Practicas de Laboratorio Bioquimica

UNIVERSIDAD MARIANA
LABORATORIO DE CIENCIAS BASICAS
PRACTICAS DE LABORATORIO
BIOQUIMICA
ELABORADO POR:
QUIMICA DIANA ANGELICA LOPEZ ZARAMA
SAN JUAN DE PASTO

2008
PRACTICAS DE BIOQUIMICA
TERCER SEMESTRE DE ING. AMBIENTAL
1. pH EN SOLUCIONES ACIDAS Y BASICAS

OBJETIVO:
Medir el pH de diferentes sustancias de origen orgnico e inorgnico.
FUNDAMENTO TEORICO:
Las disoluciones cidas y bsicas son frecuentes en la naturaleza; muchas de ellas son
fluidos del organismo humano y otras son productos de uso diario. Los fluidos del organismo
difieren tanto en su carcter cido o bsico como en su grado de acidez. El del estmago es
el ms cido, manteniendo su pH en un intervalo bastante reducido (1.0 3.0). El plasma
sanguneo es ligeramente bsico y su intervalo de pH es muy limitado. Si el pH del plasma
vara sobrepasando este intervalo, la capacidad de la sangre para transportar oxgeno se
reduce. Por ello es importante para la vida humana que las modificaciones en el pH de la
sangre estn siempre dentro de un intervalo pequeo. En contraste con el plasma
sanguneo, la orina presenta un amplio intervalo de pH, pudiendo ser cida, bsica o neutra.
Esto es debido a que muchas sustancias cidas, bsicas son eliminadas por el organismo a
travs de la orina para mantener el adecuado pH de la sangre.
El mtodo ms frecuentemente utilizado para medir el pH en el laboratorio es el uso de un
equipo denominado pH-metro o potencimetro. El pH de una solucin se determina
sumergiendo los electrodos del equipo en la misma, y se lee directamente en la pantalla
digital del equipo.
La acidez de una disolucin se puede determinar tambin por medio de un Indicador; que es
un compuesto orgnico que cambia de color dentro de un determinado intervalo de pH. Un
ejemplo muy conocido es el tornasol, cuyo color es rojo a valores de pH inferiores a 5, y azul
a valores superiores a 8.5. De los dos mtodos posibles de medir el pH de una disolucin, el
pH-metro es la ms precisa; los indicadores se utilizan fundamentalmente en valoraciones
cido base.
En bioqumica la mayora de sustancias cidas y bsicas son cidos dbiles o bases dbiles,
que solo se disocian parcialmente. En una solucin acuosa de un cido dbil existe un
equilibrio, que puede medirse, entre el cido y su base conjugada, que es la sustancia que
puede aceptar un protn y formar de nuevo el cido; como lo indica la siguiente ecuacin:
HA + H2O
H3O+ +
Acido dbil
A-
Base conjugada
Estas reacciones tambin se pueden escribir como:

HA
H+ + A-
(1)
La constante de equilibrio de la disociacin de un cido dbil o Constante de disociacin,

se define como:
Ka = [H+][A-]
[HA]
(2)
Si despejamos [H+] obtenemos:

[H+] = Ka [HA] (3)
[A-]
Tomando el logaritmo de ambos trminos:
log [H+] = log Ka + log [HA] (4)
[A-]
Multiplicando cada lado por 1:
- log [H+] = - log Ka + log [A-] (5)
[HA]
Por definicin: - log [H+] se llama pH, y - log Ka se llama pKa; por lo tanto la ecuacin
finalmente se vuelve:
pH =
pKa +
log [A-]
(6)
[HA]
Esta es la ecuacin de Henderson Hasselblach, que relaciona el pH de una disolucin

con la proporcin base conjugada/cido sin disociar. La utilidad de esta ecuacin puede
observarse en su aplicacin a las titulaciones: muestra exactamente como cambia el pH
cuando se aade la base una disolucin cida o viceversa.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Materiales:
1 Gradilla + Tubos de ensayo
3 Beaker 100 ml
2 Pipetas 10 ml
pH-Metro
Lancetas
1 Limn. Tomate, vinagre, sangre, orina, huevo (Deben traer los estudiantes).
Reactivos:
Acido Clorhdrico 0.01 M (HCl)
Hidrxido de Sodio 0.01 M (NaOH)
Agua destilada
PROCEDIMIENTO:
PARTE I: pH de soluciones orgnicas
1. Marque los tubos de ensayo del 1 al 9.
2. En los tubos del 1 al 4 prepare una serie de diluciones de HCl: Tubo 1, vierta 10 ml de
HCl 0.01 M, traslade al Tubo 2 un mililitro de esta solucin y diluya agregando 9 ml de
agua destilada, mezcle. Vierta 1 ml del Tubo 2 al Tubo 3 y adicione 9 ml de agua
destilada; haga lo mismo para el Tubo 4. Mida el pH de cada solucin.
3. En los tubos del 5 al 8 prepare una serie de diluciones de NaOH: Tubo 5 vierta 10 ml de
NaOH 0.01 m y diluya para los siguientes tubos. Mida el pH de cada solucin.
4. En el Tubo 9 mezcle 1 ml de HCl del Tubo 2 con 1 ml de NaOH del Tubo 5. Determine el
pH de esta solucin.
5. Determine el pH del agua destilada.
PARTE II: pH DE SOLUCIONES ORGANICAS
1. Haga un zumo de cada uno de los materiales: limn, tomate, huevo. Mida el pH de estas
soluciones.
2. Vierta 1 ml de cada una de estas sustancias en tubos de ensayo: vinagre, leche, orina.
Mida el pH de estas sustancias.
3. Tome una gota de sangre con una lanceta y mida su pH.
ANALISIS DE RESULTADOS:
PARTE I:
1. Defina: pH, cido y base.
2. Que compuesto empleado en esta parte del laboratorio es cido, cul base, cul neutro?
3. Elabore un cuadro con el nmero de los tubos, las concentraciones de HCl y NaOH, y el
valor de pH obtenido para cada solucin.
4. Grafique los resultados obtenidos.
5. Cmo cambia el pH a medida que el cido se diluye?
6. Cmo cambia el pH a medida que la base se diluye?
7. Qu ocurre en el tubo 9, porqu?

PARTE II:
1. Elabore un cuadro con el nombre de la sustancia y su pH.
2. Haga un listado de las sustancias cidas y bsicas segn su resultado.
3. Cul es el cido del limn? A que concentracin del HCl se parece?
BIBLIOGRAFIA
BOHINSKI, Robert C. Bioqumica. Addison Wesley Iberoamericana S.A. Quinta Edicin.

Mxico. 1998.
LUQUE, Ernesto J. Prcticas de bioqumica. Universidad de Nario. Departamento de

Qumica. Universidad de Nario. 1990.
RENDINA, George. Tcnicas de bioqumica aplicada. Nueva Editorial Interamericana S.A.

Mxico. 1974.
WERNER, Rudolf. Fundamentos de Bioqumica Moderna. Editorial Acribia S.A. Espaa.

1988.
2. TITULACIN POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS

OBJETIVOS:
Encontrar los valores de pK y el punto isolectrico de un determinado aminocido por medio
de una titulacin potenciomtrica.
FUNDAMENTO TEORICO:
Los aminocidos, debido a que disponen en su molcula de un grupo amino y un grupo
carboxilo, tienen un marcado carcter anftero; es decir se comportan simultneamente
como cidos y como bases, que comunican tambin a los polipptidos y protenas de los
cuales forman parte. Se puede esquematizar de la siguiente manera el comportamiento de
un aminocido frente a una base y a un cido:
NH2
NH2
R C COOH
H
NH3
OH
R C COO
R C COO + H2O
Forma Bsica
H
+
NH3
R C COOH
Forma No
Disociada
Ion Dipolar
Zwiterion
Forma cida
H
Un aminocido tiene, entonces, por lo menos dos constantes de equilibrio: K 1 y K2; que
representan respectivamente las constantes de disociacin del grupo carboxilo y del grupo
amino. A su logaritmo negativo, se le denomina pK: pK 1 = -log K1 y pK2 = -log K2. Pueden
existir ms valores de pK ya que en el aminocido puede haber ms de un grupo carboxilo
(COOH) o ms de un grupo amino (NH2) u otros grupos disociables (por ejemplo, el grupo
SH en la cistena). Estos valores de pK se pueden establecer mediante una curva de
titulacin.
La curva posee un punto en el cual el aminocido se comporta como una sal neutra. Para
este valor de pH la carga elctrica del aminocido es nula. Este punto se denomina Punto
Isoelctrico y se simboliza pI.
pI = (pK1 + pK2)
2
Reactivos:
Solucin 0,05 M de determinado aminocido asignado por el profesor
cido clorhdrico 0,1 N (HCl)
Hidrxido de sodio 0,1 N (NaOH)
Materiales:
pH metro
1 Soporte para bureta
2 Buretas 50 ml
1 Pinza para bureta

2 Pipetas 10 ml
2 Beakers 250 ml
PROCEDIMIENTO:
1. En un beaker coloque 20 ml de la solucin de aminocido y determine su pH. Llene la
bureta con HCl 0.1 N y adicione 0.5 ml, agite y mida el pH. Adicione otros 0.5 ml del mismo
cido y vuelva a medir el pH. Contine el mismo proceso hasta alcanzar un pH de 1.5.
2. En otro beaker coloque 20 ml de la solucin de aminocidos, llene la bureta con el NaOH
0.1N y adicione 0.5 ml, agite y lea el pH. Contine adicionando hidrxido hasta que el pH
alcance un valor de 11.
RESULTADOS:
1. En una sola grfica, en papel milimetrado, represente los resultados de la titulacin del
aminocido. Coloque los valores de pH en las ordenadas y los mili equivalentes de cido
clorhdrico y de hidrxido de sodio en las abscisas.
2. Con base en la grfica halle los valores de pK del aminocido utilizado y su punto
isoelctrico.
3. Compare los valores obtenidos con lo que se encuentran en literatura. En caso de que los
dos valores difieran en ms de 0.5 unidades explique la causa de la diferencia.
NOTA: Al final de la prctica entregue al profesor una tabla de datos donde figuren los ml de
HCl y de NaOH adicionados y el pH correspondiente en cada caso.
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

1988.
3. REACCIONES DE CARACTERIZACIN DE AMINOCIDOS

OBJETIVOS:
Comprobar la presencia de determinados aminocidos, en forma libre o haciendo parte de
las protenas, con base en las reacciones caractersticas de los grupos funcionales
presentes.
FUNDAMENTO TEORICO:
Las reacciones de los aminocidos son las que en general, corresponden a compuestos que
contienen grupos amino y carboxilo. Adems, todo grupo adicional que pudiera estar
presente dar su propio conjunto de reacciones.
Las cadenas laterales de los aminocidos poseen grupos funcionales que experimentan
importantes reacciones. As, el grupo Tiol (-SH) de la cistena se oxida fcilmente por accin
del oxgeno del aire o de otros agentes oxidantes suaves dando cistina, en la que existe un
enlace disulfuro (S S) entre dos molculas de cistena:
CO2 -
CO2 -
CO2 -
Oxidacin
+
NH3 - C H
CH2SH
L- Cistena
Suave
NH3 C H
NH3 C -H
CH2 S S CH2
Cistina
Otra reaccin importante y caracterstica del grupo tiol de la cistena es la que tiene lugar con
ciertos cationes metlicos, como Mercurio (Hg +) y Plomo (Pb+2) para formar mercptidas. La
sal formada es insoluble en medio acuoso. En los seres vivos, esta reaccin rompe el enlace
disulfuro de las protenas y provoca su precipitacin. Por otra parte, estos cationes metlicos
tambin reaccionan con el grupo carbxilo dando sales insolubles. Estas reacciones son las
responsables de la toxicidad de estos cationes metlicos par la mayora de los seres vivos.
La Ninhidrina es un agente oxidante fuerte que reacciona con todos los -aminocidos a un
pH entre 4 y 8, para dar un compuesto de color prpura. La reaccin es muy sensible por lo
cual se utiliza en cromatografa.
Las sustancias que, como los aminocidos tiene grupos amino libres, reaccionan con el cido
nitroso para producir nitrgeno en forma de pequeas burbujas. Esta reaccin permite
distinguir a los aminocidos libres de las protenas ya que estas slo reaccionan
parcialmente y en soluciones muy concentradas.
La reaccin Xantoproteica es caracterstica de los aminocidos que poseen anillos

bencnicos los cuales, cuando se calientan con cido ntrico concentrado forman
nitroderivados de color amarillo.
Los compuestos que poseen grupos fenlicos reaccionan con el reactivo de Millon formando
compuestos rojos; esta reaccin sirve para identificar a la tirosina o sus derivados.
El reactivo de Folin-Ciocalteau se emplea mucho para la determinacin de tirosina en
protenas. Como la proporcin de este aminocido es bastante uniforme en distintas
protena, el mtodo es til para mezclas complejas. Se basa en la reaccin del ncleo
hidroxifenlico con un reactivo fosfotngstico fosfomolbdico en medio alcalino.
La prueba de Hopkins-Cole, se basa en la reaccin del anillo indlico con el cido glioxlico
en medio fuertemente cido y deshidratante. Tambin se puede utilizar cido actico glacial
que se haya expuesto a la luz, el cual contiene cido glioxlico como impureza, en cantidad
suficiente para que la reaccin se manifieste.
La reaccin de Acree-Rosenheim se basa en la condensacin en medio cido del anillo
indlico con formaldehido para dar un compuesto amarillo verdoso de intensa fluorescencia.
Los derivados del triptfano se caracterizan por ser fluorescentes, propiedad que se utiliza
para la identificacin del triptfano libre o en las protenas.
La prueba de Koop, tiene en cuenta la adicin de bromo a la molcula de histidina, en la cual
se incorporan dos moles de bromo por cada una de aminocido; en presencia de amoniaco
se produce un color azul violeta. Esta reaccin no se da cuando el aminocido est formando
parte de un pptido y se puede modificar por la presencia de cantidades importantes de
glicina, triptfano o tirosina, por lo cual en su determinacin se deben tener en cuenta estas
posibles fuentes de interferencia.
La metionina, por calentamiento en medio alcalino, en presencia de ion nitroprusiato, genera
un compuesto que adquiere un color rojo intenso al acidificar. Se aade glicina al medio, en
cantidad importante, para evitar la interferencia de la histidna, que impide que se produzca la
reaccin.
Reactivos:
Ninhidrina al 0.1 % en acetona
Reactivo de Biuret
cido clorhdrico concentrado
Nitrito de sodio al 5%
cido ntrico concentrado
Hidrxido de sodio al 40 %
Reactivo de Milln
Reactivo alcalino de Folin Ciocalteau
Reactivo de Folin Ciocalteau diluido 1:2 en Agua
Formaldehdo al 40 %
Bromo al 2.8 % en cido actico
Carbonato de amonio al 10 %
Acetato de plomo al 10 %
Hidrxido de Sodio 20%
Nitroprusiato de sodio 5%
Hielo
Acido actico glacial
Acido sulfrico concentrado

Soluciones al 0.1 % de diferentes aminocidos y protenas
Materiales:
2 Beakers 250 ml
1 Gradilla + Tubos de Ensayo
1 Pinza para tubos de ensayo
Plancha de calentamiento
1 Termmetro
PROCEDIMIENTO:
1. Reaccin de la Ninhidrina: Mezcle 1 ml de la solucin experimental (casena,
aminocidos: glicina, lisina y metionina) con 1 ml de Ninhidrina y caliente a ebullicin en bao
mara, durante 10 minutos. La solucin debe adquirir un color prpura.
2. Reaccin de Biuret: A 1 ml de la solucin experimental (casena, glicina) se le aade 2 ml
del Reactivo de Biuret; se mezcla y se observa el cambio de color. La aparicin de una
coloracin rojiza violeta indica la presencia de enlaces peptdicos.
3. Prueba del cido nitroso: A 1 ml de solucin experimental (lisina, arginina, casena y
gelatina) aada 0.5 ml de cido clorhdrico concentrado y luego, rpidamente 1 ml de nitrito
de sodio al 5%. La reaccin es positiva, indicando la presencia de grupos amino libres, al
desprenderse nitrgeno en forma de pequeas burbujas. Esta reaccin, tambin la dan
parcialmente las soluciones de protena en que hay grupos amino libres, generalmente el
grupo E -amino de Ia lisina, por lo cual puede observarse, por ejemplo, en una solucin muy
concentrada de gelatina.
4. Reaccin xantoproteica: a 1 ml de solucin experimental (tirosina, triptfano, fenilalanina,
cistena y casena) adicione 1 ml de cido ntrico concentrado; mezcle bien y caliente los
tubos 5 minutos en bao mara. La reaccin es positiva, sealando la presencia de
aminocidos aromticos, al observarse un color amarillo intenso que indica la nitracin de los
anillos aromticos. Si se aade gota a gota, refrigerando el tubo en un bao de agua,
hidrxido de sodio al 40% el color vira a naranja fuerte, al disolverse los nitrobencenos en un
medio fuertemente alcalino.
5. Reaccin de Milln: A 1 ml de solucin experimental (tirosina, fenilalanina y gelatina)
agregue 5 gotas del reactivo de Milln y caliente en un bao mara. Deje enfriar a
temperatura ambiente y agregue 5 gotas de solucin de nitrito de sodio al 5%; la aparicin de
un color rojo ladrillo indica un resultado positivo.
6. Prueba de Folin - Ciocalteau: A 1 ml de solucin experimental (tirosina, fenilalanina y
gelatina) adicionar 2 ml del reactivo alcalino de Folin - Ciocalteau, agitar los tubos y dejar a
temperatura ambiente durante 5 minutos, luego aadir 1 ml del reactivo de Folin - Ciocalteau
diluido. A continuacin se dejan los tubos durante 20 minutos a 35C, en un bao de agua. La
reaccin es positiva para fenoles (como la tirosina) al aparecer una coloracin azul.
7. Prueba de Hopkins - Col: a 1 ml de solucin experimental (triptfano, glicina, casena)

aada 2 ml de cido actico glacial y luego haga resbalar por las paredes del tubo 1 ml de
cido sulfrico concentrado, de modo que se formen dos capas. La reaccin es positiva,
indicando la presencia de triptfano u otra sustancia con el anillo del indol, al formarse un
anillo de color violeta en la interfase entre ambos lquidos, Agitando suavemente, el color se
difunde por todo el lquido.
8. Prueba de Acre Rosenheim: a 1 ml de solucin experimental (triptfano, fenilalanina,
gelatina) adicionar 0.5 ml de formaldehido al 40% y 1 ml de cido clorhdrico concentrado; se
agita bien y se deja el tubo durante 5 minutos en bao mara. La reaccin es positiva,
indicando la presencia de sustancias con el anillo del indol, como el triptfano, al aparecer
una coloracin amarillo verdosa transparente.
9. Reaccin de Koop: a 1 ml de solucin experimental (histidina, arginina, casena) se le
aade gota a gota 0.5 ml de bromo en cido actico, despus de 10 minutos se adiciona 1 ml
de carbonato de amonio al 10%, se agita suavemente y se observa si se colorea; sino, se
calienta por 5 minutos en bao mara. La reaccin es positiva Indicando la presencia de
histidina al aparecer un color azul violeta.
10. Prueba con acetato de plomo: A 1 ml de solucin experimental (casena, gelatina,
glicina, metionina, cistena y cistina) se aade 1 ml de hidrxido de sodio al 40 % y se
calienta en bao mara durante diez minutos. Se enfran los tubos en un bao de hielo, se
aaden 0.5 ml de acetato de plomo al 10%, se agita bien y se observa el oscurecimiento
progresivo de la solucin.
11. Prueba con nitroprusiato: A 1 ml de solucin experimental (triptfano, metionina y
cistena) aada 1 ml de hidrxido de sodio al 20%, 0.5 ml de glicina al 0.1% y 0.5 ml de
nitroprusiato de sodio al 5%; caliente en bao mara durante 5 minutos. La aparicin de un
color rojo intenso es prueba positiva para metionina.
La histidina inhibe la reaccin, pero esta inhibicin es eliminada por la glicina. Repita la
prueba anterior con los mismos aminocidos pero adicionando inicialmente 1 ml de histidina
a cada uno y omitiendo la adicin de glicina. Antes de botar el residuo de los tubos de ensayo
a la caera alcalinice cada uno con 2 o 3 ml de hidrxido de sodio al 20%.
RESULTADOS:
1. Anote sus resultados en una tabla indicando cuales pruebas fueron positivas y cuales
negativas. Explique las razones de estos resultados.
2. En los casos en los cuales el resultado de las pruebas fueron negativos, explique la
causa.
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

1988.
4. DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJELDAHL

OBJETIVOS:
Determinar el contenido de nitrgeno y el contenido de protena, en porcentaje, en una
muestra vegetal o animal, mediante el mtodo de Kjeldahl.
FUNDAMENTO TEORICO:
Las protenas constituyen un grupo de biomolculas muy importantes, puesto que son las
responsables de muchas funciones biolgicas: como la formacin de tejidos y la actividad
enzimtica. Conocer los contenidos de protenas presentes en los tejidos, ha sido objeto de
varios estudios y en consecuencia se han desarrollado muchas tcnicas de anlisis. Existen
varios mtodos mediante los cuales se puede determinar el contenido de protena bruta,
protena real y nitrgeno no proteico en muestras tanto de origen vegetal como de origen
animal.
MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS
Estos mtodos son particularmente tiles en la valoracin del contenido de protena real,
puesto que se basan en la formacin de complejos coloreados entre algunos aminocidos
proteicos el enlace peptdico, con reactivos especficos. Dentro de los mtodos clsicos
est el que emplea el reactivo de Biuret, el cual se fundamenta en la formacin de un
complejo coordinado entre los iones cpricos del reactivo y el enlace peptdico de la protena,
reaccin que transcurre en medio alcalino. Tambin es de uso frecuente el mtodo que
emplea la espectrofotometra con base en la reactivo de Folin. En los dos casos anteriores,
se elaboran curvas de calibracin con una protena patrn, normalmente la albmina de
huevo o la albmina bovina estabilizada estndar, y en las mismas condiciones de reaccin
se hace el desarrollo de la coloracin para la muestra que se est analizando.
MTODOS VOLUMTRICOS
Dentro de estos mtodos est el de Kjeldahl, el cual se fundamenta en la conversin del
nitrgeno total presente en la muestra a sales de amonio que son posteriormente valoradas
por volumetra cido base.
El mtodo de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son: digestin de la muestra,
destilacin con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoracin cido base de este
amoniaco.
En la primera etapa, el hidrgeno y el oxgeno proteico, son oxidados hasta dixido de
carbono y agua, mientras que el nitrgeno es convertido en sulfato de amonio, por la accin
de un agente oxidante en medio cido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado
diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador el agente oxidante, pero en todos
los casos, el objetivo final de la etapa de digestin es el de convertir el nitrgeno proteico en
sulfato de amonio.
En la etapa siguiente, mediante la accin de una base fuerte, generalmente hidrxido de

sodio al 40%, se libera el amonaco de la sal de amonio. Cuando la valoracin se va a
efectuar por retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un
volumen exactamente medido de un cido estndar. Una variante utilizada comnmente,
consiste en recibir el amoniaco (hidrxido de amonio) sobre cido brico aproximadamente al
4% de tal manera que se forma borato de amonio, el cual se titula directamente.
En la etapa final, se hace la valoracin de acuerdo con el proceso empleado para la
recoleccin. As por ejemplo, si el hidrxido de amonio, se recibi sobre un volumen
exactamente medido de un cido estndar, la titulacin se hace con una base valorada y en
presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se determina el cido que no
reaccion con el hidrxido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidrxido de
amonio producido.
En la variante de Steyemark, el hidrxido de amonio se recoge sobre cido brico no
valorado y luego se titula directamente el borato de amonio que se forma, con un cido
estndar.
Reacciones mtodo Kjeldahl Variante Steyemark
Digestin: Protena(s) + H2SO4(c) + Catalizador(s)
CO2(g) + H2O(g)+ NH4HSO4(ac)
Liberacin de NH3: NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac)

Arrastre con vapor: NH3(g) + H2O(g)
NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)
NH4OH(ac)
Recoleccin: NH4OH(ac) + H3BO4(ac)
NH4H2BO4 + H2O
Titulacin: NH4H2BO4(ac) + HCI(ac)
NH4CI(ac) + H3BO4(ac)
El clculo del porcentaje de protena en una muestra no es totalmente exacto pero si

bastante aproximado. Se basa en el hecho de que en una muestra animal o vegetal casi todo
el nitrgeno presente se encuentra formando parte de las protenas y dentro de estas el N 2
constituye aproximadamente el 16% en peso.
Protena/Nitrgeno = 100%/16% = 6.25
O sea que multiplicando la cantidad de nitrgeno obtenida por 6.25 se tiene la cantidad
aproximada de protena presente en una muestra dada.
Reactivos:
Mezcla catalizadora
Indicador de Tashiro
cido sulfrico concentrado
HCl 0.1 N
Reactivo de Hidrxido de sodio Tiosulfato de sodio
Indicador de cido Brico
Material Biolgico (harina de frjol, maz, soya, leche, clara de huevo o cualquier otro material
biolgico)
Materiales:
1 Baln para Kjeldahl
1 Pipeta 10 ml
1 Pera
1 Beaker 50 ml
1 Erlenmeyer 125 ml
1 Bureta 50 ml
1 Pinza para bureta
1 Soporte
Balanza Analtica
Equipo de digestin y destilacin Kjeldahl
PROCEDIMIENTO:
Digestin:
En un baln Kjeldahl, limpio y seco, agregue 0.5 g exactamente pesados de material
biolgico slido o 1 ml si el material es liquido; adicione 10 ml de reactivo de digestin.
Procure que el reactivo llegue al fondo del baln y no quede adherido a las paredes. De no
ser as aydelo a bajar con una pequea cantidad de agua destilada.
Coloque el baln en el digestor y caliente en resistencia media durante 20 minutos; despus
de transcurrido este tiempo aumente la calefaccin al mximo durante 30 minutos hasta que
el contenido adquiera un tono verde amarillento. Al cabo de este tiempo apague el digestor y
deje enfriar el baln.
Baln
con
muestra,
mezcla
catalizadora
y
cido
Destilacin:
Encienda el microdestilador con el fin de que el agua que va a generar el calentamiento se
encuentre en ebullicin en el momento de adicionar la muestra.
Lave el baln que contiene la muestra con 10 ml de agua destilada con el fin de solubilizarla
y llene con esta solucin la parte superior del equipo de destilacin, asegurndose que la
llave de paso se encuentre abierta. Vuelva a enjuagar el baln con 2 porciones de 10 ml de
agua destilada y llene la muestra en el equipo. A continuacin agregue 10 ml de reactivo de
Hidrxido de sodio Tiosulfato de sodio; note que la muestra se oscurece. En el otro extremo
del destilador coloque un beaker pequeo con 10 ml de indicador de cido Brico, la punta
del refrigerante debe quedar sumergida en la solucin indicadora. Sobre esta solucin se
recogen de 30 a 40 ml de destilado hasta que la solucin cambie de violeta a azul o verde
esmeralda. Despus de la destilacin de la muestra se debe hacer un lavado del equipo con
agua destilada.
Deposito
de
Baln con
agua
Beaker con
Indicador
de
cido
Titulacin:
Transfiera el destilado a un erlenmeyer y titule con el Acido Clorhdrico 0.1 N hasta obtener
una coloracin similar a la del cido brico original.
Blanco:
Simultneamente con las muestras se debe realizar todo el proceso anterior con un blanco,
en el cual la muestra biolgica se reemplaza por una cantidad equivalente de agua destilada.
RESULTADOS:
Determine el porcentaje de Nitrgeno y el porcentaje de Protena en la muestra biolgica
utilizada. Compare estos resultados con los que se encuentran en la literatura.
El % de Nitrgeno presente en la muestra se puede determinar utilizando la siguiente
frmula:
% N = 1400 (Vm Vb) N
Pm
Donde: Vm = Volumen de HCl en ml gastado en la titulacin de la muestra

Vb = Volumen de HCl en ml gastado en la titulacin del blanco
N = Normalidad del HCl
Pm = Peso de la muestra en mg
El % de Protena se lo puede determinar mediante la siguiente relacin:
% Protena = %Nitrgeno x 6.25
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

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5. INFLUENCIA DE DIVERSOS FACTORES EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

OBJETIVOS:
Observar el efecto de las variaciones de temperatura, pH, concentracin de iones metlicos y
enzima sobre una reaccin enzimtica.
FUNDAMENTO TEORICO:
Las enzimas son protenas producidas por el organismo, que catalizan reacciones biolgicas
especficas. Estos compuestos controlan las distintas reacciones que se producen en la
clula, y tambin controlan qu reacciones tienen lugar y a qu velocidad transcurren.
Las enzimas son sensibles a las variaciones de pH del medio; la desnaturalizacin o rotura
de la estructura tridimensional de una protena, supone para las enzimas la prdida de su
actividad cataltica. Todas las enzimas poseen su mxima actividad en un pequeo intervalo
de pH cuyo valor medio se denomina pH ptimo.
La actividad de las enzimas puede ser controlada tambin limitando la cantidad de
compuesto en la clula que forma el complejo enzima sustrato. As, aumentando o
disminuyendo tanto la cantidad de sustrato como la de la enzima puede controlarse la
velocidad de las reacciones qumicas que tienen lugar en la clula.
La presencia de iones de metales pesados tambin afecta la actividad de las enzimas; por
ejemplo los iones de Plomo (Pb+2) y Mercurio (Hg+2) reaccionan con los grupos Tiol y
Carboxilato de las protenas y enzimas destruyendo su capacidad para mantener su
estructura; estos iones se conocen entonces como Inhibidores de la actividad enzimtica.
La accin de un inhibidor implica la fijacin de ste a alguna forma de la enzima, lo que da
como resultado una prdida total o parcial de la actividad de la enzima para transformar
sustratos en productos. En esta prctica se va a ensayar la accin de algunos de estos
factores sobre la alfa-amilasa, una enzima que en el hombre se encuentra presente en la
saliva y en el pncreas.
Reactivos:
Almidn al 1% en NaCl 0.005M
Cloruro mercrico al 1%
Solucin amortiguadora de pH 3
Pepsina 0.1 %
Reactivo de lugol
Nitrato de plomo al 1%
Hielo
Materiales:
1 Beaker 100 ml
2 Beakers 250 ml
1 Embudo de vidrio
1 Aro metlico
1 Soporte
1 Gradilla + Tubos + Pinza
1 Termmetro
1 Pipeta 5 ml
1 Varilla de vidrio
1 Gradilla inmunolgica
Algodn
Plancha de calentamiento
PROCEDIMIENTO:
1. Preparacin de la amilasa salival: Se enjuaga la boca 2 o 3 veces con agua para
eliminar los restos de alimentos. Se miden en una probeta 50 ml de agua destilada y con ella
se enjuaga la boca, en varios buches, por espacio de unos 2 o 3 minutos, cada buche. El
lquido recogido se filtra a travs de un algodn y 10 ml de este filtrado se diluyen con agua
destilada hasta completar 100 ml. Esta solucin, que en adelante se denominara Amilasa
Salival, ser la que se utilice en la realizacin de las distintas partes de la prctica.
2. Influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival: Se rotulan cuatro
tubos de ensayo 0, 20, 40 y 90. En cada uno se vierten 2 ml de suspensin de almidn al 1
%. El tubo 0 se coloca, durante diez minutos en bao de hielo; el tubo 20 se deja a
temperatura ambiente, el tubo 40 y el tubo 90 se colocan respectivamente, en un bao de
agua a esas temperaturas durante diez minutos. A cada tubo, sin retirarlo del bao, se le
agregan 0.5 ml de amilasa salival; se agitan bien los tubos y se dejan durante un minuto a las
condiciones de temperatura anteriormente sealadas. Al cabo de este tiempo se colocan 5
gotas del contenido del tubo 0 en una concavidad de una gradilla inmunolgica a la que
previamente se le haban adicionado 2 gotas del reactivo de lugol, y se observa el color
producido. El mismo procedimiento se repite con el contenido de los tubos 20, 40 y 90. Si el
color en la concavidad es amarillo oscuro se da por terminada la prueba. Si el color es azul
se esperan otros cinco minutos y se repite la prueba con el lugol. La temperatura ptima ser
aquella en la cual se observe ms rpidamente el color amarillo ocre.
3. Influencia del pH en la actividad enzimtica: Rotule cinco tubos de ensayo 3, 5, 6, 7 y 9;
depostelos en un bao de agua a la temperatura ptima (obtenida en la parte anterior) y
agregue, en su orden, sin retirarlos del bao, las sustancias que se indican a continuacin:
Tubo
Almidn 0.5%
Amortiguador pH 3
Amortiguador pH 5
Amortiguador pH 6
Amortiguador pH 7
Amortiguador pH 8
Amilasa salival
3
2ml
4ml
0.5ml
5
2ml
4ml
0.5ml
6
2ml
4ml
0.5ml
7
2ml
4ml
0.5ml
9
2ml
4ml
0.5ml
Despus de 3 minutos deposite cinco gotas del tubo 3 en una concavidad de la gradilla
inmunolgica en la que previamente haba depositado 2 gotas del reactivo de lugol y observe
el color producido. Repita el mismo procedimiento con los dems tubos. El pH ptimo para la
alfa-amilasa corresponde a aquel tubo donde se obtenga ms rpidamente el color amarillo
ocre. En caso de que no se observe este color en ninguno de los ensayos se repite el
procedimiento cada 30 segundos hasta que el cambio se d.
4. Influencia de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica: Rotule cuatro
tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4. Depostelos en un bao de agua a la temperatura ptima y, sin
sacarlos de all, agregue, en su orden:
Tubo
Almidn 0.5 %
Amortiguador de pH ptimo
Amilasa salival
1
4 ml
5.9 ml
0.1 ml
2
4 ml
5.7 ml
0.3 ml
3
4 ml
5.1 ml
0.9 ml
4
4 ml
3.3 ml
2.7 ml
Realice los mismos ensayos que para determinar la temperatura y el pH ptimos. Encuentre
la concentracin ptima de enzima.
5. Especificidad de la enzima: Rotule 2 tubos de ensayo amilasa, pepsina y depostelos en
un bao de agua a la temperatura ptima. Sin sacarlos de all agregue, en su orden:
Tubo
Amilasa
Pepsina
Almidn 0.5 %
Amortiguador de pH ptimo
Amilasa salival
Pepsina 0.1%
2 ml
4 ml
1 ml
-
2 ml
4 ml
1 ml
Siga el mismo procedimiento que en los casos anteriores.

6. Efecto de los iones metlicos pesados sobre la accin de la amilasa: Rotule tres
tubos de ensayo amilasa, Hg y Pb depostelos en un bao de agua a la temperatura ptima y
agregue, en su orden:
Tubo
Amilasa
Hg+2
Pb+2
Almidn 0.5 %
Amortiguador pH ptimo
HgCl2 1%
Pb(NO3)2
2 ml
1 ml
-
4 ml
1 ml
-
4 ml
1 ml
Repita el procedimiento de los casos anteriores y determine el efecto de los iones metlicos
pesados sobre la amilasa.
7. Efecto de la concentracin de sustrato: Rotule cinco tubos de ensayo 0.5, 1.0, 2.0. 3.0 y
4.0, depostelos en un bao de agua a la temperatura ptima y, agregue en su orden:
Tubo
Solucin Almidn 1%
Amortiguador pH ptimo
Amilasa salival
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
0.5 ml
9.0 ml
0.5 ml
1.0 ml
8.5 ml
0.5 ml
2.0 ml
7.5 ml
0.5 ml
4.0 ml
5.5 ml
0.5 ml
8.0 ml
1.5 ml
0.5 ml
Cada minuto extraiga 3 gotas de cada tubo y ensaye la presencia de almidn con 1 gota del
reactivo de lugol. Anote el tiempo requerido para la aparicin del color rojo pardo.
RESULTADOS:
1. Determine los parmetros ptimos de la enzima utilizada en la prctica.
2. Investigue sobre los efectos de las otras enzimas utilizadas en el laboratorio y de la
influencia de los metales pesados.
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

1988.
6. IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS:
Identificar y reconocer algunos carbohidratos mediante reacciones caractersticas.
FUNDAMENTO TEORICO:
Los carbohidratos son polihidroxialdehdos, polihidroxicetonas o compuestos que, por
hidrlisis, se convierten en aqullos. Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos
ms simples se denomina Monosacrido. Un carbohidrato que por hidrlisis da dos
molculas de monosacrido se conoce como Polisacrido. De acuerdo a su funcin qumica
los carbohidratos se pueden clasificar como aldosas y cetosas, segn posean la funcin
aldehdo (-CHO) o cetona (-COO); adems en su estructura poseen grupos hidrxilo (-OH).
De acuerdo con lo anterior los carbohidratos experimentan las reacciones caractersticas de
los grupos funcionales hidrxilo y carbonilo. Por ejemplo, todos los monosacridos y algunos
disacridos reaccionan con los reactivos de Tollens y de Fehling: el agente oxidante del
reactivo de Tollens es el ion Ag + y el del reactivo de Fehling el ion Cu +2. Los monosacridos
reducen los iones Cu+2 a xido cuproso (Cu2O) y los iones Ag+ a plata metlica. Debido a este
comportamiento, los monosacridos reciben el nombre de Azcares Reductores. Estas
reacciones no permiten diferenciar entre aldosas y cetosas.
Como aldehdos que son, las aldosas reaccionan con fenilhidracina para generar
fenilhidrazonas. Si se emplea un exceso de fenilhidracina, la reaccin contina hasta dar
productos conocidos como Osazonas que contienen dos residuos de fenilhidracina por
molcula. Una de las dificultades que presenta el trabajo con carbohidratos lo manifiesta su
tendencia a formar jarabes; el tratamiento con fenilhidracina convierte carbohidratos en
osazonas slidas, que se pueden aislar y purificar con facilidad, y que tambin pueden
identificarse por sus formas cristalinas caractersticas.
La prueba de Molisch, es una reaccin general para los carbohidratos; estos se deshidratan
en presencia de cido concentrado, dando un derivado de tipo furfural. Se condensa el
furfural con -Naftol y se obtiene un color rojo a violeta. Una reaccin negativa en una
sustancia dada puede aceptarse como prueba de ausencia de carbohidratos.
El cido ntrico oxida tanto al grupo aldehdo como al grupo alcohol primario terminal de los
monosacridos, produciendo cidos mono y dicarboxlicos que reciben el nombre general de
cidos sacricos. El cido msico es el menos soluble en agua, de todos los cidos
sacricos. Esta caracterstica facilita la identificacin de la galactosa o de los azcares que la
contienen.
La prueba de Bial es til en la identificacin de pentosas, esta se utiliza frecuentemente para
reconocer la presencia de cidos nucleicos, debido a la reaccin que produce con la ribosa
contenida en los nucletidos.
Reactivos:
cido actico 25%
Reactivo de Molisch
Carbn activado
cido sulfrico concentrado
Glucosa 2%
cido ntrico concentrado
Fructosa 2%
Fenilhidracina
Sacarosa 2%
Reactivo de Fehling A
Maltosa 2%
Reactivo de Fehling B
Galactosa 2%
Reactivo de Benedict
Lactosa 2 %
Reactivo de Barfoed
Arabinosa 2%
Reactivo de Seliwanoff
Xilosa 2%
Reactivo de Bial
Almidn 0.5%
Reactivo de Lugol
Dextrina 0.5 %
Hielo
Leche, miel de abejas, gaseosa o jugos sin color, clara de huevo (Cada grupo debe traer
estos materiales)
Materiales:
1 Gradilla + Tubos + Pinza
2 Beaker 250 ml
1 Varilla de Vidrio
3 Pipetas 5 ml
4 Tubos tapa rosca
1 Gotero
1 Aro metlico
1 Probeta 50 ml
1 Embudo de vidrio
1 Papel filtro
Centrifuga
pH-metro
PROCEDIMIENTO:
1. Preparacin de las muestras biolgicas:
Miel de abejas: Disuelva 10 gramos de miel de abejas en agua destilada hasta completar
100 ml. Si es necesario, caliente suavemente, con agitacin constante, dentro de un bao
mara.
Leche: Deposite 100 ml de leche en un beaker de precipitados de 250 ml. Adicione cido
actico al 25 %, gota a gota y agitando despus de cada adicin hasta que se produzca un
floculo o un precipitado. En ese momento el pH debe estar cercano a 4.8. Centrifugue a 3000
rpm durante 5 minutos. Deseche el precipitado y utilice el sobrenadante para determinar los
azcares presentes en la leche.
Clara de huevo: Dentro de una probeta mida el volumen de una clara de huevo. Agregue
cinco veces su volumen en agua y agite bien. Con esta solucin se harn las pruebas para
determinar los azcares presentes.
Jugos y bebidas: Se pueden utilizar directamente si son transparentes. Si no lo son, a 100

ml de jugo o bebida se le adiciona una cucharada pequea de carbn activado, se agita bien,
se deja en reposo 15 minutos y se filtra a travs de papel filtro. El filtrado debe resultar
transparente e incoloro. De no ser as, se puede agregar al filtrado otra pequea cantidad de
carbn activado, agitar y volver a filtrar a travs de un nuevo papel de filtro. En el caso de las
bebidas gaseosas es conveniente eliminar previamente el gas carbnico por trasvase
sucesivo de un recipiente a otro.
OJO: En todas las pruebas va a utilizar 2 ml de su muestra biolgica, adems de los
carbohidratos que se mencionan en cada caso.
NOTA: Debido a que la prueba del cido mcico es la ms demorada se recomienda
comenzar la prctica con esta prueba.
2. Prueba de Molisch para reconocimiento de carbohidratos: (Carbohidratos: muestras
biolgicas, glucosa, fructosa, sacarosa y almidn). A 2 ml de cada una de las soluciones de
carbohidrato agregue 5 gotas del reactivo de Molisch y agite. Luego, se dejan resbalar por
las paredes del tubo de ensayo 2 ml de cido sulfrico concentrado. Si hay carbohidratos
presentes, en la interfase entre los dos lquidos debe aparecer un anillo color violeta.
3. Prueba del cido msico para reconocimiento de galactosa: (Carbohidratos: muestras
biolgicas, glucosa. galactosa y lactosa). A 2 ml de solucin de carbohidrato en tubos de
ensayo diferentes, adicione 2 ml de cido ntrico concentrado y caliente en bao mara hasta
que el volumen dentro del tubo de ensayo sea la mitad del original y la solucin adquiera un
color amarillento (1 hora aproximadamente). Saque los tubos del agua hirviente, djelos
enfriar y luego depostelos en un bao de hielo. Un fino precipitado blanco indica la presencia
de cido mclco y consecuentemente de galactosa. Si no se produce la cristalizacin
espontnea se puede inducir rascando las paredes internas de los tubos de ensayo, sin
sacarlos del bao de hielo, con una varilla de vidrio limpia o dejando los tubos dentro de la
nevera durante la noche.
4. Prueba de osazonas para reconocimiento de azcares: (Carbohidratos: muestras
biolgicas, glucosa, fructosa, galactosa y sacarosa). A 1 ml de solucin de fenilhidrazina
agregue 2 ml de la solucin de carbohidrato. Agite y caliente en un bao de agua hirviendo
durante 10 minutos. Observe la formacin de cristales. Compare los cristales de las muestras
biolgicas con los de los otros tubos.
5. Ensayos para azcares reductores:
Reaccin de Fehling: (Carbohidratos: muestras biolgicas, glucosa, fructosa, sacarosa y
almidn). En un tubo de ensayo mezcle 2 ml de la solucin de Fehling A con 2 ml de la
solucin de Fehling B y de inmediato agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato. Agite e
introduzca los tubos en un bao de agua hirviente, durante 15 minutos. La aparicin de una
coloracin verde, amarilla, anaranjada, rojiza o de un precipitado rojo (segn la concentracin
del material reductor) indica la presencia de un azcar reductor.
Reaccin de Benedict: Agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato a 2 ml del reactivo de

Benedict. Agite y caliente en un bao de agua hirviente durante 5 minutos. La formacin de
un precipitado rojo amarillento indica la presencia de un carbohidrato reductor.
6. Prueba de Barfoed para distinguir entre monosacridos y disacridos:
(Carbohidratos: muestras biolgicas, glucosa, fructosa, maltosa y lactosa). A 2 ml del reactivo
de Barfoed agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato y agite. Caliente el tubo en un bao
de agua hirviente durante 5 minutos. La aparicin de un precipitado rojo-amarillento indica la
presencia de un monosacrido; los disacridos reductores se demoran ms en producir el
mismo precipitado.
7. Prueba para reconocimiento de cetonas: (Carbohidratos: muestras biolgicas, glucosa,
fructosa, sacarosa): A 2 ml del reactivo de Seliwanoff agregue 1 ml de la solucin de
carbohidrato y caliente en un bao de agua hirviendo. El desarrollo de un color rojo intenso
en pocos minutos es prueba positiva para cetohexosas. Las aldosas dan pruebas ms
dbiles y despus de un tiempo mayor.
8. Prueba de Bial para reconocer pentosas: (Carbohidratos: muestras biolgicas, xilosa,
arabinosa, glucosa). A 1 ml de la solucin de carbohidrato agregue 3 ml del reactivo de Bial.
Agite y caliente en un bao de agua hirviendo. La aparicin de una coloracin azul verdosa
en unos pocos minutos, es una prueba positiva para pentosas.
9. Reconocimiento de polisacridos con el reactivo de Lugol: (Carbohidratos: muestras
biolgicas, glucosa, dextrina, almidn). A 1 ml de la solucin de carbohidrato agregue 2 gotas
del reactivo de Lugol y agite. En el caso del almidn se debe obtener un color azul oscuro
mientras que con dextrina la coloracin es pardo rojiza.
RESULTADOS:
1. Coloque en una tabla en forma horizontal los carbohidratos ensayados y en forma vertical
las pruebas realizadas. Indique con +, - o ? si los resultados fueron positivos, negativos o
dudosos.
2. Compare los resultados obtenidos entre las muestras biolgicas y los diferentes
carbohidratos preparados en el laboratorio. Con base en esto deduzca qu carbohidratos se
encuentran presentes en las muestras biolgicas con las cuales trabaj.
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

1988.
7. DILISIS DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS:
Conocer el proceso de dilisis utilizando soluciones concentradas de carbohidratos.
FUNDAMENTO TEORICO:
Una membrana que permite el paso de molculas e iones pequeos, pero que retiene las
molculas grandes y las partculas coloidales, se denomina Membrana Dializante; El paso
selectivo de pequeas molculas o iones en cualquier sentido a travs de una membrana
dializante se denomina Dilisis.
El proceso de dilisis consiste en una bolsa formada por una membrana dializante, tal como
una vejiga animal o papel celofn; la bolsa contiene una mezcla de coloides, molculas e
iones disueltos que se coloca en un recipiente por el que circula agua pura. El agua arrastra
los iones y molculas que pasan a travs de la membrana, mientras que los colides
permanecen.
La importancia de las membranas dializantes al permitir el paso de slo ciertas sustancias se
pone de manifiesto en los riones, que aprovechan el fenmeno de dilisis para mantener el
equilibrio de soluto y electrlito en la sangre. La principal misin de los riones es limpiar la
sangre eliminando los productos de desecho del metabolismo, as como controlar la
concentracin de electrlitos.
Esta tcnica se aplica en la purificacin de protenas y polisacridos.
Reactivos:
Almidn al 1 %
Glucosa al 10%
Agua destilada
Reactivo de Benedict
Reactivo de Lugol
Materiales:
2 Pipetas 5 ml
Gradilla + 4 tubos de ensayo
1 Soporte Bao Mara
1 Pinza con nuez
1 Beaker 250 ml
Papel celofn (Cada grupo debe traer este material)
PROCEDIMIENTO:
Deposite 3 ml de almidn al 1 % y 5 ml de glucosa al 10 % dentro de una bolsa de celofn (si
no dispone de una hgala usted mismo uniendo los extremos de un trozo de papel de
celofn). Cierre la bolsa con un hilo, culguela de un soporte e introduzca el conjunto dentro
de un beaker con agua destilada, de tal manera que los dos lquidos el agua y la solucin a
dializar queden ms o menos al mismo nivel; se debe procurar que la bolsa no toque las
paredes ni el fondo del beaker. Con un alfiler abra un pequeo hueco en un punto situado
arriba del nivel del lquido; este orificio sirve para la salida del aire y el posible escape del
lquido interior sin que explote la bolsa.
Deje el conjunto en esta posicin durante 90 minutos, agitando de vez en cuando y en forma
suave, el beaker. Transcurrido este tiempo, rotule cuatro tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4. En los
tubos 1 y 2 deposite 2 ml de la solucin a dializar. En los tubos 3 y 4 deposite 2 ml del lquido
del beaker. A los tubos 1 y 3 agrgueles 2 ml del reactivo de Benedict y colquelos en un
bao de agua hirviendo, durante diez minutos, Observe si aparece un color rojo o
anaranjado.
A los tubos 2 y 4 agrgueles 2 gotas del reactivo de Lugol y observe si aparece un color azul
oscuro indicativo de la presencia de almidn.
RESULTADOS:
Indique en qu caso(s) el resultado fue positivo (+) o negativo (-). En base a sus resultados
deduzca si hubo dilisis o no.
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

1988.
8. DETERMINACIN DE NDICES EN GRASAS Y ACEITES

OBJETIVOS:
Determinar los ndices de saponificacin, acidez, perxidos y yodo de una grasa o aceite.
FUNDAMENTO TEORICO:
Un anlisis qumico completo de las grasas o aceites encontrados en la naturaleza es un
procedimiento bastante dispendioso. Hay varias formas de caracterizar las grasas o aceites o
sus cidos grasos componentes. Una de las tcnicas ms utilizadas es la cromatografa de
gases que permite una separacin y una cuantificacin bastante precisa de los cidos
grasos. Sin embargo, cuando no se dispone de este equipo hay otras mediciones como:
ndice de saponificacin, ndice de acidez, ndice de perxidos, ndice de yodo; que dan una
informacin til acerca de la composicin y pureza de una grasa o aceite determinados.
ndice De Perxidos:
El O2 atmosfrico acta sobre la grasa produciendo la oxidacin de los cidos grasos al
fijarse tomos de O2 a su cadena, inicialmente en los dobles enlaces, dando lugar a
perxidos. Este fenmeno se acelera por la accin de la luz y el calor. Su determinacin se
basa en la capacidad de los perxidos (generados en la oxidacin de las grasas) de liberar
yodo del yoduro potsico en presencia de cido actico y la posterior valoracin de aquel.
Este ndice es un indicativo del grado de rancidez de una grasa o aceite.
ndice De Acidez:
La acidez es consecuencia del contenido en cidos grasos libres en una grasa o aceite,
provenientes de la hidrlisis de los glicridos. Se expresa normalmente como Grado de
Acidez o Acidez libre que representa el porcentaje de dichos cidos expresados en cido
oleico. Tambin puede expresarse como ndice de acidez, que es el nmero de miligramos
de KOH necesarios para neutralizar 1 g de grasa.
ndice De Saponificacin:
Es una medida aproximada del peso molecular promedio de los cidos grasos. Se define
como el nmero de mg de KOH que se necesitan para neutralizar los cidos grasos
contenidos en 1 g de grasa.
Este ndice da una idea de la longitud de la cadena de cidos grasos presentes en el lpido
ya que entre ms corta la cadena de cido graso mayor ser el nmero de radicales de
COOH por gramo. A mayor ndice de saponificacin menor longitud de la cadena de cido
graso.
ndice De Yodo
Son los gramos de yodo absorbidos por 100 gramos de grasa. Medida de las insaturaciones
presentes en los cidos grasos que conforman un TRIGLICERIDO.
Este ndice es una propiedad qumica relacionada con la insaturacin, con el ndice de
Refraccin y con la densidad: a mayor ndice de yodo, mayor ndice de refraccin y mayor
densidad. Los aceites comestibles contienen buena cantidad de cidos grasos insaturados,
dando Indice de yodo relativamente altos.
Existe relacin entre el grado de insaturacin y el grado de enranciamiento, puesto que los
glicridos de cidos grasos con 2 o 3 dobles enlaces son ms sensibles a la oxidacin.
Reactivos:
KOH 0.5 N en Etanol
Yoduro de potasio al 10%
cido clorhdrico 0.5 N
Tiosulfato de sodio 0.1 N
Fenolftalena al 0.5 % en Etanol
Almidn al 1%
Yodo 0.2 M en cido actico glacial
Etanol al 95%
Cloroformo
cido actico glacial: cloroformo (3:2)
Hidrxido de potasio 0.1 N
Agua destilada
Grasa o de aceite vegetal fresco (Cada grupo debe traer este material)
Materiales:
2 Balones fondo plano 250 ml
2 Condensadores
2 Beakers 400 ml
Mangueras
2 Buretas 50 ml
4 Corchos
4 Erlenmeyer 250 ml
2 Beakers 250 ml
2 Mecheros
2 Tripodes
2 Placas de cermica
2 Pinzas con nuez
1 Pinza para bureta
PROCEDIMIENTO:
1. ndice de saponificacin: En un erlenmeyer coloque 1.5 g (exactamente pesados) de
grasa o de aceite. Agregue 15 ml de hidrxido potsico alcohlico y conecte a un
condensador de reflujo refrigerado por agua. Caliente en un bao de agua hirviendo durante
30 minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente y titule con cido clorhdrico 0.5 N,
utilizando fenolftalena como indicador.
Repita el mismo procedimiento anterior pero utilizando 1.5 ml de agua en lugar del aceite.
Este es el blanco. En ambos casos anote los valores obtenidos en la titulacin.
2. ndice de yodo: Pese 1.0 g de aceite (o grasa) y disulvalo en 10 ml de cloroformo.

Agregue, exactamente. 10 ml de yodo 0.2 M en cido actico glacial. Tape, agite y deje en
reposo en la oscuridad, durante 30 minutos.
Haga un blanco con los mismos reactivos pero sin aceite y deje en reposo, en la oscuridad,
durante 30 minutos Transcurrido este tiempo agregue, en cada recipiente, 10 ml de yoduro
potsico al 10 % y 50 ml de agua destilada. Titule inmediatamente con solucin de tiosulfato
de sodio 0.1 N hasta un color amarillento. Agregue 1 ml de almidn 1 % y contine la
titulacin hasta que desaparezca el color azul. Durante la titulacin se debe agitar
fuertemente el erlenmeyer para asegurarse que todo el yodo se ha removido de la capa de
cloroformo. Anote el volumen total de tiosulfato gastado en la titulacin del blanco y de la
muestra.
3. ndice de acidez: Pese 2.5 g de aceite (o grasa) y disulvalos en 12.5 ml de etanol al 95
%. Si no disuelve bien caliente en bao Mara hasta unos 60C. Agregue cinco gotas de
solucin de fenolftalena y titule con hidrxido de potasio 0.1 N hasta obtener un color rosa
plido que persista por ms de 30 segundos. Repita la titulacin utilizando slo etanol al 95
% (blanco).
4. ndice de perxidos: Pese 5 g de aceite (o grasa) y adicione 15 ml de una mezcla de
cido actico glacial: cloroformo (3:2). Agregue 1 ml de solucin de yoduro potsico al 10 %.
Agite durante un minuto y deje en reposo otro minuto. Adicione 50 ml de agua destilada y
agite. El yodo que se libera se titula con tiosulfato sdico 0.1 N hasta que el color sea
amarillento. Se aade entonces 1 ml de almidn al 1 % y se sigue titulando con tiosulfato
hasta la desaparicin del color azul.
RESULTADOS:
Indice de saponificacin (S):
El nmero de mg de KOH gastados en la neutralizacin de 1g de grasa los podemos
determinar a partir del nmero de miliequivalentes (meq) de KOH gastados en la misma
titulacin:
meq KOH necesarios para neutralizar 1g de grasa = meq KOH adicionados meq KOH residuales
= meq KOH blanco meq KOH residuales en la
muestra
Pero: meq KOH = meq HCl gastado en la titulacin
Por consiguiente:
meq KOH gastados = meq HCl blanco meq HCl residuales en la muestra
= (Vb Vm) N
Donde: Vb = volumen de HCl gastado en la titulacin del KOH presente en el blanco

Vm = volumen de HCl gastado en titular el KOH residual de la muestra
N = normalidad del HCl utilizado
Para cumplir con la definicin debemos determinar cuntos meq se requieren por 1g de
grasa o aceite:
Entonces, por Q gramos de muestra se gastaron (Vb Vm) meq; por 1g (Vb Vm) N
Q
1 meq de KOH equivale a 56mg de KOH: (Vb Vm) N meq equivalen a:
Q
56 x (Vb Vm) x N mg de KOH = S = Indice de Saponificacin
Q
Por otro lado, 1 meq de KOH es igual a 1 meq de cido graso saponificado: un triglicrido, al
hidrolizarse, libera 3 molculas de cido graso, por lo cual 3 meq de KOH son
aproximadamente iguales a 1 meq de grasa o sea a M/1000, donde M es el peso molecular
promedio de la grasa. O sea que para saponificar un nmero de gramos igual a M se
necesitan 3 x 56 x 1000 mg de KOH. De manera que el ndice de saponificacin es tambin
igual a:
S = 3 x 56 x 1000
M
De donde:
M = 16800
S
Con base en las frmulas anteriores determine el ndice de saponificacin de la grasa o

aceite con la cual trabajo y su peso molecular promedio.
Indice de Yodo (Y):
El Yodo absorbido por el aceite ser igual al yodo presente en el blanco menos el yodo
residual en la muestra. Los meq de yodo presente en ambos casos (blanco y muestra) son
iguales a los meq de Tiosulfato; o sea:
meq de Yodo absorbidos = (Vb Vm) N
Donde: Vb = volumen de Tiosulfato en ml gastados en la titulacin del blanco.
Vm = volumen de Tiosulfato en ml gastados en la titulacin del yodo residual de la muestra
N = normalidad del Tiosulfato (Na2S2O3.5H2O)
1 meq de yodo es igual a 0.127 mg de yodo: (Vb Vm) N mqe son iguales a 0.127 (Vb Vm)
N gramos; esto en Q gramos de aceite; en 100 g (para cumplir con la definicin del ndice de
yodo) ser:
Y = 100 (Vb Vm) N (0.127) gramos

Q
En base a la frmula anterior determine el ndice de yodo y exprese su opinin acerca del
grado de insaturacin de su aceite o grasa.
ndice de Acidez (A):
Los meq de KOH gastados en la titulacin son iguales a los meq de cidos grasos libres
presentes en la grasa.
Los meq de KOH gastados son iguales a V x N; donde V es el volumen en ml de KOH
gastados en la titulacin = Vm Vb. Por consideraciones similares a las hechas para el
ndice de saponificacin:
A = 56 x V x N
Q
Cul es el ndice de acidez del aceite utilizado en la prctica?

Qu indicacin le da sobre la frescura del aceite?
Indice de Perxidos (P):
Los meq de Tiosulfato utilizados indican los meq de Yodo liberados por la reaccin con los
perxidos que es igual al nmero de meq de perxidos presentes en la muestra:
meq perxido = meq yodo = meq Tiosulfato = V x N
Donde: V = volumen de Tiosulfato gastado en la titulacin
N = normalidad del Tiosulfato
V x N son entonces los meq de perxido en Q gramos de grasa; en 1 Kg:

P = V x N x 1000
Q
Determine el ndice de perxidos y relacinelo con el grado de rancidez de su aceite o grasa.

BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.
9. EXTRACCIN E IDENTIFICACIN DE ARN DE LEVADURA
OBJETIVOS:
Aislar el ARN de levadura
Conocer el funcionamiento de equipos de laboratorio como la centrifuga
FUNDAMENTO TEORICO:
Es til descomponer los cidos nucleicos en los nucletidos, nuclesidos, bases, azcares y
fosfatos que los integran, con fines de anlisis e identificacin.
Las principales etapas del aislamiento de los cidos nucleicos son: destruccin de la clula
por choque osmtico; homogenizacin, digestin enzimtica o ataque mecnico leve,
seguidos a veces por aislamiento de ncleos, mitocondrias, virus u otras formaciones
subcelulares. Puesto que los cidos nucleicos se unen muy fuertemente a los cationes y las
protenas catinicas como histonas y protaminas, es necesario separarlos de estas
sustancias con lesiones mnimas de la cadena polinucleotdica.
Para este fin se han utilizado con xito las soluciones acuosas de fenol adicionadas de
detergentes y agentes quelantes. Esta mezcla disolvente, aadida a los fragmentos de tejido,
produce un sistema de dos fases; los cidos nucleicos quedan en la capa acuosa y las
protenas desnaturalizadas se disuelven en el fenol o precipitan en la interfase. La
separacin de los cidos nucleicos y las protenas, se facilita por la adicin de detergentes
aninicos y de sales concentradas. Tambin se aaden agentes quelantes para eliminar
metales polivalentes que podran formar sales con los grupos fosfatos de los cidos
nucleicos. Finalmente, se trabaja con pH ligeramente alcalino para reducir las interacciones
electrostticas de cidos nucleicos con otros iones.
Debido a su carcter macromolecular, los cidos nucleicos resultan bastante difciles de
separar de las protenas y polisacridos por mtodos suaves y los tratamientos drsticos
alteran profundamente su estructura y caractersticas, por lo cual a menudo se encuentra un
alto grado de impurezas en las preparaciones no analticas.
El ARN de levadura se obtiene extrayendo un homogenizado de clulas con fenol. La
solucin concentrada de fenol rompe los enlaces de hidrgeno en las macromolculas,
causando desnaturalizacin de la protena. La suspensin turbia se centrifuga y aparecen
dos fases: la fase inferior de fenol contiene ADN y la fase superior acuosa contiene
carbohidratos y ARN. La protena desnaturalizada se halla presente en ambas fases y se
puede remover por centrifugacin. El ARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido
no contiene ADN pero generalmente est contaminado con polisacrido.
Reactivos:
Fenol al 90%
Eter etlico
Acetato de potasio al 20%
Etanol absoluto
Reactivo de Bial
Molibdato de amonio al 5%
Cloruro estaoso al 2 %
Etanol:Agua 3:1
Agua destilada
Levadura (Cada grupo debe traer este material)
Materiales:
1 Mortero con pistilo
1 Erlenmeyer 250 ml
1 Erlenmeyer 500 ml
1 Termmetro
1 Probeta 50 ml
1 Varilla de vidrio
1 Embudo de decantacin
Centrifuga
Nevera
5 Tubos tapa rosca

1 Embudo de vidrio
1 Aro metlico
1 Gradilla
2 Tubos de ensayo
2 Beakers 100 ml
1 Papel filtro
1 Gotero
Balanza
PROCEDIMIENTO:
Suspenda 10 g de levadura seca en 40 ml de agua a 37 C. Deje durante 15 minutos a esta
temperatura y agregue un volumen igual de fenol al 90 % (mida con probeta la solucin de
fenol). Agite el conjunto durante 10 minutos a temperatura ambiente y deje en la nevera otros
10 minutos; luego centrifugue en fro a 4000 rpm durante 15 minutos. Con una pipeta pasteur
(gotero) remueva cuidadosamente la capa superior acuosa y centrifugue en fro a 10000 rpm
durante 5 minutos. Deseche el residuo y pase el sobrenadante a un embudo de decantacin.
Agregue un volumen igual de ter etlico fro (mantenido en nevera) -mida el ter con
probeta, no con pipeta-. Agite suavemente y luego extraiga la fase acuosa inferior (en la fase
etrea quedan las trazas de fenol). A la fase acuosa adale 1 ml de acetato de potasio al 20
% y precipite el ARN mediante la adicin de dos volmenes de etanol absoluto fri mientras
agita lentamente con una varilla. De esta solucin retire 4 ml y depostelos en dos tubos de
ensayo (2 ml en cada tubo). El resto djelo guardado en nevera.
A uno de los tubos agregue 3 ml del reactivo de Bial. Caliente en un bao de agua hirviendo
durante 20 minutos y luego enfre. La aparicin de un color verde indica la presencia de una
pentosa.
Al otro tubo de ensayo agregue 4 ml de molibdato de amonio y 2 ml de cloruro estaoso. La
aparicin de un color azul indica la presencia del grupo fosfato.
Centrifugue en fro a 3000 rpm, durante 5 minutos la solucin que dej guardada en la
nevera. Deseche el sobrenadante, resuspenda el precipitado en etanol: agua (3:1); lave con
etanol absoluto y finalmente con ter; deje secar al aire y pese. Previamente pese el beaker
que va utilizar.
RESULTADOS:
1. Interprete el resultado de las pruebas con el reactivo de Bial y el molibdato de amonio.
2. Determine el porcentaje de ARN obtenido respecto a la levadura total. El contenido de
ARN en levadura es de alrededor del 4% de su peso seco.
NOTA: En caso de quemadura con fenol lvese inmediatamente con abundante etanol.
BIBLIOGRAFIA

Mxico. 1998.


Mxico. 1974.

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UNIVERSIDAD MARIANA

LABORATORIO DE CIENCIAS BASICAS

SAN JUAN DE PASTO

1. pH EN SOLUCIONES ACIDAS Y BASICAS

Estas reacciones tambin se pueden escribir como:

La constante de equilibrio de la disociacin de un cido dbil o Constante de disociacin,

Si despejamos [H+] obtenemos:

Esta es la ecuacin de Henderson Hasselblach, que relaciona el pH de una disolucin

7. Qu ocurre en el tubo 9, porqu?

BOHINSKI, Robert C. Bioqumica. Addison Wesley Iberoamericana S.A. Quinta Edicin.

LUQUE, Ernesto J. Prcticas de bioqumica. Universidad de Nario. Departamento de

RENDINA, George. Tcnicas de bioqumica aplicada. Nueva Editorial Interamericana S.A.

WERNER, Rudolf. Fundamentos de Bioqumica Moderna. Editorial Acribia S.A. Espaa.

2. TITULACIN POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS

1 Pinza para bureta

BOHINSKI, Robert C. Bioqumica. Addison Wesley Iberoamericana S.A. Quinta Edicin.

LUQUE, Ernesto J. Prcticas de bioqumica. Universidad de Nario. Departamento de

RENDINA, George. Tcnicas de bioqumica aplicada. Nueva Editorial Interamericana S.A.

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3. REACCIONES DE CARACTERIZACIN DE AMINOCIDOS

La reaccin Xantoproteica es caracterstica de los aminocidos que poseen anillos

Acido sulfrico concentrado

7. Prueba de Hopkins - Col: a 1 ml de solucin experimental (triptfano, glicina, casena)

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4. DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJELDAHL

En la etapa siguiente, mediante la accin de una base fuerte, generalmente hidrxido de

CO2(g) + H2O(g)+ NH4HSO4(ac)

Liberacin de NH3: NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac)

NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)

Recoleccin: NH4OH(ac) + H3BO4(ac)

Titulacin: NH4H2BO4(ac) + HCI(ac)

El clculo del porcentaje de protena en una muestra no es totalmente exacto pero si

Donde: Vm = Volumen de HCl en ml gastado en la titulacin de la muestra

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5. INFLUENCIA DE DIVERSOS FACTORES EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Siga el mismo procedimiento que en los casos anteriores.

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Jugos y bebidas: Se pueden utilizar directamente si son transparentes. Si no lo son, a 100

Reaccin de Benedict: Agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato a 2 ml del reactivo de

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8. DETERMINACIN DE NDICES EN GRASAS Y ACEITES

2. ndice de yodo: Pese 1.0 g de aceite (o grasa) y disulvalo en 10 ml de cloroformo.

Donde: Vb = volumen de HCl gastado en la titulacin del KOH presente en el blanco

Con base en las frmulas anteriores determine el ndice de saponificacin de la grasa o

Y = 100 (Vb Vm) N (0.127) gramos

Cul es el ndice de acidez del aceite utilizado en la prctica?

V x N son entonces los meq de perxido en Q gramos de grasa; en 1 Kg: