=1
0,73
0,243
0,097
0,092
0,039
0,01
Prom t=1
0,742
0,261
0,101
0,081
0,030
0,013
SD
0,010
0,032
0,011
0,011
0,008
0,004
190,9
0,014
0,009
0,009
0,011
0,003
% I t=1
0,00
60,27
87,60
90,53
96,80
97,73
98,13
% I t=1
0,00
67,65
84,83
89,13
96,51
98,26
98,79
% I t=1
0,00
66,71
86,71
87,40
94,66
98,63
98,77
Prom t=1
0,00
64,88
86,38
89,02
95,99
98,21
98,56
SD
0,000
4,020
1,413
1,571
1,162
0,450
0,373
78
Abs t=7
0,75
0,074
0,013
0,017
0,013
0,013
0,014
Abs t=7
0,745
0,013
0,023
0,01
0,015
0,013
0,01
Abs t=7
0,73
0,013
0,007
0,011
0,009
0,01
0,009
Prom t=7
0,742
0,033
0,014
0,013
0,012
0,012
0,011
SD
0,010
0,035
0,008
0,004
0,003
0,002
0,003
79
Con estos datos se calcul el porcentaje de inhibicin para el minuto 7, los datos
se muestran en la Cuadro 22.
% I t=7
0,00
90,13
98,27
97,73
98,27
98,27
98,13
% I t=7
0,00
98,26
96,91
98,66
97,99
98,26
98,66
% I t=7
0,00
98,22
99,04
98,49
98,77
98,63
98,77
Prom t=7
0,000
95,536
98,074
98,295
98,340
98,384
98,519
SD
0,000
4,679
1,077
0,493
0,395
0,213
0,339
Abs t=1
0,682
0,527
0,221
0,078
0,035
SD
0,007
0,108
0,065
0,026
0,006
al
% I t=1
0,00
46,96
52,44
81,48
96,30
% I t=1
0,00
22,73
67,60
88,56
94,87
% I t=1
0,00
18,75
50,00
87,94
96,37
Prom t=1
0,000
29,480
56,680
85,994
95,844
SD
0,000
15,271
9,532
3,920
0,846
82
Abs t=7
0,675
0,354
0,321
0,097
0,019
Abs t=7
0,682
0,275
0,255
0,091
0,009
Abs t=7
0,688
0,328
0,385
0,086
0,015
Prom t=7
0,682
0,319
0,320
0,091
0,014
SD
0,007
0,040
0,065
0,006
0,005
Con estos datos se calcul el porcentaje de inhibicin del radical ABTS+ con
aceite esencial de organo al minuto 7 de reaccin, los resultados se muestran en
la Cuadro 26 y la Fig. 42.
% I t=7
0,00
47,56
52,44
85,63
97,19
% I t=7
0,00
59,68
62,61
86,66
98,68
83
% I t=7
0,00
52,33
44,04
87,50
97,82
Prom t=7
0,000
53,186
53,032
86,596
97,895
SD
0,000
6,107
9,299
0,937
0,750
84
Cuadro 27. Ensayo de ABTS+ con cido ascrbico (minuto 1de reaccin).
Concentracin (mg/mL)
0
0,66
1,32
1,98
2,64
Abs t=1
0,65
0,529
0,231
0,054
0,01
Abs t=1
0,682
0,528
0,22
0,059
0,011
Abs t=1
0,699
0,527
0,212
0,051
0,016
Prom t=1
0,677
0,528
0,221
0,055
0,012
SD
0,025
0,001
0,010
0,004
0,003
Con estos datos se calcul el porcentaje de inhibicin del radical ABTS+ con
cido ascrbico al minuto 1 de reaccin, los resultados se muestran en la Cuadro
28 y la Fig. 44.
% I t=1
0,00
18,62
64,46
91,69
98,46
% I t=1
0,00
22,58
67,74
91,35
98,39
85
% I t=1
0,00
24,61
69,67
92,70
97,71
Prom t=1
0,000
21,93
67,29
91,92
98,19
SD
0,000
3,047
2,634
0,704
0,414
Abs t=7
0,65
0,302
0,099
0,013
0,01
Abs t=7
0,682
0,215
0,092
0,016
0,009
86
Abs t=7
0,699
0,217
0,091
0,019
0,007
Prom t=7
0,677
0,245
0,094
0,016
0,009
SD
0,025
0,050
0,004
0,003
0,002
% I t=7
0,00
53,54
84,77
98,00
98,46
% I t=7
0,00
68,48
86,51
97,65
98,68
% I t=7
0,00
68,96
86,98
97,28
99,00
Prom t=7
0,000
63,656
86,087
97,645
98,713
SD
0,000
8,766
1,165
0,359
0,270
87
Los valores de TEAC para el cido ascrbico con el ensayo del radical ABTS+
que se obtuvieron en el presente trabajo son muy similares al que fue obtenido Re
et al., (1999), lo que significa que el procedimiento empleado es reproducible y los
datos obtenidos son confiables (Cuadro 31).
TEAC mg Trolox/mL Ac
TEAC mM
ascrbico
Min 1
0,685 0,04
Min 7
0,175 0,1
Min 1
3,880,04
Min 7
0,9940,1
TEAC mM
Re et al. (1999)
Min 1-7
1,050,02
Abs t=1
0,71
0,58
0,41
0,324
0,235
Abs t=1
0,712
0,528
0,412
0,376
0,162
88
SD
0,002
0,027
0,004
0,032
0,051
% I t=1
0,00
18,31
42,25
54,37
66,90
% I t=1
0,00
25,84
42,13
47,19
77,25
% I t=1
0,00
23,98
43,20
46,42
63,39
Prom t=1
0,000
22,712
42,529
49,327
69,181
SD
0,000
3,924
0,582
4,381
7,202
89
Abs t=7
0,71
0,404
0,201
0,126
0,077
Abs t=7
0,712
0,415
0,292
0,156
0,047
SD
0,002
0,006
0,047
0,016
0,016
Con estos datos se calcul el porcentaje de inhibicin para el minuto 7, los datos
se muestran en la Cuadro 35.
Concentracin (mg/mL)
0,00
0,83
1,65
2,48
3,31
% I t=7
0,00
43,10
71,69
82,25
89,15
% I t=7
0,00
41,71
58,99
78,09
93,40
% I t=7
0,00
42,92
67,88
81,21
90,04
Prom t=7
0,000
42,576
66,187
80,517
90,865
SD
0,000
0,753
6,518
2,166
2,239
6.2.2.2.3 Ensayo de ABTS+ con BHA. Se evalu el BHA utilizando las mismas
concentraciones y procedimiento empleado para el cido ascrbico con el fin de
poder comparar los valores de TEAC obtenidos. Los ensayos se realizaron por
triplicado y se muestran en la Cuadro 36 y la Fig. 51.
Cuadro 36. Ensayo de ABTS+ con BHA (minuto 1 de reaccin).
Concentracin (mg/mL) Abs t=1
0,00
0,749
0,68
0,638
1,35
0,402
2,03
0,127
2,70
0,013
Abs t=1
0,745
0,647
0,428
0,12
0,014
Abs t=1
0,725
0,632
0,429
0,117
0,011
Prom t=1
0,740
0,639
0,420
0,121
0,013
SD
0,013
0,008
0,015
0,005
0,002
% I t=1
0,00
14,82
46,33
83,04
98,26
% I t=1
0,00
13,15
42,55
83,89
98,12
% I t=1
0,00
12,83
40,83
83,86
98,48
Prom t=1
0,000
13,601
43,235
83,600
98,289
SD
0,000
1,068
2,814
0,481
0,182
Utilizando
92
la
SD
0,013
0,034
0,014
0,015
0,002
93
% I t=7
0,00
36,98
79,17
88,79
99,47
% I t=7
0,00
43,49
79,19
92,62
99,46
SD
0,000
3,826
1,507
1,920
0,309
1 min
1,16 0,5
0,685 0,04
1,32 0,04
0,906 0,02
94
7 min
0,330 0,5
0,175 0,1
0,679 0,05
0,476 0,04
antioxidante total (TAA), para el caso de mezclas de sustancias como los aceites
esenciales. Por esta razn se calcul el TAA para los antioxidantes utilizados en
este estudio, los resultados se muestran en la Fig. 57 y Fig. 58.
Figura 57. Valores de TAA para los antioxidantes evaluados en este estudio
(minuto 1 de reaccin).
Figura 58. Valores de TAA para los antioxidantes evaluados en este estudio
(minuto 7 de reaccin).
observar que el aceite tiene un valor TEAC mucho mas bajo que antioxidantes
comerciales como el BHT y BHA.
caracterstico sabor y olor fuerte que podra afectar el flavor de los alimentos. En
cualquier caso, deber ser sometido a rigurosos anlisis para evaluar la influencia
en las caractersticas organolpticas de los alimentos.
98
6.3
EVALUACIN DE LA CAPACIDAD ANTIFNGICA DEL ACEITE DE
ORGANO
Se aplic un diseo irrestrictamente al azar DIA con arreglo factorial para los
tratamientos mostrados en la Cuadro 1. Ensayos preliminares con aceite de
organo definieron el intervalo evaluado excluyendo concentraciones mayores en
las cuales no se observ crecimiento del patgeno.
Para lograr una adecuada dilucin del aceite de organo en el medio de cultivo de
P. infestans fue necesario utilizar el agente emulsionante Tween 20. La cantidad
de Tween 20 a utilizar se determin mediante la realizacin de varios ensayos, los
cuales se muestran en la Cuadro 41.
AEO (mL)
Tween 20 (mL)
1
2
3
4
5
6
1
0,5
1
1
0,8
0,5
1
0,3
0,1
0,2
1,5
1
Agar
(mL)
1
5
10
10
10
10
Homogeneidad
de la emulsin
Mala
Regular
Mala
Regular
Buena
Muy buena
Para comprobar que el producto Tween 20 usado como emulsionante del AEO no
tuvo efecto sobre el patgeno y que la inhibicin de ste se debe nicamente a la
accin del AEO, se realizaron ensayos con el Tween 20 en las mismas
condiciones que en las que se evalu el aceite.
99
Suma de
cuadrados
GL
57934,1
98643,0
30273,3
186850,0
6
2
96
104
Mnimos
cuadrados
Valor
F
Valor
P
9655,68
49321,5
315,347
30,62
156,40
0,00001
0,00001
Dado que el valor P es menor que 0,05 demuestra que hay diferencias
estadsticamente significativas entre los productos con los cuales se evalu el
crecimiento del patgeno, por lo tanto se procedi a realizar la prueba de rangos
mltiples de Tukey, con el fin de determinar si hay grupos homogneos.
Media
14,28
35,95
87,37
Grupos Homogneos
X
X
X
100
-1
0 g.mL
-1
10 g.mL
-1
50 g.mL
-1
100 g.mL
-1
150 g.mL
-1
250 g.mL
-1
250 g.mL
-1
250 g.mL
200 g.mL
-1
-1
-1
0 g.mL
-1
10 g.mL
-1
50 g.mL
100 g.mL
-1
150 g.mL
200 g.mL
-1
-1
0 g.mL
-1
10 g.mL
-1
50 g.mL
-1
100 g.mL
-1
150 g.mL
200 g.mL
101
-1
Evaluacin
Resistente
Intermedio
Intermedio
Intermedio
Sensible
Garca et al., (2008) encontraron un valor de EC50 para P. infestans con Ridomil
de 4,86 g.mL-1, muy similar al encontrado en esta investigacin, lo que significa
que el procedimiento y datos obtenidos son confiables, sin embargo se destaca
que se utilizan diferentes metodologas y cepas mayor o menor resistencia.
Los resultados obtenidos evidencian que al aceite esencial de organo silvestre (L.
origanoides Kunth) del Alto Pata tiene un efecto inhibidor muy importante contra el
fitopatgeno P. infestans, ya que como se muestra en la Fig. 9, desde la dosis
mnima probada de 10 g.mL-1 se present un porcentaje de inhibicin de 41,6%
(Cuadro 45) en el desarrollo del patgeno y a partir de una concentracin de 150
g.mL-1 se inhibi completamente su crecimiento, por lo cual se considera que es
la concentracin letal para este ensayo.
Varios estudios han demostrado la actividad antifngica para especies del gnero
Lippia, ricas en compuestos fenlicos como el timol y carvacrol. Este es el caso de
L. sidoides, L. gracilis (Lemos et al., 1990), L. graveolens (Salgueiro et al., 2003),
L. chevalieri, L. multiflora (Bassole et al., 2003) y L. origanoides (Santos et al.,
2004). Por lo tanto, los resultados de sta investigacin se atribuye al efecto
inhibidor que presenta el aceite de organo sobre P. infestans al alto contenido de
103
timol (73% en las muestras utilizadas), ya que este compuesto tiene una
comprobada accin antimicrobiana (Braga et al., 2007; Oliveira et al., 2005).
Se han encontrado evidencias en donde se ha evaluado el aceite de organo de
cualquier especie contra el crecimiento de P. infestans, que al ser comparadas con
los resultados de sta investigacin se encuentra que los resultados son similares,
por ejemplo Krolow et al., (2006), evaluaron la actividad antifngica del aceite de
organo (Origanum vulgare) contra el patgeno P. infestans encontrando que en
100 g.mL-1 se redujo el crecimiento en un 59,84%, comparando con los datos de
esta investigacin se tiene que el aceite esencial de organo silvestre (L.
origanoides Kunth) del Alto Pata, tiene un efecto similar sobre este patgeno dado
que en esta misma concentracin (100 g.mL-1) se logra un porcentaje de
inhibicin del 53,6% (Cuadro45).
Los resultados obtenidos en este estudio son comparables con los obtenidos por
Garca et al., (2006) quienes evaluaron la actividad antifngica del aceite de
organo (Origanum vulgare) sobre el hongo Aspergillus flavus, el cual present
una inhibicin completa con una concentracin de 250 g.mL-1 y una dosis mnima
fungicida de 1000 g.mL-1.
105
7 CONCLUSIONES
Las pruebas de antioxidantes realizadas con el aceite de organo de la especie
L. origanoides mediante los ensayos de DPPH y ABTS+ dan como resultados
que este aceite tiene una alta capacidad de captura de radicales, ya que en
ambos ensayos al compararlo con los patrones estndar como el BHA y BHT
dio mejores resultados. La inhibicin del radical libre en el ensayo de DPPH
alcanza el 71,6% y en ABTS+ alcanza 94,34% en las concentraciones ms
altas evaluadas, nicamente lo supera la actividad antioxidante del cido
ascrbico.
Aunque los datos obtenidos de CE50 = 4,73 g.mL-1 con el Ridomil (Metalaxyl
+ Mancozeb), son mejores que el CE50 = 22,53 g.mL-1 con el aceite de
organo, la ventaja que tiene este ltimo es que al ser un producto totalmente
natural no genera daos para el medio ambiente ni poblaciones resistentes de
P. infestans al metalaxyl.
106
8. RECOMENDACIONES
107
BIBLIOGRAFA
BASSOLE, N., QUATTARA, S., NEBIE, R., QUATTARA, AT., ABORE, I., y
TRAORE, A. Chemical composition and antibacterial activities of the essential oils
of Lippia chevalieri and Lippia multiflora from Burkina Faso. Phytochemistry, 2003.
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DOS SANTOS, F.J., LOPES, J.A., CITO, G.L. Composition and Biological Activity
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zeylanicum Blume) y Organo (Origanum Vulgare L.) y su efecto sobre la
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117
ANEXOS
ANEXO A
11,9325
0,696
0,613
0,391
0,299
0,265
0,243
0,225
0,191
0,167
0,157
0,153
0,153
0,153
11,9325
0,028
0,024
0,015
0,012
0,010
0,009
0,009
0,007
0,006
118
11,9325
0,006
0,006
0,006
0,006
%DPPHrem
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
11,9325
100,00
87,98
55,81
42,41
37,51
34,24
31,66
26,69
23,24
21,75
21,24
21,24
21,24
% Inhibicin
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
11,9325
11,897
43,745
57,009
61,862
65,097
67,649
72,573
75,988
77,462
77,965
77,965
77,965
119
190,92
20,986
86,745
86,824
86,863
87,455
88,915
88,915
88,915
88,915
88,915
88,915
88,915
ANEXO B
Segundo ensayo de DPPH con aceite de organo.
Aceite de Organo (0,1- 8,9mg/mL)
Absorbancia
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
120
%DPPHrem
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
121
% Inhibicin
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
122
123
ANEXO C
Ensayo de DPPH con cido ascrbico.
Absorbancia
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
155
160
165
170
175
180
124
185
0,390
0,381
0,259
125
395
0,328
0,301
126
95
0,043
0,044
0,036
0,004
127
305
0,037
0,034
128
%DPPHrem
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
155
160
165
170
175
180
185
190
195
200
129
205
64,766
64,273
41,468
130
415
54,235
50,581
% Inhibicin
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
131
115
31,226
28,851
44,049
132
325
41,802
44,540
133
ANEXO D
Ensayo de DPPH con BHT.
Absorbancia
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0,0019
0,982
0,955
0,949
0,947
0,945
0,943
0,943
0,941
0,936
0,936
0,936
0,936
0,936
0,0225
0,977
0,968
0,961
0,948
0,944
0,939
0,936
0,933
0,925
0,925
0,925
0,925
0,925
0,0019
0,040
0,039
0,039
0,039
0,039
0,039
0,039
0,039
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
134
0,0225
0,040
0,040
0,040
0,039
0,039
0,039
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
0,038
% DPPHrem
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0,0019
100
97,249
96,586
96,433
96,179
96,026
95,975
95,771
95,261
95,261
95,312
95,312
95,312
0,0225
100
99,027
98,361
97,030
96,569
96,108
95,749
95,442
94,623
94,623
94,623
94,623
94,623
0,0019
2,749
3,411
3,564
3,819
3,971
4,022
4,226
4,735
4,735
4,684
4,684
4,684
0,0225
0,972
1,638
2,968
3,429
3,889
4,248
4,555
5,374
5,374
5,374
5,374
5,374
% Inhibicin
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
135
ANEXO E
Ensayo de DPPH con BHA.
Absorbancia
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0,002
0,982
0,974
0,972
0,970
0,970
0,970
0,970
0,969
0,968
0,968
0,968
0,968
0,968
0,018
0,981
0,974
0,961
0,958
0,952
0,947
0,945
0,942
0,939
0,936
0,934
0,934
0,934
0,002
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
0,040
136
0,018
0,040
0,040
0,040
0,039
0,039
0,039
0,039
0,039
0,039
0,038
0,038
0,038
0,038
% DPPHrem
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0,002
100
99,134
98,930
98,777
98,726
98,726
98,726
98,624
98,573
98,522
98,522
98,522
98,522
0,018
100
99,337
97,959
97,653
97,091
96,581
96,326
96,020
95,713
95,458
95,254
95,254
95,254
0,002
0,866
1,069
1,222
1,273
1,273
1,273
1,375
1,426
1,477
1,477
1,477
1,477
0,018
0,663
2,040
2,346
2,907
3,417
3,672
3,978
4,284
4,539
4,742
4,742
4,742
% Inhibicin
Tiempo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
137
ANEXO F
Diseo experimental para datos de porcentaje de crecimiento de P. infestans en
cada tratamiento.
Producto
AEO
Ridomil
AEO
Tween 20
Ridomil
Ridomil
Ridomil
Tween 20
Tween 20
Ridomil
Ridomil
Tween 20
AEO
AEO
Ridomil
Ridomil
Tween 20
Tween 20
Tween 20
AEO
AEO
Tween 20
AEO
Ridomil
Ridomil
Tween 20
AEO
Ridomil
Tween 20
AEO
Ridomil
AEO
Tween 20
Concentracin
g.mL-1
0
200
150
150
100
150
0
50
100
150
10
250
250
200
50
50
200
150
100
100
50
50
250
0
250
250
150
50
250
200
200
10
150
PC
Producto
100
0
0
86,4
0
0
100
86,1
79,3
0
0
87,6
0
0
0
0
86,1
82,2
86,4
50,3
51
87,5
0
100
0
82,2
0
0
85,6
0
0
67,1
86,1
Ridomil
Ridomil
Tween 20
Tween 20
Ridomil
Ridomil
AEO
Tween 20
AEO
AEO
Ridomil
AEO
Ridomil
AEO
Tween 20
AEO
AEO
Tween 20
AEO
Tween 20
Ridomil
AEO
Ridomil
Tween 20
AEO
Ridomil
Ridomil
Tween 20
Tween 20
Ridomil
Ridomil
Tween 20
Ridomil
138
Concentracin
g.mL-1
100
150
200
10
0
250
10
200
50
100
250
150
100
50
100
250
0
250
100
50
150
200
10
50
50
50
250
10
10
250
10
10
0
PC
0
0
83,9
87,5
100
0
58,3
87,3
38,9
42,7
0
0
0
52,5
87,9
0
100
87,3
37,9
87,5
0
0
0
81,9
47,8
0
0
87,5
84,5
0
0
86,3
100
Anexo F (continuacin)
Producto
AEO
Tween 20
Tween 20
Tween 20
AEO
Tween 20
AEO
Tween 20
AEO
Tween 20
AEO
AEO
Tween 20
AEO
Tween 20
Ridomil
Tween 20
AEO
Tween 20
Ridomil
Concentracin
g.mL-1
0
50
0
0
100
0
10
150
200
100
10
150
150
250
250
100
0
100
100
10
PC
Producto
100
82,1
100
100
54,4
100
61,7
74,2
0
83,1
40,8
0
86,9
0
87,3
0
100
46,8
87,5
0
AEO
Tween 20
AEO
AEO
Tween 20
Tween 20
Ridomil
AEO
Tween 20
Ridomil
Ridomil
Ridomil
AEO
Ridomil
AEO
Ridomil
AEO
Ridomil
Ridomil
-
139
Concentracin
g.mL-1
200
200
150
0
0
200
200
50
10
100
150
10
10
0
0
200
250
50
200
-
PC
0
86,7
0
100
100
86,5
0
47,6
86,6
0
0
0
60,4
100
100
0
0
0
0
-