III.

METODE DE ANALIZ BAZATE PE INTERACIUNEA

RADIAIILOR ELECTROMAGNETICE CU MATERIA
Aprofundarea unor noiuni predate la curs
III.5. SPECTROMETRIA DE FLUORESCEN
PRINCIPIUL SPECTROFLUORIMETRIEI
n urma absorbiei de radiaie UV-VIS molecula trece ntr-o stare superioar de energie,
electronii excitai de aceste radiaii pierznd apoi energia prin ciocniri (exist o permanent
trecere a acestora din stare fundamental, energia lor n condiii normale, n stare excitat i
invers). n urma ncetrii aciunii radiaiilor UV-VIS, electronii revin la starea fundamental,
pierznd energia prin ciocniri.
Dac molecula este rigid, pierderea de energie (dezactivare) prin ciocniri este lent i
atunci exist posibilitatea ca o parte din energia electronic absorbit s fie emis sub form
de radiaie UV-VIS (figura 1).

Radiaie
incident

Absorbie

Spectrul de absorbie

Radiaie
transmis

Emisie de
radiaie
fluorescent

Semnal

Spectrul de emisie

b
Figurile 1a i 1b Schimbrile de energie dup absorbia de radiaie UV-VIS cu producere de
fluorescen

Semnal msurat

Radiaia emis prin fluorescen este msurat la un unghi de 90 fa de direcia

radiaiei incidente.
Energia emis este mai mic dect cea absorbit (lungimile de und ale radiaiilor emise
sunt mai mari, dect ale celor de excitare corespunztoare). Emisia fluorescent este astfel
deplasat cu 50 150 nm la lungimi de und mai mari fa de lungimea de und
corespunztoare radiaiei care a produs excitarea. n mod ideal, spectrul de fluorescen (emisie)
este imaginea n oglind a spectrului de excitare (figurile 1a i 2), dar adesea spectrul este
distorsionat prin suprapunerea parial a spectrelor de absorbie i emisie.
Lungimea de und la care se produce absorbia n urma creia apare emisia de radiaie
fluorescent poart numele de lungime de und de excitare ex, iar lungimea de und a radiaiei
emise poart numele de lungime de und de emisie em. n cazul moleculelor cu mai multe benzi
de absorbie, banda situat la cea mai mare lungime de und este de regul asociat cu
producerea fluorescenei i, n practic, lungimea de und folosit pentru excitare este apropiat
de max a acestei benzi.

Emisie

Excitare

Lungime de und, nm

Figura 2. Spectre de excitare i de emisie (ideal)

Spectrofluorimetria are mai multe avantaje:

metod selectiv care poate fi folosit pentru determinarea cantitativ a compuilor
fluoresceni n prezena celor nefluoresceni
-6
-9
sensibilitate mare, permind determinarea unor concentraii de ordinul 10 10 g/ml
Exist ns unele limitri :

tehnica este aplicabil numai anumitor compui (structuri moleculare rigide) nu toate
substanele au fluorescen
este puternic influenat de temperatur, pH
fluorescena poate fi afectat de unele specii absorbante n UV i de metalele grele prezente
n soluie

RELAIA FLUORESCEN - CONCENTRAIE

Cea mai important aplicaie a fluorescenei este analiza cantitativ. Ca i n cazul altor
metode instrumentale de analiz, analiza cantitativ se bazeaz pe msurarea fluorescenei sub
forma unui semnal analitic care variaz n funcie de concentraia analitului. Odat analizat,
semnalul obinut pentru prob este transformat n concentraie cu ajutorul unor grafice de
calibrare prin msurarea semnalelor pentru un numr de soluii standard ce conin cantiti
cunoscute de analit.
n procesul fluorescenei parametrii echivaleni cu absorbtivitatea din spectrofotometria
de absorbie definesc eficiena fluorescenei.
Intensitatea fluorescenei depinde de cantitatea radiaiei absorbite i aceasta este
determinat de concentraia speciilor fluorescente.
Mrimea numit intensitatea fluorescenei If se refer la fluorescena total i depinde de
concentraie conform relaiei:
If = K I0 c
unde I0 este intensitatea radiaiei incidente, c concentraia speciei fluorescente, K constant ce
caracterizeaz analitul aflat ntr-o anumit matrice. If corespunde unei perechi de ex i em.
Peste anumite valori ale concentraiei, ns, fluorescena nu mai este proporional cu
concentraia ca urmare a nelinearitii legii Lambert-Beer. Relaia de proporionalitate, respectiv
fluorescena, sunt diminuate de apariia complecilor, de asociaia ntre moleculele excitate i
cele rmase n stare fundamental.
Metodele principale de determinare cantitativ sunt identice cu cele prezentate la
spectrometria de absorbie UV-VIS.
Spre deosebire de spectrometria de absorbie UV-VIS, spectrofluorimetria este mai
sensibil deoarece se msoar direct semnalul de fluorescen, If, care este direct proporional
cu intensitatea radiaiei incidente I0. Se pot astfel studia i probe foarte diluate, folosind surse de
radiaii mai intense. Observaie: n spectrometria UV-VIS se msoar absorbana A care este
direct proporional cu concentraia, dar A este de fapt logaritmul raportului intensitii radiaiei
incidente I0 i a celei transmise IT; n cazul soluiilor cu concentraii mici, absorbia este mic, iar
IT mare i apropiat de I0, deci A este logaritmul unui raport care tinde ctre 1 i deoarece log 1 =
0, A va tinde ctre 0; se explic astfel sensibilitatea mai mic a spectrometriei UV-VIS comparativ
cu spectrofluorimetria.

FACTORI CARE GUVERNEAZ PROPRIETATEA DE

FLUORESCEN
Structura
n general, fluorescena este asociat cu un sistem cromofor/auxocrom extins i o
structur rigid:
- Moleculele cele mai fluorescente sunt cele coninnd unul sau mai multe nuclee
aromatice (benzen, naftalin, antracen) i anumii heterocicli (chinolinic, cumarinic,
indolic).
- Gruprile electrodonoare: , -NR2, -NHR, -NH2, -OR, -OH, -F, sunt considerate
activatori de fluorescen.
- Gruprile electroacceptoare: -COOH, -COOR, -CHO, -COR, -NO2, -NO, -Cl, -Br, -I
diminueaz intensitatea fluorescenei.

Structurile rigide diminueaz viteza conversiei interne i favorizeaz emisia fotonilor

prin fluorescen.

a
b
Figura 3. Structurile chimice ale (a) clorhidratului de chinin i (b) metoclopramidei
Tabelul 1. Exemple de substane medicamentoase fluorescente
Substan
Chinina
Metoclopramida
Riboflavina
Procaina
Adrenalina
Clorpromazina

ex
350
272
444
275
295
350

em
450
356
520
245
335
480

n figura 3 sunt prezentate structurile chimice ale chininei i metoclopramidei, dou

structuri chimice care au proprietatea de fluorescen. Chinina este o structur rigid i un sistem
cromoforic extins. Metoclopramida conine un nucleu aromatic care, n prezena gruprilor metoxi
i amid, confer o proprietate de fluorescen important.
Caracteristicile de fluorescen ale unor substane medicamentoase sunt prezentate
cumulat n tabelul 1.
Factori externi

Concentraia unui compus fluorescent n soluie nu trebuie s fie foarte mare; de regul, n
vederea determinrilor de fluorescen, concentraiile soluiilor sunt de 10 100 ori mai mici
dect cele corespunztoare msurtorilor spectrometrice UV-VIS. n figura 4 se observ c
intensitatea fluorescenei este direct proporional cu concentraia pe un domeniu ngust,
situat la concentraii mici. Pe msur ce crete concentraia, fluorescena se reduce i devine
zero, datorit unui fenomen de reabsorbie a radiaiei emise de ctre moleculele neexcitate.

Figura 4. Variaia intensitii fluorescenei cu concentraia

pH-ul soluiei afecteaz soluii fluorescente cu caracter acido-bazic. De exemplu,

fluorescena metoclopramidei scade la pH alcalin (figura 5), punctele de inflexiune ale curbei
fiind n legtur cu valorile pKa ale substanei.
Unitati de fluorescenta (T%)

50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0

10

Figura 5. Variaia fluorescenei metoclopramidei n funcie de pH

(
ex = 272 nm, em = 356 nm)

Atomii grei n soluie sting fluorescena prin coliziune cu moleculele excitate (de exemplu,
ionii de bromur).
Solvenii vscoi favorizeaz fluorescena prin mpiedicarea dezactivrilor prin ciocnire.
Fluorescena este dependent de temperatur deoarece aceasta favorizeaz dezexcitrile
prin coliziune; o molecul care nu este fluorescent la temperatura camerei poate deveni
fluorescent la temperaturi mai sczute.
Formarea complecilor n soluie poate modifica comportarea fluorescent a unor compui.
De exemplu, prezena cafeinei n soluie reduce fluorescena riboflavinei.

ASPECTE INSTRUMENTALE
Elementele principale ale unui spectrometru de fluorescen (Figura 6) sunt :
- sursa de radiaii lamp cu halogen, xenon, vapori de mercur
- monocromator pentru selectarea radiaiei de excitare
- monocromator pentru scanarea radiaiei de emisie
- geometria radiaiilor de excitare i emisie este la 90
- cuva cu prob are toate feele transparente i sunt confecionate, de regul, din cuar

Figura 6. Schema de principiu a unui spectrofluorimetru

Dup http://www.chemicool.com/img1/graphics/fluor-schematic.gif