ACTIVIDAD PROTEOLITICA ‘© Degradacién de la caseina Agar Leche Descremada om Fee Sustrato: Caseina (prateina) Ensima: Caseinasa(Proteasa, exoenzima). Producto: Aminofcios Pruebanegotiva Prueba positive Revelador: No requiere Las proteases son excretadas al medio para la degradacién de proteinas la caseina es a protein dela leche que le confiereel color blanco, cuando la caseina es hirolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento fngico. Agar caseina-componéntes Se utiliza para diferenciar a Nocardia brasiliensis de otras especies de Nocardia, con base cen la capacidad de hidrolizar la caseina Composicién Leche en polvo descremada 10g ‘Agua destilada 200ml Agar 2e Procedimiento Disolver la leche en 100 mi de agua, agregandola poco @ poco para evita la formacion de grumos Esterlizara 121 °C durante 35 min Disolver el agar en 100 mil de agua Esterlizar a 121°C durante 15 min Enfiar ambas soluciones a 48°C, se mezclan y se homogenizan| Envasar.J ee Hidr is de la gelatina Se utiliza para demostrar la actividad proteolitica de algunas especies de hongos y de ‘Actinomycetes causantes de micetoma y cromomicosis, Empleada por Gordon y Smith (1953) la prueba se desarrolla dela siguiente manera: Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para producir enzimas proteoliticas que lician la gelatina (gelatinasas). ‘Agar nutrtivo afiadido de 0.4 % de gelatina Medio Frazier Peptona 100 z Cloruro de sodio 50) @ Extracto de carne 50 g Gelatina 48, zg ‘Agar 15,0 e ‘Agua destilada : 10000 mu. La gelatina es ablandada por 40 c.c. de agua fria antes de ser afladida al agar fundido ajustar el pH a 7, Esterlizar en autoclave y repartir en placas, Sembrar en estrias e incubar a2arc. Una placa se examina a los 5 dias y otra a los 10 dias de incubacién. a hidrdlisis de la gelatina se pone de manifiesto por bafo de la placa de la siguiente solucién: cl 15ers Hcl concentrada 20ml Agua destilada 200 mi Una zona clara bajo el entorno de la linea de crecimiento, proporcionar la medida de la hidrdlisis, mientras que la gelatina no hidrolizada aparece como un precipitado blanco y opaco.eee ee Resultado neaativo Resultado positivo + Licuefaccién de la gelatina Gelatna Nutiiva Sustrato:Gelatina(protena), Enzima: Gelatinasa(Proteasa, excenzima. . Producto: Aminoseidos Revelador: No requlereo puede emplearse el arbén actvade en polvo, La gelatina es una proteina que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidroiada por la pelatinaa en los aminodcidos que la componen pierde su caracteristica de gelficar.Se pueden femplear varios medios que permiten la vsualizacién macroscépica como la gelatina adherida a carbn activado,Fermentacién de la lactosa ‘+ Leche tornasolada Medio de cutivo: Medio de leche tornasolada CComposicién: 2} Leche descremada b) Agua destilada )Indicador de pH: Tornasol ‘Acido: Color rojo (pH = 4.5) ‘Acalino: Color azul (pl = 8.3) ‘Medio no inoculado: Azul purpireo (pH = 6.8) Fundamento Permiteaiferencarorganismos sobre la base de sus mltiplesreaeciones metabéiicas en un medio cteo como: fermentacién de lactosa, casedisis,ycoagulacén dela caseina El tornasel \ncorporado aa leche es unincicador de Hy de ondacién-reduccién que hace que el medio ‘pueda indicar diversas funciones metabslicas. a leche contiene lactosa, casein, latalbimina ¥ lactoglobulina, por o tanto, un organismo puede mostrar una o varias propiedades metabdlicas en la leche tornasolada ayudando asia a identficacién 2. Fermentacién de actosa 2. Reduccén dl torasol 3. Formacion de codgulo 4. Peptonizaién (igestin) 5. Formacién de gas Fermentacién de lactosa Cuando un organism es capa de fermentar actos, preduce principalmente dcdo lictco, con ‘una condildn Seda indicada por el cambio de color del medio que se vuelve rojo rosado. A veces Sido butrico es e producto final. Certs hongos que forman dlcalis no fermentan lactosa, pero actan sobre las sustanclas ritrogenadas que se encuentran ena leche liberando amoniaco,y dando en consecuencia un pl alcalino que se manifesta por un color purpura azuado. Reduccién del ornasol £1 tornasol es un indicador de pty un indicador de oxidacin reduccién; algunos organismas son ‘capaces de reduelr el tornasol a una leucobase.Formacién de cosgulo Las entimas protealtcas provocan la hirSlisis de las proteinas de la leche o que da como resultado su coagulaién. La principal enzima responsable dela formacion de cosgulo es la reina, Laformacién de cosgulo es causada por la preciptacin de la caseina, por la formacin de dcidos © or a conversin de la caseina en paracaseina por a enzima reina. La caseina es una fostoprateina compleja yes la proteina mas importante dea leche. Formacién de un codgulo Scido Laprecipitacién dela casena provocada po los écidosorginicos a partir de lactosa en condiciones fdas produce un coSgul firme ygelatinaso que no se separa dela paredes del tubo, Peptonizacin (digestion) \airétisis de a easeina por a actividad enzimtica produce una conversin final del preciptado ‘aseindgeno en un lquido claro; el proceso se denemina peptonizacin y se manifesta por una aclaracién acuosa del medio,cavsada por una digestion del peciitado (coSgulo)y las proteinas de laleche por as enzimas proteoliticas de los hongos. Sin embargo, solo se produce una ‘eptonizacén cuando el honge que se desarallaen Ia leche tornasolada contiene la enzima proteolticacascinasa. Interpretacion Rojo rosado: ldo: fermentacién de lactosa ‘ul purpreo: No fermentaci de actosa; sin cambio del indicator de pH. ‘Azul: Alcano; Ausencia fermentacién de lactso. El organismo ataca las sustancasnitrogenadas {que se encuentran en el medi. Blanco: Reduccién del tornasol a una levcobase Formacién de codgulo: Coagulacién dela proteina dela leche, ‘Aclaracén del medio: Digestion; se aingerido la protena de aleche.HIDROLISIS DE LA UREA aldo urea o agar urea de cristensen, Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa, Producto: Amoniaco, Inccador: Rojo de fen. Fundomento {aurea es una diamide del Scio carbénico y esta es fécimentehidrolizada con laliberacién de ‘amoniaco y didxido de carbone. La enzima urease que posee un microorganismo puede hidrolzar 212 urea que esta presente en el medio de cultiva de acuerdo con la siguiente reaccin: €l ‘amoniaco reaccionan en solucién para formar carbonato de amonio, produciéndose une alealinizacién y un aumento del pH del media, !nocular un tubo con caldo urea con una asada de la suspensién microbiana a estudiar, sise utiliza ‘gar urease estrala superficie del medio e incubar el medio a 35 *C durante 24h RESULTADOS + Hides por produccién de ureasa Positive: Color rosa fucsia en el medio, Negativa: Sin cambio de color en el medio, Se utiliza par aponer en manifiesto la Produccién de ureasa por géneros. Trichophyton, Cryptococcus y Nocardia, La reaccidn se hace evidente por el cambio de color del medio hacia el magenta Composicién Dextrosa 1g Peptona 1g Cloruro de sodio Sga Fosfato monopotisico 28 urea 208, Aer 15¢ Rojo fenol 12 mg ‘Agua destilada 1000 mi Procedimiento Disolver la urea en 100 mi de agua destilada y esterilzar por filtracién Disolver los ingredientes en 900 mi de agua Esterilzar a 121 °C durante 20 min Enfriar 250°C ‘Agregar la solucin de urea en un ambiente estéril ASIMILACION DE CRISTALES DE BASES NITROGENADAS © Xantina Propuesta por Garden y Mihm en 1939, posteriormente se ha empleado muy poco, sus resultados solo abarcan solo a Nocardia asteroides y a Mycobacterium rhodochrous. Laxantina oxidasa (X0, es una forma de xantina oxdoreductasa que produce especies reactivas del oxigeno} es una enzima que cataliza la oxidacién de hipoxantina a xantina y puede luego ‘atalizar la oxidacion de xantina en écido rico. Esta enzima juega un papel importante en el ‘atabolismo de purinas en algunas especies, incluyendo humanos. {axantina oxidasa puede ser convertida a xantina dehidragenasa a través de una oxidacion reversible con sulhidrioLa prueba se eects de a siguiente manera gar. Peptona.5 a. Extracto de crme.n.3 Bs Ranting. 5 88. ‘Agua destiada...1.000¢. Alustar api 7 Esterlizar al autoclave. El medio se agitaconstantementey se vierte en placas,cuidando de que tenga lugar una buena estribucién de vantna Sembvar por esti. Cuitvar 928° Cy observa. + Hipoxantina ‘se-basaprincipalmente sobre la presencia de entimas que puedan provocar un halo de asimilacién,seguin el necesaro por el microorganism. ‘su fundamento radca en que los atinomicetosaerobios se caracerizan por su capacidad de hidrolizarxantina, hipoxantina, tiosina ycaseina, por lo que estos compuestes se Incorporan al ‘agar nutrtvo,y posteriormente se slembran sobre la superficie grandes cantidades de los, ‘microorganisms. Lainterpretacin se realize con la observacin del medio por debajo y alrededor del desarrollo de Tas colonas, que indica la hidrSlsis.+ TIROSINA Es el mismo fundamento de la vantina © hipoxantina, Es itl para diferenciar especies de Actinomycetes La prueba se efecta dela siguiente manera: At nS. Peptona.5 es. Extracto de carne...3 es. sna ‘Ava destlads..1.000¢. ‘Austra pl 7 Z Disolver el agar por clentamiento en $00 mi de agua Defarentiiar 55 °c Disoveratiosin en 100 mi de agua a temperatura ambiente Esteriizar al autoclave. &1 medio se agita constantemente y se vierte en placas,cuidando de que tenge lugar una buena dstribucién de ls cristales de tirosina El pH debe ser de 6.97.1 Sembrar por estras. Cultivar .28” Cy observar la desaparicén dels cristales de tirsina, alos 14 y2t dasHidrolisis del almidén ‘Segin Gordon y Smith (1953), la prueba se elect dela sigulente manera Pacas de agar nutivo (cldo + 3.5% de aga) afaido de un 1% de almidén de plata (0 del medio de prutba de trosina con 1% de almidén), 1 almidén de plata se suspende en 40 cc de agus fa antes de mezclarse con el agar callente fund. Posterionmente se esteilz se reparte en plac. Las placas se slembran por duplado, ys euban a 28 Principio: Et iodo-foduro origina un color azul en el almidén, € microorganismo crece en la placa que contenga almidén inoculada con lodo para la posterior isualizacién de zona claras alrededor de la colonia, empleado més frecuentemente para Identificar hirolizadores de aimidén, FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS Fundamento de Xilosay arabinasa: Pone de manifest a hidroliis dels azucaresy por ende la produccién de dcidos orgénicos provocando un vie del indicador hacia amarillo, + Medio de cultive: Caldo basic rajo de fenol Composicién: €) Peptona 10. b)Betracto de cerne 1g €)Clorure de sodio 5g <4) Agua destilada 1000 mi €@) Indlcader de pH: Rojo de ferol + Acido: Color amarillo (pH = 6.8) 2 Color rojo ( pH= 8.4) + Medio no inoculado: Rojo (pH =7.4)Fundamento \afermentacion es un proceso metabo de odo-redcciin que ocure en un medio ambiente anaerobio Yemlugar de oxigeno, un sustraoorgénic sve come ceptor final de idréreno (electrons) Enos sistemas de prucbs bectvolgieos, este proceso se detect observand ‘cambios de color en indcadores de pt mesida ques forman products bios. Lasbceras que fermentanunhidrato de arbona son por lo general araerobos facutativos. or medio ‘el proceso de fermentacin un hidrato de arbono es degradadoy descompuesto en dos moculs de «arvono (rosa) que son nuevamente dgradadas en un némera de compuestos de 3, 2,3 yearbonos. ts products finales vain con cada especie bacteriana y depende del sistema ensimtico exstnte ena spec ls condiciones del meio ambiente, : Bacteria Tndicador de pH + CHO mm (aldehides) glucélisis m HeCOe cambio de color #Imerpretaci Postiva = Cole ameril (ido) Negeri or rosa 920 (lai) Colo mranjaTincién de Kinyoun Se emplea para tefir bacilos parcialmente resistentes al écido alcohol. principalmente Util en el caso de los Actinomicetales del genero Nocardia que se decoloran en exceso con la técnica de Ziehl-Neelsen habitual Técnica: Preparar un frotis de material por ter CCubrir en frio durante 5 min con carbofucsina de kinyoun Lavar con agua corriente Remover el exceso de colorante con etanol al SO% Lavar con agua corriente * Decolorar con dcido sulfdrico al 1% durante un periodo de 2.a 3 min Lavar con agua corriente CCubrir con azul de metileno durante 1 min Lavar con agua corriente, dejar secar y observar Los actinomicetales se tefirén de rojo y se observaran en un fondo azuleuupes ARABINOSA: FUNDAMENTO. Este operdn esté bajo control positive. El control positive difiere del control negativo en que se Fequiere la presencia de una proteina ativadora para inicar la transcripcién de RNAm por RNa, polimerasa. Los estudios diploides en un sistema de control positive dan un cuadra diferente del {que se ve en un sistema de control negativo. En este caso la alteracin del regulador para dat el estado no inducible es recesiva para el estado inducible de tipo salvaje. Estos resultados son un requerimiento dela presencia de una proteina activadora para obtener la lexpresién del operén. xILOSA: La xilosa también llamada azucar de madera es una aldopentosa - un monosacérido que Contiene cinco étomos de carbono y que contiene un grupo funcional aldehido- que tiene ‘un isémero funcional que’es la xillosa, Tiene forma de pirano (hexégono) y se encuentra ampliamente distribuida en distintas ‘materias vegetales: madera (cerezo), paja, etc. También se puede encontrar en los tejidos Conectores como en el pancreas o el higado. Su funcién es principalmente alimenticia Pero también se utiliza para hacer pruebas de la absorcién intestinal Es uno de los ocho azucares que son esenciales para la nutricion humana y entre estos azicares encontramos la galactosa, la glucosa, la manosa, la N-acetiiglucosaminico, N- ‘2cetigalactosaminico, la fructosa y el dcido sialica, cELOBIOSA: 0.0 -Glucopiranosil- (1-4) -2-D-Glucopiranosa ‘ Eniace formado por dos glucosas cicades, con el carbono anomérico en posiiénB. Intervienen en ‘el enlace el carbono 1 de la primera glucose y ol carbone 4 dela segunda, Es un Gisacérido que no se encuentra bre en la Naturaleza, Se obtiene por digestion de celiosa, Pose poder reductor.