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Ma nua l de
Tcnicas Hematolgicas
2010
BIOSSEGURANA
1. Boas Prticas Individuais
A norma ABNT NBR 14785/2001 trata dos Requisitos de Segurana no Laboratrio Clnico
aplicveis a todo o territrio nacional. Com base nela, recomendam-se as seguintes precaues
universais:
proibir alimentos, bebidas ou fumo na rea tcnica do laboratrio;
armazenar alimentos exclusivamente em reas de alimentao, em locais adequados, sendo
proibido alimentos ou bebidas nos armrios, gavetas, refrigeradores e freezers utilizados para o
armazenamento de reagentes, amostras biolgicas, materiais e insumos para coleta;
no colocar na boca quaisquer materiais ou objetos empregados no ambiente de trabalho, tais
como: canetas, lpis, etiquetas, selos e envelopes;
jamais pipetar com a boca, devendo-se empregar pipetas automticas, sempre que necessrio;
no fazer a aplicao de cosmticos e maquiagens na rea de coleta;
evitar o manuseio de lentes de contato na rea de coleta do laboratrio;
prender/proteger cabelos e barbas durante a jornada de trabalho no laboratrio, a fim de evitar
contato com materiais e superfcies contaminados. Estes devem ser mantidos distantes de
equipamentos como centrfugas e/ou bicos de Bunsen. Pode-se utilizar tocas descartveis com
esta finalidade;
limpar e aparar as unhas e caso sejam utilizados esmaltes, preferir os de cor clara;
evitar o uso de correntes compridas no pescoo, brincos grandes ou braceletes soltos;
lavar as mos aps o manuseio de qualquer material biolgico.
A sala deve ser utilizada exclusivamente para coleta e apenas o paciente e o flebotomista
devem permanecer no local. Excees a essa regra so as situaes em que houver
necessidade de um acompanhante para auxiliar na execuo do procedimento.
Ateno: punes arteriais no devem ser consideradas como uma alternativa venopuno
pela dificuldade de coleta e riscos de infeco.
2. COLETA DO SANGUE
2.1 Antissepsia do local da puno
O procedimento de venopuno deve ser precedido pela higienizao do local para prevenir a
contaminao microbiana de cada paciente ou amostra.
Antisspticos
Para a preparao da pele, o uso de antisspticos necessrio.
Dentre eles, citamos: lcool isoproplico 70% ou lcool etlico, iodeto de povidona 1 a 10% ou
gluconato de clorexidina para hemoculturas, substncias de limpeza no-alcolicas (como
clorexidina, sabo neutro).
Procedimento
Recomenda-se usar uma gaze ou algodo umedecido com soluo de lcool isoproplico ou
etlico 70%.
Limpar o local com um movimento circular do centro para fora.
Permitir a secagem da rea por 30 segundos para prevenir hemlise da amostra e reduzir a
sensao de ardncia na venopuno.
No assoprar, no abanar e no colocar nada no local.
No tocar novamente na regio aps a antissepsia.
Se a venopuno for difcil de ser obtida e a veia precisar ser palpada novamente para efetuar a
coleta, o local escolhido deve ser limpo novamente.
2. Solicitar ao paciente que diga seu nome completo para confirmao do pedido mdico e
etiquetas.
3. Conferir e ordenar todo o material a ser usado no paciente, de acordo com o pedido mdico
(tubo, gaze, torniquete, etc.). A identificao dos tubos deve ser feita na frente do paciente.
4. Informar ao paciente como ser realizado o procedimento.
5. Abrir a seringa na frente do paciente.
6. Higienizar as mos.
7. Calar as luvas.
8. Posicionar o brao do paciente, inclinando-o para baixo, na altura do ombro.
9. Se o torniquete for usado para seleo preliminar da veia, pedir para que o paciente abra e
feche a mo; em seguida, afrouxar o instrumento e esperar 2 minutos para utiliz-lo novamente.
10. Fazer a antissepsia.
11. Garrotear o brao do paciente.
12. Retirar a proteo da agulha.
13. Fazer a puno numa angulao oblqua de 30graus, com o bisel da agulha voltado para
cima, se necessrio, para melhor visualizar a veia, esticar a pele com a outra mo, longe do local
onde foi feita a antissepsia.
14. Desgarrotear o brao do paciente assim que o sangue comear a fluir dentro da seringa.
15. Aspirar devagar o volume necessrio, de acordo com a quantidade de sangue requerida na
etiqueta dos tubos a serem utilizados (respeitar, ao mximo, a exigncia da proporo
sangue/aditivo). Aspirar o sangue, evitando bolhas e espuma, com agilidade, pois o processo de
coagulao do organismo do paciente j foi ativado no momento da puno.
16. Retirar a agulha da veia do paciente.
17. Exercer presso no local, em geral, de 1 a 2 minutos, evitando, assim, a formao de
hematomas e sangramentos. Se o paciente estiver em condies de faz-lo, oriente-o para que
faa a presso at que o orifcio da puno pare de sangrar.
18. Tenha cuidado com a agulha para evitar acidentes perfurocortantes.
19. Descartar a agulha imediatamente aps sua remoo do brao do paciente, em
recipiente adequado, sem a utilizao das mos (de acordo com a normatizao nacional
no desconectar a agulha no reencapar). Caso esteja usando agulha com dispositivo de
segurana, ativar o dispositivo e descartar a agulha no descartador para objetos perfurocortantes,
de acordo com a NR32.
Ateno: totalmente contraindicado perfurar a rolha do tubo, pois esse procedimento pode
causar a puno acidental, alm da possibilidade de hemlise.
20. De acordo com o CLSI, deve-se utilizar, aps a coleta com seringa e agulha, um dispositivo
de transferncia de amostra.
21. Conectar o dispositivo de transferncia na seringa, introduzir os tubos a vcuo e aguardar o
sangue parar de fluir em direo ao interior do tubo. Realizar a troca dos tubos sucessivamente.
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ANTICOAGULANTES
Anticoagulantes so substncias usadas para impedir a coagulao e retardar a
deteriorao do sangue. Devem interferir o mnimo possvel com as caractersticas das clulas e
estar contido em pouco volume para evitar diluio do sangue.
A escolha correta do tipo e quantidade de anticoagulante importante. Uma quantidade
insuficiente pode permitir a coagulao sangunea e o excesso pode interferir nos exames.
2. Preparo de Anticoagulantes:
1) Soluo de EDTA 10%
EDTA (K2) --------------------------------10,0 g
gua destilada -----------------------------100,0 ml
necessrio dissolver o EDTA (K2) a quente.
Usar 0,05 ml (1 gota) para cada 5 ml de sangue.
Conservar a temperatura ambiente, esta soluo no altera com o tempo.
2) Citrato de Sdio 3,8% (Na3C6H5O7.2H2O)
Na3C6H5O7.2H2O ---------------------------3,8 g
gua destilada -----------------------------100,0 ml
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Fazer o esfregao deslizando com movimento suave e contnuo a outra extremidade, sem
alterar o ngulo inicial.
OBS:
O bom esfregao deve ser fino e homogneo e ocupar da lmina
O esfregao pode ser mais curto ou mais longo:
>ngulo extenso mais curta
< ngulo extenso mais longa.
2. Princpio do Teste
Romanowsky idealizou um mtodo em que uma soluo de corantes poderia corar
diferentes estruturas. Misturas dos corantes eosina e azul de metileno so preparadas
segundo a proposio de vrios autores: Leishman, May-Grunwald, Giemsa, Wright e outros.
Estes corantes so dissolvidos em lcool, em geral metanol. Na soluo envelhecida, o
azul de metileno se oxida em gradaes diferentes, originando diversos azures de metileno.
Teremos ento uma soluo alcolica de um complexo eosinato de azul e azures de
metileno. Tratada pelos corantes, a clula evidencia estruturas acidfilas, basfilas e
neutrfilas, conforme a reteno do corante cido, bsico ou neutro, respectivamente.
O ncleo celular cido pela presena de cido desoxirribonuclico (DNA), cora-se pelo
azul de metileno, enquanto o citoplasma alcalino cora-se pela eosina.
*Corantes cidos coram estruturas bsicas EOSINA cora eritrcitos e grnulos de
eosinfilos.
*Corantes bsicos coram estruturas cidas AZUL DE METILENO cora os ncleo dos
leuccitos, citoplasma de linfcitos e moncitos, grnulos dos basfilos e fracamente os
grnulos dos neutrfilos.
O mtodo da colorao de May-Grunwald-Giemsa, associa o corante de May-Grunwald,
pouco especfico para o ncleo, com o Giemsa que apresenta afinidade nuclear.
3. AMOSTRAS
- Preparo prvio do paciente: no h necessidade de se colher sangue para o hemograma
em jejum nos casos de dietas leves, contudo, em casos de refeies completas, deve-se
aguardar pelo menos 3 horas.
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- Cobrir as lminas com o corante de Giemsa recm diludo (1 gota de corante para 1 ml de
gua tamponada) e deixar por 10 minutos.
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6. LIMITAES DO MTODO
- Os esfregaos devero estar perfeitamente secos.
- A colorao dever ser realizada distante dos vapores cidos ou alcalinos para evitar
variaes de pH, as quais iro influenciar na obteno de uma boa colorao.
- Os tempos de colorao podem variar de acordo com as condies ambientais e qualidade
do corante.
O EXAME MICROSCPICO
O exame microscpico das extenses de sangue tem como objetivo:
- Confirmar as contagens de hemcias, leuccitos e plaquetas;
- identificar eventuais clulas anormais presentes no sangue;
- realizar a contagem diferencial de leuccitos.
A inspeo da extenso feita em menor aumento (objetiva 10X). A qualidade da extenso
e da colorao verificada. Devem ser pesquisados os microcogulos, responsveis por erros de
contagens e a aglomerao de leuccitos maiores na ponta da extenso, responsvel por erros
na contagem diferencial. A distribuio das clulas pela extenso deve ser sempre homognea,
sem agrupamentos.
Os agrupamentos mais comuns so:
- aglutinao de hemcias;
- empilhamento ou rouleaux de hemcias;
- agrupamento dos leuccitos;
- agregados plaquetrios;
- satelitismo plaquetrio ao redor dos neutrfilos.
A identificao inicial das clulas feita no aumento maior (objetiva de 40X). Se realizada
aps a contagem diferencial automatizada, deve confirmar a contagem e pesquisar a presena de
clulas anormais. A contagem diferencial manual feita tradicionalmente em 100 leuccitos, deve
ser feita em pelo menos 200 leuccitos para melhorar a preciso. Por exemplo: 50% de linfcitos
contados em 100 leuccitos podem corresponder de 39,8 a 60,2%; em 200 leuccitos, de 42,9
at 57,1%; em 500 leuccitos, de 45,5 at 54,5%; e em 1.000 leuccitos, de 46,9 at 53,1%.
A identificao final e contagem diferencial das clulas feita no aumento de imerso
(objetiva de 100X). So achados importantes:
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Plaquetas
Eritrcitos normais
Leuccitos
o Neutrfilos
Bastonete
Segmentado
o Eosinfilo
o Basfilo
o Moncito
o Linfcito
plaquetas
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500 X
Leuccitos
Neutrfilos
Bastonete
Segmentado
Eosinfilo
Basfilo
Moncito
Linfcito
NO
SIM
Mononuclear
eosinfilo
linfcito
basfilo
neutrfilo
moncito
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Segmentado
Tamanho:14-20 m
formato:oval/redondo
cor do citoplasma: rseo
granularidade:granulaes
puntiformes (neutras)
forma do ncleo:lobulado
(normalmente menos que 5)
Tipo de cromatina:condensada
relao n/c:baixa
nuclolo: no visvel
ocorrncia sangue: 40-75%
ocorrncia medula: 5-20%
Eosinfilo
Tamanho:15-25 m
formato:oval/redondo
cor do citoplasma: rseo plido,
coberto por grnulos.
granularidade: granulaes globosas
(vermelha-alaranjada)
forma do ncleo:lobulado/semicircular
Tipo de cromatina:condensada
relao n/c:baixa
nuclolo: no visvel
ocorrncia sangue: 2-4%
ocorrncia medula: <2%
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Basfilo
Tamanho:12-18 m
formato:oval/redondo
cor do citoplasma: rseo plido,
coberto por grnulos.
granularidade: granulaes
grosseiras de tamanho varivel
(prpura/negra)sobre citoplasma e
ncleo.
forma do ncleo: lobulado (pouco
visvel)
Tipo de cromatina:condensada
relao n/c:baixa
nuclolo: no visvel
ocorrncia sangue: <1%
ocorrncia medula: <1%
RESUMINDO:
GRANULCITOS (neutrfilos, eosinfilos e basfilos)
2. MONONUCLEARES
Linfcitos: Pequeno, mdio e grande
Tamanho:7-15 m
formato:oval/redondo
cor do citoplasma:azul
granularidade: ausente
forma do ncleo: redondo ou
ligeiramente oval.
Tipo de cromatina:homognea e
condensada
relao n/c:alta
nuclolo: no visvel, algumas vezes
dificilmente visvel
ocorrncia sangue: 25-40%
ocorrncia medula: 5-20%
Linfcito grande
MGG 1000X
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Linfcito pequeno
MGG 1000X
Moncito
Tamanho:15-25 m
formato:oval/redondo ou irregular
cor do citoplasma:cinza-azul
granularidade: ausentes
forma do ncleo: irregular
Tipo de cromatina: delicada, fina,
com espaos claros e pontos de
condensao
relao n/c:moderada ou baixa
nuclolo: no visvel
ocorrncia sangue: 4-8%
ocorrncia medula: <2%
MGG 1000X
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Preenchimento da Cmara
Para conter o sangue diludo que ser depositado sobre o retculo a lamnula dever ser
fixada s plataformas da cmara. Isso ser conseguido umedecendo levemente as extremidades
da lamnula que sero comprimidas com os polegares sobre a plataforma. O material diludo ser
agora colocado, atravs da micropipeta entre o retculo e a lamnula. As caractersticas de um
bom enchimento no permitem excessos, falta de lquido ou bolhas de ar na preparao,
conforme ilustrado na figura abaixo.
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Sistematizao da Contagem
Aquelas clulas que tocam as linhas divisrias do quadro esquerda e superiormente so
contadas para este quadro, enquanto os que tocam as linhas direita e inferiormente so
contadas nos quadros respectivos ou desprezadas, se esto no limite extremo da rea a ser
contada.
HEMOGRAMA
O hemograma corresponde a um conjunto de testes laboratoriais que estabelece os
aspectos quantitativos e qualitativos dos eritrcitos (eritrograma), dos leuccitos
(leucograma) e das plaquetas (plaquetograma) no sangue.
I - Eritrograma : inclui os testes laboratoriais que determinam o perfil hematolgico da srie
vermelha no sangue perifrico. constitudo por:
- Contagem de eritrcitos;
- Dosagem de Hemoglobina;
- Hematcrito;
- ndices Hematimtricos (VCM, HCM, CHCM, RDW);
- Avaliao da morfologia eritrocitria (esfregao sanguneo corado).
II - Leucograma: engloba os testes laboratoriais que determinam o perfil hematolgico da srie
branca (leuccitos) no sangue perifrico. constitudo por:
- Contagem Global e Diferencial de Leuccitos
- Anlise morfolgica no esfregao sanguneo.
III - Plaquetograma: Envolve a contagem de plaquetas e a avaliao da sua morfologia feita por
microscopia no esfregao sanguneo.
Tanto o eritrograma, o leucograma e o plaquetograma podem ser determinados por
tcnicas manuais e automatizadas.
TCNICAS MANUAIS
A Homogeneizao do Sangue
A sedimentao ocorre espontaneamente nos tubos de coleta mantidos nas estantes.
Inicialmente, a parte superior fica mais diluda e a parte inferior mais concentrada. Se
analisadas, resultaro em uma falsa anemia e uma falsa policitemia, respectivamente.
Posteriormente, com a deposio das hemcias no fundo do tubo de coleta, o plasma fica visvel
na parte superior do tubo. A homogeneizao do sangue necessria antes de qualquer
procedimento e realizada com movimentos que deslocam uma bolha de ar por todo o tubo, do
topo at o fundo, promovendo a mistura entre o plasma e as clulas. Essa pode ser feita manual
ou em homogeneizadores mecnicos de bancada. Independente do modo, a homogeneizao
deve ter a eficincia documentada por testes de reprodutibilidade de resultados. Os tubos de
coleta preenchidos at quase o topo e as amostras com hematcrito elevado demoram mais para
atingir a homogeneizao correta.
ERITROGRAMA
1 - CONTAGEM DE HEMCIAS
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Pipeta graduada de 5 ml
- Micropipeta 20l
- Ponteiras
- Tubo de hemlise
- Cmara de Neubauer
- Microscpio ptico
REAGENTES
Lquido de Hayem
Sulfato de Sdio ..................................................................................... 2,5 g
Cloreto de Sdio .....................................................................................0,5 g
Bicloreto de Mercrio ............................................................................. 0,25 g
gua destilada q.s.p. ...............................................................................100,0 ml
Filtrar e conservar a temperatura ambiente
PROCEDIMENTO TCNICO
- Em um tubo de hemlise pipetar 4 ml de lquido diluidor;
- Transferir para o tubo contendo o lquido diluidor 20 l de sangue homogeneizado;
- Agitar suavemente com o auxlio de uma micropipeta e homogeneizar por inverso;
- Preencher o retculo da cmara evitando o excesso de lquido e bolhas de ar;
- Fazer a contagem com objetiva de 10X, no retculo central da cmara, nos cinco quadrados
indicados na figura com a letra H;
- Sistematizar a contagem;
- Calcular o nmero de eritrcitos/ mm3 (L)
Valores de Referncia
Homem
Mulher
Recm-nascidos
2 - DETERMINAO DO HEMATCRITO
MTODO
Micromtodo microhematcrito
Corresponde ao volume compacto das hemcias em relao ao volume total de sangue.
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Tubos capilares resistentes e de dimetro uniforme
- Grfico de leitura
- Bico de gs
- Centrfuga para microhematcrito
PROCEDIMENTO TCNICO
- Preencher com sangue o tubo capilar de 75 mm de comprimento at cerca de 2/3 do seu
volume, limpar o capilar com papel absorvente.
- Selar a extremidade vazia,(parte oposta que foi utilizada para aspirao do sangue) do tubo na
chama (Bico de Bunsen). Mant-lo horizontalmente e perpendicular chama.
- Colocar o tubo capilar na centrfuga de microhematcrito com a parte selada voltada para fora,
equilibrando-o com outro tubo. Observar a numerao evitando a troca de amostras.
- Centrifugar por 11.000 rpm, por 5 minutos.
- Leitura feita atravs de escala prpria.
- Colocar o tubo sobre a escala, fazendo coincidir o menisco inferior das hemcias com linha zero
e o menisco superior do plasma com a linha 100 e fazer a leitura ao nvel da separao entre
plasma e hemcias sedimentadas, desprezando-se a camada leucocitria.
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VALORES DE REFERNCIA
Homem
Mulher
Recm-nascidos
Crianas (at 3 meses)
Crianas (at 1 ano)
Crianas (3 a 6 anos)
Crianas (10 a 12 anos)
40 a 54%
37 a 47%
44 a 64%
32 a 44%
30 a 40%
36 a 44%
37 a 45%
DACIE e LEWIS
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3 - DOSAGEM DE HEMOGLOBINA
FUNDAMENTO
Tem por princpio bsico a oxidao do on ferroso (divalente), da hemo, da oxi e da
carboxihemoglobina a ferro frrico (trivalente), pelo ferricianeto, com formao de
metahemoglobina, que se combina com o cianeto de potssio para produzir
cianometahemoglobina (cor vermelho - alaranjada), medida fotocolorimetricamente em 540 nm.
MTODO
Cianometahemoglobina
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Micropipeta 20l
- Pipeta de 5 ml
- Ponteiras
- Tubo de hemlise
- Espectrofotmetro
- Soluo padro de hemoglobina
REAGENTES
Drabkin Modificado
K3Fe (CN)3 ........................................................................ 200 mg
KCN .....................................................................................50 mg
KH2PO4 ...............................................................................140 mg
STEROX SE ........................................................................ 0,5 mg
gua destilada q.s.p. ............................................................ 1.000 ml
Acondicionar em frasco de vidro escuro e conservar a temperatura ambiente.
PROCEDIMENTO TCNICO
- Em um tubo de hemlise pipetar 5 ml de lquido diluidor;
- Transferir para o tubo contendo o lquido diluidor 20 l de sangue homogeneizado;
- Agitar suavemente com o auxlio de uma micropipeta e homogeneizar por inverso, aguardar 5
minutos para a leitura;
- A leitura feita em espectrofotmetro calibrado em 540 nm;
- Fazer o mesmo com o sangue padro com concentrao conhecida.
O branco ser a prpria soluo de Drabkin; a cor estvel por 72 horas; o
procedimento de diluio do padro o mesmo da amostra.
CLCULO
Concentrao de hemoglobina = D.O x Fator
O fator dever ser obtido a partir da soluo padro, baseado no seguinte procedimento:
- Inicialmente transformar o valor do padro, expresso no rtulo em mg/dl para g/dl, dividindo por
1.000 e multiplicando pelo fator de diluio (250).
Ex: Soluo padro da BIOLAB-HEMATROL
Concentrao do Padro = 60mg/dL
Conc. Padro = 60 x 250/1.000
Conc. Padro = 15 g/dL
Em seguida preparar uma srie de 06 tubos com diferentes pontos de diluio. Exemplo:
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TUBOS
Soluo
Padro
de
Hb (mL)
Soluo
Drabkin
modificado
(mL)
[ ] Hb
(g/dL)
D.O
FATOR
01
15,0
29,0
0,51
02
12,0
23,0
0,52
03
9,0
18,0
0,50
04
6,0
12,0
0,50
05
3,0
6,0
0,50
06
--------
-------
---------
Valores de Referncia
Homens
Mulheres
14 a 18 g/dl
12 a 16g/dl
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4 - NDICES HEMATIMTRICOS
Relacionando-se os resultados da contagem de hemcias, da dosagem de hemoglobina e
das determinaes do hematcrito, obtm-se os ndices hematimtricos, que so de grande
importncia na avaliao da srie vermelha. Os principais ndices hematimtricos usados na
rotina so:
Valores de Referncia
VCM: 80 a 96 fL
VCM < 80 MICROCITOSE
VCM > 94 MACROCITOSE
HCM: 27 a 32 pg
HCM < 27 HIPOCROMIA E MICROCITOSE
HCM > 32 MACROCITOSE
CHCM: 32 a 36 %
CHCM < 32 HIPOCROMIA
CHCM > 36 ESFEROCITOSE
Definies
*Anisocitose: o aumento da variabilidade do tamanho das hemcias.
*Microcitose: a diminuio do tamanho mdio das hemcias.
*Macrocitose: o aumento do tamanho mdio das hemcias.
*Hipocromia: a diminuio da colorao das hemcias com conseqente aumento da regio de
palidez central das mesmas.
*Policromasia: descreve as hemcias que tem colorao rseo-azulada ou rseo acinzentada.
*Pecilocitose ou poiquilocitose: refere-se presena significativa de hemcias de forma
anormal.
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LEUCOGRAMA
1 - CONTAGEM GLOBAL DE LEUCCITOS
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Pipeta com divises de 0,01ml
- Micropipeta 20l
- Tubo de hemlise
- Cmara de Neubauer
- Microscpio ptico
REAGENTES
Lquido de Turk
cido actico glacial .....................................................................................3,0 ml
Violeta de Genciana ou Azul de metileno (sol. Aquosa 1%).........................1,0 ml
gua destilada q.s.p. ....................................................................................100,0 ml
PROCEDIMENTO TCNICO
- Em um tubo de hemlise pipetar 0,4 ml de lquido diluidor;
- Transferir para o tubo contendo o lquido diluidor 20 l de sangue homogeneizado;
- Agitar suavemente com o auxlio de uma micropipeta;
- Preencher o retculo da cmara evitando o excesso de lquido e bolhas de ar;
- Deixar sedimentar por 3 minutos;
- Fazer a contagem com objetiva de 10X, nos quatro retculos laterais da cmara;
- Sistematizar a contagem;
- Calcular o nmero de leuccitos/ mm3
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CLCULO
Leuccitos/mm3 de sangue = Y x 20 x10/ 4
Leuccitos/mm3 de sangue = Y x 50
Onde: Y = nmero de leuccitos contados
20 = fator de converso da diluio
10 = fator de converso da altura da cmara
4 = fator de converso da rea.
Valores de Referncia
Adultos
Recm-nascidos
Crianas at 1 ano
Crianas de 4 a 7 anos
5.000 a 10.000/mm3
10.000 a 25.000/mm3
6.000 a 18.000/mm3
6.000 a 15.000/mm3
CARVALHO
OBSERVAES
PROCEDIMENTO
Objetiva 100X leo de imerso
Condensador levantado e diafragma aberto.
A microscopia deve ampliar com nitidez a imagem das clulas em campos adequados, prximos
ao final da extenso de sangue, onde as clulas se encontram lado a lado, sem sobreposio.
PLAQUETOGRAMA
CONTAGEM DE PLAQUETAS
MTODO
Mtodo Direto
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Tubo de plstico 12X75 mm
- Micropipeta 20l
- Pipeta de vidro de 1 ml
- Cmara de Neubauer
- Placa de Petri
- Microscpio
REAGENTES
Soluo de Oxalato de amnio a 1%
Oxalato de amnio .......................................1,00g
gua destilada qsp ......................................... 100 ml
Azul de metileno a 1% ..................................... 2 gotas
EDTA a 1%....................................................... 2 gotas
Guardar em geladeira
PROCEDIMENTO TCNICO
- Pipetar 0,4 ml de soluo diluidora no tubo de plstico;
- Transferir 20l de sangue para o tubo com a soluo diluidora (1:20)
- Homogeneizar suavemente sem formar espuma e aguardar 5 minutos;
- Homogeneizar novamente e encher a cmara de Neubauer;
- Colocar a cmara numa placa de petri contendo algodo mido, deixando a preparao por 20
minutos, para sedimentao das plaquetas;
- Fazer a contagem microscpica com aumento de 200X ou 400X em 1/5 de mm2 (5 quadrados
do quadro central). Sistematizar contagem!
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CLCULO
Nmero de plaquetas/mm3= N X 20X 10 X 5
Nmero de plaquetas/mm3= N X 1000
N= nmero de plaquetas contadas
20= ttulo de diluio
10= fator de converso da profundidade da cmara
5= fator de converso da rea da cmara
Valor de Referncia
150.000 a 400.000/mm3
OBSERVAES:
- Um bom critrio de qualidade para obteno de resultados reprodutveis obter a contagem de
pelo menos 150 (200) plaquetas ao final da contagem dos cinco quadrantes do quadrado central.
- Para amostras plaquetopnicas, podero ser utilizados os protocolos que incluam diluies de
1:10 ( 20l sangue para 180l do diluente).
Nmero de plaquetas/mm3= N X 500
- Casos gravemente plaquetopnicos em que, mesmo com a utilizao da diluio 1:10, no seja
possvel contar pelo menos 150 plaquetas, fazer contagem em todo o retculo central.
Nmero de plaquetas/mm3= N X 100
Estimativa grosseira do n de plaquetas no esfregao sanguneo
- Contar 10 campos do esfregao corado
- Multiplicar por 13.000 = n de plaquetas /
l
- Aps 1 hora, ler a coluna de plasma formada, desde a marca zero at o nvel de encontro com
as hemcias.
- Expressar o resultado em mm
OBSERVAO:
O teste dever ser realizado at 6 horas aps a colheita do sangue
A conservao do sangue aps o perodo preconizado retarda a hemossedimentao
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TESTE DE FALCIZAO
FUNDAMENTOS
Entre lmina e lamnula lacrada por meio de esmalte e em presena de um agente redutor
(Metabissulfito de sdio), as hemcias que contm Hb S se cristalizam e adquirem a configurao
peculiar de foice, enquanto as hemcias normais no se falcizam. A falcizao se explica pela
polimerizao de desoxiemoglobina S. Um teste positivo necessrio para confirmar se uma
hemoglobina que migra ao nvel de S, por eletroforese alcalina, realmente esta hemoglobina.
MTODO
Daland e Castle
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Microscpio
- Lminas e lamnulas
- Pipetas de Pasteur
- Placas de Petri
- Esmalte de unhas
REAGENTES
Soluo de Metabissulfito de Sdio a 2%
Metabisulfito de sdio ............................ 20mg
gua destilada ......................................... 1,0 ml
Esta soluo deve ser preparada no momento de realizar o teste
PROCEDIMENTO TCNICO
- Misturar em uma lmina de microscopia uma gota de sangue colhido em EDTA e uma da
soluo de metabisulfito de sdio a 2%.
- Cobrir a preparao com lamnula, vedando-a com esmalte de unha, para impedir a entrada de
oxignio. Deve-se tambm evitar a formao de bolhas de ar.
- Conservar a preparao em cmara mida (placa de petri com algodo embebido em gua)
- Observar em microscpio com 400X de aumento, aps 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12
horas e 24 horas de incubao.
EXPRESSO DO RESULTADO
dado como positivo ou negativo
Precaues
A cmara mida deve ser colocada em lugar fresco, temperatura ambiente;
A vedao da lmina e lamnula fundamental
A concentrao do metabisulfito, bem como sua preparao no momento de uso so
pontos crticos.
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RELATRIO DE RESULTADOS
A falcizao se explica pela polimerizao de desoxihemoglobina S. Um teste positivo
necessrio para confirmar se uma hemoglobina que migra ao nvel da S, por eletroforese alcalina,
realmente esta hemoglobina. O fenmeno da falcizao (teste positivo) ocorre em portadores
de Hb S, com variao de tempo entre os diferentes tipos: HbSS (1 a 3 horas); Hb SC e HbSD (6
a 12 horas); Hb S/talassemia beta (12 a 24 horas); Hb AS (12 a 24 horas). Entretanto esta relao
falcizao / gentipo / tempo no constante e tambm no serve para caracterizar gentipo.
Aps 24 horas, na ausncia de eritrcitos falcizados, o resultado ser dado como negativo.
LIMITAES DO MTODO
- A hemoglobina fetal aumentada, em associao com hemoglobina S, prejudica a falcizao.
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CONTAGEM DE RETICULCITOS
FUNDAMENTOS
Os reticulcitos so hemcias jovens que, quando coradas com corantes supravitais, esses
se agregam aos ribossomos remanescentes da hemcia, formando um precipitado na forma de
uma rede. Os reticulcitos compreendem uma fase intermediria das hemcias entre a perda do
ncleo pelos eritroblastos, ainda na MO (permanecendo ainda ali por trs dias) e um dia no
sangue circulante, onde os ribossomos remanescentes vo diminuindo, at o estgio de
hemcias maduras. Heilmeyer classificou os retculcitos em quatro grupos I a IV, de acordo com
a agregao do corante. Normalmente, cerca de 1% das hemcias no sangue so reticulcitos,
principalmente dos tipos III e IV com menos precipitados. Nos processos de aumento da
eritropoese, a porcentagem de reticulcitos no sangue aumenta e surgem os reticulcitos dos
tipos I e II com mais precipitados, chamados de reticulcitos desviados, associados com a
presena de macrcitos policromticos e eventuais eritroblastos.
MTODO
Colorao Supra Vital
AMOSTRA
Sangue total em EDTA 10%
MATERIAL
- Tubo de hemlise
- Lminas para microscopia
- Pipetas de Pasteur
- Microscpio
- leo de imerso
REAGENTE
* Soluo Corante de Azul de Cresil Brilhante
Azul de cresil brilhante .................................1g
Citrato de sdio ............................................... 0,4g
Cloreto de sdio ............................................... 0,85g
gua destilada q.s.p. ....................................... 100 ml
Filtrar antes do uso. Renovar a soluo a cada 3 a 6 meses.
PROCEDIMENTO TCNICO
- Colocar 3 gotas da soluo corante num tubo de hemlise
- Adicionar 6 a 9 gotas de sangue,dependendo do hematcrito do paciente
- Agitar suavemente e incubar por 1 hora em banho-Maria a 370C
- Homogeneizar suavemente e fazer os esfregaos
- Secar os esfregaos e proceder a contagem com objetiva de imerso. Se preferir, corar os
esfregaos com o corante de Leishman ou Giemsa
- Contar 1.000 hemcias, anotando o nmero de reticulcitos encontrados
- Expressar o resultado em porcentagem.
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CALCULOS
O nmero de reticulcitos no sangue pode ser relatado de modo relativo:
% de reticulcitos= No de reticulcitos / No de hemcias X 100
VALORES DE REFERNCIA
Adultos - 0,5 a 1,5% (2,0%)
Recm nascido at 10%
Ou preferencialmente de modo absoluto:
Reticulcitos/
l = % de reticulcitos/100 x No de hemcias
VALORES DE REFERNCIA
Adultos 25.000 a 85.000/ mm3
Recm nascido 100.000 a 300.000 mm3
Clinicamente, pode ser de interesse a correo dos reticulcitos:
1) Para a anemia:
Reticulcitos corrigidos (%) = % de reticulcitos x hematcrito do paciente/hematcrito normal
2) Para os reticulcitos desviados:
ndice reticulocitrio (IR) = reticulcitos corrigidos (%)/ dias em circulao
OBS os dias em circulao so estimados em relao ao hematcrito:
Hematcrito
Dias
45%
1 dia
35%
1 dia e
25%
2 dias
15%
2 dia e
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COAGULOGRAMA
PROCEDIMENTO
- Fazer anti-sepsia do lbulo da orelha com lcool 70%;
- Fazer uma inciso no lbulo da orelha com a lanceta suficientemente funda para que o sangue
flua sem presso;
- Quando aparecer a primeira gota de sangue disparar o cronmetro;
- A cada 30 segundos remover o sangue com auxlio de um papel de filtro sem tocar na leso;
- Quando o sangue deixar de manchar o papel, parar o cronmetro;
- Anotar o tempo.
VALORES DE REFERNCIA
Normal 1 a 3 minutos
OBSERVAES
O TS um teste bastante importante porque mede a hemostasia primria "in vivo" e por
isto deve ser feito com bastante rigor tcnico.
Os profissionais que realizam o TS devem ser treinados e reciclados periodicamente.
O TS particularmente sensvel as alteraes plaquetrias tanto quantitativas como
qualitativas.
O TS especfico para a hemostasia primria, no mede, portanto, nenhuma via da
coagulao.
O TS importante no coagulograma seja com finalidade pr-operatria ou diagnstica,
quando realizado do modo correto.
O tempo de sangria avalia a interao da plaqueta com a parede do vaso sanguneo e a
formao subsequente do cogulo hemosttico de modo independente da cascata da
coagulao.
Existe uma relao quase linear entre a contagem de plaquetas e o tempo de sangria.
Utiliza-se como teste de rastreio para a Doena de vW e para Disfunes Plaquetrias
(congnitas ou adquiridas).
No discrimina defeitos vasculares de trombocitopenia ou de disfuno plaquetria.
No se correlaciona com a perda de sangue durante a cirurgia nem com a necessidade de
transfuses.
CUIDADOS
Quando no ocorre retrao do cogulo nas duas horas, deve-se deixar o tubo em banhomaria at 24 horas, para ento liberar o resultado de cogulo no retrtil (irretrtil).
Deve-se ter a certeza de que os tubos utilizados neste teste esto limpos.
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Realiza-se o teste em duplicata para evitar erros que podem ocorrer em funo de
resduos de material de limpeza imperceptveis que podem afetar o resultado. Pode
acontecer de a retrao ser total em um tubo e nula em outro, o que demonstra que no
tubo em que no houve retrao havia algum interferente. Mesmo assim se a dvida
persistir, deve-se repetir a coleta e realizar novamente o teste.
AMOSTRA
- A agulha deve penetrar diretamente a veia e na primeira tentativa. No se deve realizar os
testes em amostra cuja puno foi difcil (traumtica);
- Misturar cuidadosamente o sangue por inverso (juntamente com o citrato de sdio), centrifugar
o mais rpido possvel por 10 minutos a 3.000 rpm. Separar o plasma e deixar a temperatura de
20-25 C at a realizao do teste.
MATERIAIS
- Pipeta de Pasteur plstica;
- Tubos de hemlise de plstico;
- Crnometro;
- Pipetas de preciso de 100 e 200l;
- Cubetas plsticas para coagulmetro Quick Timer Drake;
- Coagulmetro Quick Timer- Drake.
REAGENTES
- Tromboplastina clcica liofilizada: deve ser diluda com gua deionizada e incubada segundo as
recomendaes da bula do reagente;
- Plasmas controle normal e anormal ou pool de plasmas coletados no prprio laboratrio e
imediatamente centrifugados e aliquotados em amostras que devem ser congeladas, tendo
validade de 30 dias.
PROCEDIMENTOS
- Uma vez ligado o Quick Timer entra em aquecimento, permanecendo assim at que o bloco
atinja temperatura mnima de trabalho (36,2 C). Com exceo da tecla RES, que permite
consultar resultados anteriores, todas as outras ficaro desabilitadas durante o aquecimento.
Aps o aquecimento pressione a tecla test e aparecer no visor o menu de testes. Selecione o
TP.
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37C/2
Plasma (100 l)
Tromboplastina
200 l
clcica
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REAGENTES
- Soluo tamponada de cefalina e ativador do cido elgico. Conservar a 2-8 C at a data do
vencimento indicada na embalagem;
- Cloreto de clcio 0,025 mol/L;
- Quando o cloreto de clcio no acompanha o Kit de reagentes para a realizao do TTPa, o
cloreto de clcio 0,025 mol/L pode ser praparado no laboratrio;
- Plasmas controle normal e anormal ou pool de plasmas coletados no prprio laboratrio e
imediatamente centrifugados e aliquotados em amostras que devem ser congeladas, tendo
validade de 30 dias.
PROCEDIMENTOS
- Uma vez ligado o Quick Timer entra em aquecimento, permanecendo assim at que o bloco
atinja temperatura mnima de trabalho (36,2 C). Com exceo da tecla RES, que permite
consultar resultados anteriores, todas as outras ficaro desabilitadas durante o aquecimento.
Aps o aquecimento pressione a tecla test e aparecer no visor o menu de testes. Selecione o
TTPa.
- Coloque 100l de plasma, do controle e de cada paciente respectivamente, e 100l de cefalina
ativada em uma cubeta plstica de leitura contendo uma barrinha metlica. Incube por
exatamente 3 min cada amostra nos orifcios existentes no bloco aquecido do Quick timer.
Coloque ento a primeira amostra no poo de leitura e adicione 100l de cloreto de clcio
0,025mol/L previamente aquecido a 37 C. Ao final da reao aparecer no visor o resultado em
segundo.
- Os resultados alterados devero ser repetidos para confirmao. Se houver alguma dvida em
relao ao resultado ou incoerncia com relao ao uso de medicamentos pelo paciente, deve-se
solicitar uma nova coleta do material.
+
Plasma (100 l)
3/37C
Cefalina-slica micronizada
100 l
CaCl2
100 l
Referncias Bibliogrficas
1. OLIVEIRA, R.A.G. Hemograma: Como Fazer e Interpretar. 1a ed. So Paulo: LMP, 2007.
2. ROSENFELD, R. Fundamentos do Hemograma do laboratrio Clnica. 1a ed Rio de Janeiro :
Ganabara Koogar, 2007
3 Recomendaes da Sociedade Brasileira de Patologia Clnica/Medicina Laboratorial para coleta de
sangue venoso - (2 edio) Editora Manole Ltda, 2009.
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