Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ)17(1): 53-58, 2002 Produccién de Mycoplasma gallisepticum empleando biorreactores del tipo tanque agitado Lilian Sanchez*, Tania Pérez, Ileana Rosado Divisién de Producciones Biofarmacéuticas, Division de Microbiologia Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Autopista Nacional y Carretera de Jamaica, Apartado 10. La Habana, Cuba “Tel #53-64)6-3653, Fax(+53-64)6-3206, Correo electrénico(e-mail):lilian@censa.edu.ct. RESUMEN Secaracterizéel desarrollo de M. gallisepticum empleando biorreacores dde7y 35 L, con el propssito de escalaranivelessuperiores para estable- cer la producein deuna vacune aviar. En a obtencién de los cultivos de M. gallisepticum en biorreactores de 7 L se evaluaron diferentes condi- cones de operacién, a partir de los resultados obtenidos en el laborato- rio, Los rendimientos eelulares aleanzados se midieron por densidad Sptica, conteo de colonias y peso seco y luego se compararon ente si Las proteinas antigénicas de las células completas se analizaron por clectroforesis en gel de poliaerilamida y por un método inminoldgico {conocido como “immunobloming”). Se obtuvieron resultados satisfac torios con niveles de agitacion de 90-150 rpm. No se observaron alter ciones morfologieas en las célula ni en la expresidn de las estructuras antigénicas de M. gallisepticum, La velocidad de agtacin de 120 rpm fue la que dio los mejores resultados. En los bioreactores de 35 L se éemplearon dos crteios de esealamiento para la seleccién de los niveles de agitacin: Potencia de agitacion por unidad de volumen constante y velocidad perfériea del impulsor (PIV y ND), obteniendo los mas altos rendimientos celulaes, que sleanzaron 5.8 x 10!°UFC/ ml, al emplear clriterio de ND. Palabras clave; M, gallisepticum, biorreactores, criterios de cescalamiento, niveles de agitacién, potencia de agitacién, velocidad perifériea del impulsor ‘Magallisepticum, bioreactors, scale up criteria, stirring levels, stirring power, impeller peripheral velocity Key words: * Autora a quien debe diriirse la correspondencia (Recibido: Mayo 30, 2002 [Primer borrador: Noviembre 21,2001), Acep- tado: Junio 23, 2002) INTRODUCCION entro de las enfermedades infecciosas de las aves, la micoplasmosis aviar es una de las que ocasiona ‘mayores transtomos en la avicultura mundial (Levisohn y Kleven, 2000). Su principal agente etidlogico es ‘Mycoplasma gallisepticum, que afecta de forma créni- cay extenuante a pollos, causando un cuadro respirato- rio caracterizado por una alta morbilidad y baja morta- lidad que puede acentuarse por el grado de infeccién secundaria con algunas bacterias y virus. Esta enfer- medad provoca mundialmente davios econémicos sig- nificativos por la incidencia de la micoplasmosis. De ahi la necesidad de desarrollar programas y medidas de control para su erradicacién. Dentro de estos, la vacu- nacién de la masa avicola es imprescindible. En Cuba, se desarrolla una vacuna contra esta enfermedad y para ello se hace necesario (entre otros factores), el desarro- Ilo exitoso de las condiciones de cultivo de M. gallisepticum en condiciones experimentales, Por otra parte, la mayoria de los microorganismos se desarrollan en cultivos incubados estaticos, lo que no asegura homogeneidad en ellos. La altemativa para esto es la proliferacion celular en tanques agitados Mi- les, 1992). Se cultivaron Mycoplasma mycoides y Mycoplasma fecalis en un quimiostato bajo condicio~ nes aerobias y se detecté que a altas velocidades de agitacion se puede inhibir la proliferacién, debido a la accién de los esfuerzos cortantes sobre los filamentos de micoplasma (Miles, 1992). Pérez y col. (1998) de- mostraron que Mycoplasma gallisepticum puede cre- cer en fraseos con una agitacion de 90 rpm, obteniendo mejores rendimientos celulares en comparacién con cultivos estaticos.54 _Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ) vol. 17 nim. 1, 2002 Por tal motivo, el objetivo de este trabajo es el de obtener cultivos de M. gallisepticum empleando reac- tores a escala de banco, caracterizando el cultivo microbiano con el fin de escalar a niveles superiores para la produccién de una vacuna contra la micoplasmosis aviar. MATERIALES Y METODOS Cepa Se empleé una cepa de M. gallisepticum $6 ATCC, do- nada por los laboratorios biolégicos farmacéuticos (LABIOFAM) de Cuba, cultivada en medio Micoplas- ‘ma Base Agar (Oxoide), suplementado con suero equi- no y extracto de levadura segiin lo descrito por Sanchez y col., (1998). Preparacién del inéculo Se realizé a partir de un cultivo del microorganismo en ‘microaerofilia a 37°C por 48 horas con pases sucesivos a medio liquido en frascos agitados por 18-24 horas, segtin lo reportado por Pérez y col. (1998). La concen- traci6n del inéculo fue entre 108-10? UFC/mL y el vo- lumen para la siembra en el reactor fue de 5-10% del, volumen total, Cultivo microbiano en biorreactores de 7 L. Con el objetivo de caracterizar el cultivo de M. gallisepticum wtilizando tanques agitados, primeramente se estudié la influencia del pH en el cultivo celular a una velocidad de agitacién de 90 rpm. Siguiendo el cri- terio de Miles (1992) y Pérez y col. (1998), se emplea- ron diferentes velocidades de agitacién debido a las caracteristicas de los microorganismos de proliferar en condiciones moderadas de agitacion. Los experimentos se realizaron en un reactor tipo AG-CHEMAP-BRAUN (capacidad total de siete litros), con un sistema de agitacin de dos pares de impulsores del tipo Rushton, turbina con cuatro cuchillas y cuatro mamparas (“baffles”), El volumen de trabajo fue de 5 Ly el cultivo fue intermitente (“batch” o por lote), con control de pH (7.840.1) y sin control de éste, con tres niveles de agitacién: 90, 120, 150 rpm, a temperatura constante de 37+0.3°C. El valor de pH se midié con un electrodo de cristal y el oxigeno disuelto, OD, por medio de un electrodo polarogrifico (ambos de Ingold Electrodes Inc, Messtechnik, AG). Las seftales de pH, OD, velocida- des de agitacién y temperatura se recolectaron en una impresora Epson LX-850, acoplada a la unidad de con- trol CMF-300 para la adquisicién de los datos. El aumento celular con respecto al tiempo se deter- min6 por turbidimetria a 530 nm en un fotocolorimetro FC-01, calculando la rapidez. especifica de reproduc- cién celular, m, entre las 4 y 12 horas. El rendimiento celular se determiné por peso seco de las células reco- lectadas al final de la fase logaritmica de “crecimien- to” y por la concentracién celular mediante conteo de colonias por diluciones seriadas (Rodwell y Whitcomb, 1993) en unidades formadoras de colonias UFC/mL. El peso seco, la concentracién celular y la reproduc- ciéa celular de cada cultivo se compararon empleando el estadigrafo t de Student. Para determinar si las condiciones de biorreaccién no afectaron la expresién de tas proteinas antigénicas, se analizaron los polipéptidos de las células completas de M. gallisepticum de cada variante de cultivo por electroforesis en gel de policrilamida y por método inmunolégico conocido en inglés como “immunoblot- ting”, de acuerdo con lo deserito por Rosado (1997), utilizando como mareadores de peso moleculares un juego comercial con pesos moleculares de 120, 68, 55, 41,34 y 24 kDa. Obtencién de cultivos de M. gallisepticum en un biorreactor de 35 L. Partiendo de las condiciones establecidas en el jorreactor de 7 L con las que se obtuvo el desarrollo satisfactorio de M. gallisepticum, se estudié en esta in- vestigacién su cultivo en reactores de 35 L (AG- CHEMAP-BRAUN). Los pardmetros geométricos de ambos biorreactores se muestran en la Tabla 1 Al analizar la Tabla 1, es evidente comprender que el patrén de flujo de ambos biorreactores es diferente, Elreactor de 7 L tiene relaciones geométricas similares a las relaciones geométricas esténdar, por lo que es po- sible suponer que se puede alcanzar un alto grado de uniformidad en él, mientras que en el de 35 L, al contar con 3 impulsores o impelentes tendré tres zonas de flu- jo con un grado de mezcla alto y habra, por supuesto, intereambio entre estas tres zonas. Esto hace que la uniformidad que se pueda alcanzar en este sistema sea menor. Por otra parte, el método conocido como la “Regla del Pulgar” es muy usado en biorreacciones sumergi- das para establecer las condiciones de operacién en una escala superior a partir de los resultados en una escala inferior. En este método, las condiciones de operacién en la escala superior se establecen manteniendo un cri- terio de escalamiento constante, siendo los més utiliza-‘Tabla 1. Parimetros geométricos de los biorreactores Pirameros Bioreactor __geoméricos_ 7 5b ¥, Nolumenefetvo, L 5 0 , Didmtto del tang, m 018 026 He Alara del tangue, oat on ‘H, Ntora del igido, m oat 058 11 Didmero del impelente impalsor ors 0075 Ni, Nero de impelenteso implores 2 3 i, Distancia ete el fond y ol Lerimpeente m 0035 ons 1, Distancia ene el tery 2doimpelete,m 0096 0.100 11 Distanea nite ot 2doy 3eeimpente, = 038 Relacin a= Did 24 a5 Relacin Hid 28 77 .e,Facor de comeceibn 036, a mero de marnparas (“als”) 4 4 dos el coeficiente de transferencia de masa, a potencia por unidad de volumen, la presién parcial de oxigeno y Ja velocidad periférica del impulsor 0 impelente, sien- do este tiltimo el recomendado en el caso de microor- zganismos sensibles a los esfuerzos cortantes. Para de- cidir sobre el criterio que debe utilizarse, es necesario realizar experimentos y basarse en los resultados obte- nidos de ellos. ‘Analizando los resultados obtenidos en el biorreactor de7 Ly las caracteristicas de M. gallisepticum de no contar con pared celular y ser, por tanto, sensibles a los esfiuerzos cortantes, ya que prolifera bajo condiciones de microaerofilia (atin sin aireacidn forzada), se selec~ cionaron para ser probados dos criterios: Potencia por unidad de volumen constante y velocidad periférica del impulsor o impelente constante. 1) Potencia de agitacién por unidad de volumen de li- quiido constante Segiin el procedimiento desarrollado por Aiba y ol (1973) para reactores que no cumplen las relaciones geométricas estandar, en condiciones turbulentas, sin aireacién: Paw @N fe) a Va(adb) (2) ~ (4-0) . sustituyendo las ecuaciones 1 y 2 en la ecuacién 3 y despejando 2, @ Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ) vol. 17 nim. 1, 2002 55 150 rpm 2) Velocidad periférica del impulsor 0 impelente cons- tante va(nd) ) nyd,=m, 4, 6 Despejando 7, de la ecuacién 6 nm, =m A os eb o = 120 1pm Como puede observarse, debido a que no hay simili- tud geométrica entre los biorreactores, cuando se aplicb el riterio de potencia por unidad de volumen constante, la velocidad de agitacién del impelente o impulsor fue 1.25 veces superior a Ia de la escala inferior (ecuacion 4) y en el caso del criterio de velocidad periférica del impelente constante el valor de la velocidad de agita- cidn en el biorreactor de 35 L se igualé al de la escala menor, es decir, 120 rpm (ecuacién 7). ‘Al realizar las corridas con 150 rpm se observé un efecto de vértice muy marcado en el liquido, a pesar de la existencia de mamparas, ademas de que los rendi- mientos expresados en células viables fueron menores a 10° UFC/mL, por lo que se decidié no utilizar este criterio, Sin embargo, a 120 rpm, este efecto no se ob- servo por lo que, las células preparadas como indculo enmatraces Erlenmeyer de 500 mL en fase exponencial de reproduccién entre las 16-20 horas, se transfirieron ‘aun biorreactor de 7 L y se cultivaron a una temperatu- ra de 37°C, pH 7,8, sin aireacién y 120 rpm de agita- cién en un medio Micoplasma-Base, durante 10 horas. Se transfirié un volumen de 3 L de este cultivo a un diorreactor de 35 L con 30L de volumen efectivo. ‘Los experimentos se realizaron por triplicado en cada uno de los casos. RESULTADOS Y DISCUSION Experimentos en el reactor de 7 L Influencia del pH en la reproduccién celular Se obtuvieron en todos los experiments cultivos de M. gallisepticum con resultados satisfactorios. En la Figura 1 se muestra la cinética del “crecimiento” de M. gallisepticum con y sin control de pH con una veloci-86 Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ) vol. 17 nim. 1, 2002 dad de agitacién de 90 rpm. Se observa que en el culti vo sin control de pH, a medida que transcurre el tiempo y las células se reproducen, hay una disminucién de los valores de pH. Entre las 10 a 12 horas de cultivo, el indice de “crecimiento” comienza a declinar entrando «en la fase estacionaria de crecimiento debido entre otros factores, a los cambios substanciales de los valores de pH, a diferencia de los cultivos que si tenian control de PH, donde los indices de crecimiento fueron superiores. a partir de las 8 horas de incubacién con diferencias significativas entre si (p< 0.05). Indo Fe “35 | a ) 42 ++++++4++0 | 02 4 6 8 0 1214 Tiempo ¢h) Sin control de pH: 4=0.196 1/h Con control de pH: 1=0.266 1/h 2 pHlbre | —x— pH controlado Figura 1, Caracteristicas del desarrollo de Mycoplasma gallisepticum con y sin con- trol de pH y perfiles de valores de pH bre y controlado en el medio de cultivo (DO es la densidad éptica) Lin y Kleven, en 1984, obtuvieron resultados simi- lares al cultivar especies de M. gallisepticum y M. synoviae con ajuste de pH. De esta forma lograron al- canzar rendimientos de 43 y 54%, respectivamente. En el caso desarrollado en este trabajo, los rendimientos fueron aproximadamente 60% al final de la fase logaritmica de “crecimiento”, con el empleo de siste- mas de pH controlado. Este comportamiento también fue descrito por Krebs y col. (1989), para otras espe- cies de micoplasmas, por lo que puede afirmarse que el control del pH en el medio influye de forma determi- nante en el desarrollo de M. gallisepticum. Influencia de la agitacién en la reproduceién de M. gallisepticum La agitacién, como es conocido, propicia, por una par- te, que las células se pongan en contacto de forma con- tinua con nuevas moléculas de sustrato y, por otra, una distribucién uniforme de aquellas susiancias téxicas que, como productos finales del metabolismo, son se- gregados al medio y que, al acumularse, inhiben la ‘multiplicacién bacteriana (Miles y col., 1991). Al em- plear diferentes niveles de agitacién con control de pH se obtuvo, con la velocidad de 120 rpm, rendimientos celulares en cuanto a unidades de densidad éptica y cuenta de células, significativamente superiores (p<0.05) a los aleanzados con 90 y 150 rpm a las 10 horas de crecimiento (Figura 2). 0 2 4 6 8 w 12 4 16 Tiempo ch) —S—901pm 40.256 1/h 2 1201pm 20.271 1/h 2-150 1pm 0.270 1/h, Figura 2. Cinética de desarrollo de Mycoplasma gallisepticum a diferentes niveles de agi- taci6n (DO es la densidad éptica)Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ) vol. 17 nim. 1, 2002 57 En la Tabla 2 se muestran los valores de estimacién de biomasa expresados como cuenta de células a las 10 horas de reaccién, Tabla 2, Estimacién de biomasa de Mycoplasma gallisepticum a diferentes niveles de agitacion Vem Cuenta (UFCimL) 90 Lexl0°+0.2a 120 25x 100.76 130 indican 80x10? 08a 3 Letras desigualessigifiean diferencias significativas (p-0.05) URC, unidades formadoras de colonias Los resultados obtenidos a 150 rpm indican que, a esa velocidad de agitacién, el rendimiento celular pu- diera estar afectado por la accién de los esfuerzos cor- tantes sobre las células de M. gallisepticum y/o porque la concentracién de OD existente en el biorreactor (Fi- gura 3) produjo un efecto inhibitorio al ereci 0.2 4 6 8 0 2 4 16 Tiempo (hy BF 1201pm te 1501p. Figura 3. Niveles de oxigeno disuelto, OD, durante Ia fase experimental Es bien conocido que la concentracién de oxigeno puede limitar el metabolismo microbiano produciendo cambios en la respiracién y en las rapideces de repro- duccidn (Simon y Rao, 1994; Visser y col., 1996). En este sentido, Miles y col, (1991) informaron que altas concentraciones de OD inhiben el crecimiento de los micoplasmas, especialmente cuando el HO, es un pro- ducto de la oxidacion. Alanalizar los resultados obtenidos de OD se obser- va que, a 120 rpm, la concentracién de oxigeno disuel- to enel medio a partir de las 12 horas de cultivo no se detecta, por lo que se pudiera pensar que el microorga- nismo se encuentra bajo limitacién de oxigeno. Sin embargo, trabajos realizados previamente por Sanchez y Pérez (1999) empleando este bioreactor demostra- ron que, cuando los cultivos de M. gallisepticum se agitaron a diferentes velocidades de agitacién, entre ellas a la velocidad de 120 rpm y fueron aireados em- pleando flujos de aire de 0.2 a 0.5 vwm, se encontraron niveles de oxigeno disuelto que mostraron inhibicion en el crecimiento del microorganismo. Esto hizo que se plantearan experimentos sin aireacién para evaluar si el oxigeno presente en el medio es suficiente para el desarrollo microbiano. Por otra parte, al analizar el sistema de agitacién empleado en el biorreactor, éste no dio lugar a forma- cién de vortices y la accién de los esfuerzos cortantes no produjo efecios negativos sobre las células de M. gallisepticum. Debe sefialarse, sin embargo, que no fue- ron diferenciados de otros efectos al incrementar la ten- sidn del oxigeno disuelto, en particular a 150 rpm. Cuando se analizaron los polipéptidos de tas células completas de M gallisepticum obtenidas de los diferen- tes niveles de agitacién evaluados, no se observaron diferencias entre los patrones de bandas electroforéticas (Figura 4). Ello coincide con lo reportado por Rosado (1997) al caracterizar la cepa vacunal de M. gallisepti- cum por electroforesis en gel, donde aparecen estas ban- das caracterizando el patrin de corrida de las muestras procesadas. Los resultados del estudio electroforético in- dican que las proteinas en la variante de agitacién de 120 pm, que es la que dio mejores resultados, de 65, 44 y 24 kDa, son especificas de estas especies y que la de 65 kDa es la principal hemaglutinina (Garcia y Kleven, 1994; Rosado, 1997; Pérez y col., 1998). Con estos resultados se pudo comprobar que la expresién de las proteinas en este género generalmente no se afectan por la variacién de las condiciones de cultivo (Weislander y col, 1992). Cultivos de M. gallisepticum en el biorreactor de 35L Los resultados del cultivo de M. gallisepticum en 35 L, empleando la velocidad de agitacién de 120 rpm fue- ron satisfactorios. La cinética muestra que se aleanz6 el final de la fase logaritmica de reproduccién o “creci- miento” a las 12 horas de cultivo, con una velocidad de58 Tecnol. Ciencia Ed. (IMIQ) vol. 17 nim. 1, 2002 0.2130.02 hr!, lo que permitié que la densidad éptica se incrementara hasta alcanzar rendimientos celulares de 0.514+0.015 unidades de DO y cuentas de microor- ganismos de 5.8x10!% 0.43 UFC/mL en los cultivos realizados, rendimientos similares a los obtenidos en la escala de 7 L. Hay que sefialar que a este volumen de trabajo ocurrié una ligera disminueién de la velocidad de “crecimiento” y del rendimiento comparado con los resultados en el biorreactor de 7 L. CONCLUSIONES: Dado los resultados alcanzados, se concluye que se pue- den obtener cultivos de M. gallisepticum en tanques agi- tados correspondiente al nivel de banco, en biorreactores de Ty 35 L de capacidad de trabajo y con altos rendimien- tos celulares de organismos viables (7L: 2.5x10!40.7 y 35 L: 5.8x10!"40,43 UFCimL). El eriterio de velocidad periférica del impelente o impulsor constante sugiere su aplicacién en futuros trabajo de escalamiento. NOMENCLATURA a Relacién =D/d b Relacién Hid D__ Didimetro del impelente o impulsor, m DO Densidad éptica D__ Diimetro del tanque, m di Diémetro del impulsor o impelente, m fe Factor de correccién factor de conversién, kg m / kg sec’ H Altura del fiquido, m Hi Distancia entre el fondo y el 1* impelente, m H, Altura del liquido en el tanque, m H, Altura del tanque, m L} Distancia entre el 1* y 2" impelente, m L, Distancia entre el 2" y 3° impelente, m N _ Niimero de impulsores 0 impelentes Np_ Niimero de potencia Nb Niimero de mamparas (“baffles”) N Velocidad de agitacién del impelente, rpm OD. Oxigeno disuelto P Potencia, W P__ Potencia consumida, W PM. Pesos moleculares, kDa Re Nimero de Reynolds V- Volumen efectivo, L Vt Volumen del biorreactor, L siMBOLOS GRIEGOS m _ rapidez.o velocidad especifica de reproduccién 0 “crecimiento” (h"!) rt Densidad de la suspensién, kg/m* n Velocidad periférica del impelente, m/s, sul DICES 1 Escalade 7L 2 Escalade 35 L BIBLIOGRAFIA, Aiba, S., Humphrey, A. E.y Millis, N.1973. Biochemical engineering. Ed. Academic Press. P. 123. Nueva York, NY, EEUUA Garcia, M. y Kleven, S. H. 1994. Expression of Mycoplasma sallisepticum F-strin utface epitope, Avlan Dis, 38:494-500. Krebs, B, Schutz, M, Fisher, M, Sommer, Gy Kirchho,H. 1989. pH- Controlled continuous cultivation of mycoplasms. Appl. Environ Microbiol, $5:852-855. Levitohn, S. y Kleven, SH. 2000, Avian mycoplasmosis. Rev. Sei Technoly AN(2)425-442. Lin, M.¥. y Kleven, S. H. 1984. Improving the M.gallisepicum and M. synoviae antigen yield by readjusting the pl ofthe growth medium to the original alkaline tae. Avian Dis, 28(1):266-272. 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